張 燕

(楚雄技師學(xué)院，云南 楚雄 675000)

橘紅枇杷片成份為化橘紅、陳皮、枇杷葉、桔梗、紫蘇子、甘草六味藥材，采用現(xiàn)代制劑工藝技術(shù)精心研制而成，具有止咳嗽、祛除咳嗽時(shí)痰多的功效。橘紅枇杷片收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》[1]中藥成方制劑第四冊(標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3-B-0866-91)，無含量測定項(xiàng)。本文以柚皮苷為指標(biāo)性成分，采用HPLC法測定控制橘紅枇杷片含量，該法簡便、快速、準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

Agilent HP-1100型高效液相色譜儀(帶四元泵，DAD檢測器，自動進(jìn)樣裝置，在線真空脫氣設(shè)備，智能控制柱溫箱及HP化學(xué)工作站)。

乙腈為色譜純，所用水為二次重蒸餾水，其余試劑試藥均為分析純。

含量測定指標(biāo)成分柚皮苷對照品購于中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用(采用面積歸一法，進(jìn)行對照品純度檢查，純度為100%)；橘紅枇杷片為市售產(chǎn)品。

2 色譜條件

參考《中華人民共和國藥典》2020年版一部化橘紅項(xiàng)下柚皮苷的含量測定方法[2]，取柚皮苷對照品溶液進(jìn)行紫外掃描，在 283 nm 處有最大吸收，故選擇 283 nm 為檢測波長。

Agilent ZORAX-C18色譜柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸 (體積比20∶80)為流動相；檢測波長 283 nm；流動相流速設(shè)定為 1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL[3]；色譜柱溫度 25 ℃。

3 溶液的配制

3.1 對照品(柚皮苷)溶液的配制

取柚皮苷對照品，放入減壓干燥器干燥至恒重，取適量，精密稱定其質(zhì)量，加入甲醇，配制成 55 μg/mL 的溶液作為對照品溶液。

3.2 樣品溶液(橘紅枇杷片)的配制

取待測樣品(橘紅枇杷片)10片，去除表面包裹的糖衣，放入研缽中，用研缽研成粉末。取樣約 1 g，精密稱定其質(zhì)量，放入帶玻璃塞的 100 mL 錐形瓶中，用移液管精密加入甲醇 25 mL，塞上玻璃塞，稱定整個(gè)錐形瓶的質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。把錐形瓶放入電熱套中，調(diào)節(jié)合適的功率加熱回流 1 h，取出放冷至室溫，再次稱定具塞錐形瓶質(zhì)量。加入甲醇補(bǔ)足在加熱回流過程中減失的質(zhì)量，蓋上玻璃塞，輕輕搖動錐形瓶使其混合均勻，用有機(jī)相微孔濾膜進(jìn)行濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

4 方法與結(jié)果

4.1 系統(tǒng)適用性

將對照品溶液與樣品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣。圖1為對照品(柚皮苷)色譜圖，圖2為樣品色譜圖。結(jié)果顯示，柚皮苷色譜峰的理論塔板數(shù)大于2000。

圖1 對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

4.2 提取方法的考察

取本品10片，除去糖衣，研細(xì)，制成2份樣品。分別取約 1 g，精密稱定其質(zhì)量，放入帶玻璃塞的錐形瓶中。用移液管精密加入甲醇 25 mL，塞上玻璃塞，稱定整個(gè)錐形瓶的質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。1份超聲處理 60 min，1份加熱回流提取 60 min[4]，取出放冷至室溫，再次稱定具塞錐形瓶質(zhì)量。加入甲醇補(bǔ)足在加熱回流過程中減失的質(zhì)量，輕輕搖動錐形瓶使其混合均勻，用有機(jī)相微孔濾膜進(jìn)行濾過，放入自動進(jìn)樣器進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。

表1 提取方法考察表

從表1看出，樣品溶液選用加熱回流提取方法進(jìn)行處理，樣品溶液中柚皮苷含量明顯較采用超聲提取方法進(jìn)行樣品處理的含量高，故選擇回流提取對樣品進(jìn)行處理，同時(shí)根據(jù)檢測結(jié)果確定樣品取樣量為 1 g。

