郝培娜

(鄭州工業(yè)應用技術(shù)學院，河南 鄭州 451100)

近年來，隨著人們生活質(zhì)量的提高，在保障物質(zhì)條件充裕的同時人們更加重視養(yǎng)生，尤其是糖尿病患者。對于糖尿病患者來說，服用降糖類藥物是一個普遍現(xiàn)象。因為降糖藥在臨床上的使用十分廣泛，其用量、效果也得到了廣大醫(yī)生、患者和媒體的認可。但從近年來的情況來看，降糖藥所帶來的副作用問題引起了人們注意[1]。許多降糖類藥物具有潛在的健康風險。例如，增加體重、高血糖及胰島素抵抗等問題發(fā)生的風險[2]；部分患者服用市面上的降糖藥及降糖保健品容易引起低血糖情況，嚴重的甚至還會威脅患者的生命。此外，在使用部分降糖藥進行治療后，一些患者會出現(xiàn)低血糖反應[3-4]。由于部分中成藥和保健品中含有降糖類化學藥品，因此對該類藥物進行定量檢測顯得十分必要。本次針對現(xiàn)有檢測方法不準確的問題，提出了一種新的定量檢測方法，希望可通過本研究為糖尿病患者后續(xù)治療、選取藥物提供文獻參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈，色譜分析純，山東滿堂紅新材料有限公司；甲醇，色譜分析純，湖南宏建化工有限公司；格列喹酮，分析純，上海源葉生物科技有限公司；格列本脲，分析純，中國藥品生物制品檢定所；格列齊特，分析純，中國藥品生物制品檢定所；格列美脲，分析純，中國藥品生物制品檢定所；甲苯磺丁脲，分析純，湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ROHS2.0型高效液相色譜儀，深圳市譜賽斯科技有限公司；島津 228-63621-01型二極管陣列檢測器，北京博耐奇光電技術(shù)有限公司；i-Process 6910型數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，上海暉望工貿(mào)有限公司；MACRK-UP20-40L型超純水器，上海佰博康儀器有限公司；JC-QX-7.5L型超聲波清洗器，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本前處理

1)對照溶劑制備

首先，完成降糖類藥物對照溶液的制備。稱取藥品，精確到 0.01 mg。分別稱取 22.86 mg 五種降糖類中成藥及保健品常添加的化學組分，放入同一量杯中。量杯規(guī)格為 100 mL。加入甲醇，超聲溶解并定容，完成對照溶劑的制備[5-6]。吸取 2 mL 標準對照溶劑，倒入 25 mL 量瓶中，甲醇溶液定容，得到標準的對照品溶液。

2)供試品溶劑制備

選取鄭州市各縣市、區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局需要市場監(jiān)督抽查的宣傳具有降血糖作用的片劑、硬膠囊劑和顆粒劑的各種類型、規(guī)格的產(chǎn)品作為研究對象。將患者一次口服劑量的藥物研磨后添加 20 mL 三氯甲烷，設(shè)置超聲波清洗機功率參數(shù)為 800 W，頻率為 100 kHz，對藥品進行超聲處理 10 min，過濾后將濾液抽干，向殘留物中添加甲醇和三氯甲烷各 1 mL 以達到溶解目的，以此來完成試驗溶液的制備[7]。

1.3.2 液相色譜條件

本實驗選取Poroshell120EC-C18柱作為色譜柱(100 mm×φ2.1 mm，2.7 μm)。色譜柱溫度 30 ℃，5 mmol/L 升的醋酸銨水和乙腈為流動相，流速 0.3 mL/min，將進樣量 5 μL[8]。

1.3.3 質(zhì)譜條件

本實驗采用電噴射電離離子源開展實驗，正、負離子同時掃描。檢測模式MRM，毛細管溫度 350 ℃；鞘氣流速 12 L/min[9]；輔助氣空氣流速 3 L/min；噴射電壓在2500～3000 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

對本次實驗選取的五種不同的降糖類化學組分進行分析，線性回歸法測定峰面積和質(zhì)量濃度，完成相關(guān)系數(shù)和線性方程的確定。在5個試驗對象中分別加入4個不同的陰性樣品，完成S/N=3條件下檢出限和S/N=10條件下定量限的確定。表1給出了各個成分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限。

表1 線性范