4.3 線性關(guān)系

精密稱取柚皮苷對照品適量，加甲醇分別制成7.237、 14.47、28.95、57.90、86.85、115.8 μg/mL 的溶液作為樣品溶液。放置自動進(jìn)樣器上，設(shè)置進(jìn)樣量 10 μL，按確定的色譜條件進(jìn)行檢測，以柚皮苷對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對照品峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得回歸方程，Y=14.52x+3.98，r=0.99994，表明所用對照品柚皮苷在0.072～1.16 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

4.4 精密度試驗(yàn)

取制備好的對照品溶液，按含量測定的方法連續(xù)進(jìn)樣6針 (進(jìn)樣量 10 μL)，以峰面積計(jì)算，RSD為0.50% (n=6)。

4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號樣品照含量測定方法項(xiàng)下樣品溶液的制備方法同時(shí)制成6份供試液，進(jìn)樣測定，以峰面積計(jì)算含量，RSD為0.85% (n=6)。

4.6 中間精密度試驗(yàn)

取樣品，在同一試驗(yàn)室由不同人員按含量測定項(xiàng)下的方法試驗(yàn)，使用不同儀器進(jìn)行含量測定，以峰面積計(jì)算含量，RSD為0.63% (n=6)。

4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品照樣品測定項(xiàng)下的方法制成樣品溶液，按照上述色譜條件分別于0、4、8、12、24 h 進(jìn)樣檢測，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣品在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.62% (n=5)。

4.8 回收率試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用加樣回收法，精密稱取柚皮苷對照品，加入適量甲醇溶解后，制備得到每 1 mL 含對照品柚皮苷 600 μg 的溶液。用移液管精密量取對照品溶液 1 mL，放置于六個(gè)錐形瓶中，蒸干；取已測知含量的樣品，研細(xì)，取約 0.5 g，精密稱定，分別稱取6份樣品，放入帶有玻璃塞的錐形瓶中；按3.2項(xiàng)制得樣品溶液后，分別放入液相色譜自動進(jìn)樣器上，進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明平均回收率為98.68%，RSD為0.77%(n=6)。詳見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

4.9 陰性及空白對照試驗(yàn)

按照橘紅枇杷片處方中各藥材配比，除去化橘紅藥材，其余藥材按制備工藝自配陰性樣品，并按本文3.2項(xiàng)確定的樣品溶液制備方法，進(jìn)行陰性對照樣品溶液的制備，進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖(圖3為橘紅枇杷片陰性對照色譜圖，圖4為空白對照色譜圖)。結(jié)果表明陰性及空白無干擾。

圖3 橘紅枇杷片陰性對照色譜圖

圖4 空白對照色譜圖

5 樣品測定

取5批市售橘紅枇杷，分別按上述方法操作。在上述色譜條件下，樣品溶液與對照品溶液分別進(jìn)樣 10 μL，測定，記錄色譜圖。以外標(biāo)法測定計(jì)算樣品中有效成分(柚皮苷)的含量，結(jié)果見表3。

表3 橘紅枇杷片中柚皮苷的含量測定結(jié)果(n=5)

6 結(jié)語

橘紅枇杷片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)的是《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第四冊(質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3-B-0866-91)，無含量測定項(xiàng)?；偌t是方中君藥，始于明萬歷年間的《高州府志物產(chǎn)》。《本草拾遺》中記載，化痰止咳、風(fēng)寒咳嗽為橘紅的首要功效，無論寒咳或干咳，服用橘紅均可見效。柚皮苷是化橘紅中的指標(biāo)性成分，用其控制橘紅枇杷片質(zhì)量合理可行。

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，能快速準(zhǔn)確地測定橘紅枇杷片中柚皮苷的含量，方法簡便、可靠，為橘紅枇杷片的質(zhì)量監(jiān)控和生產(chǎn)控制提供了保證。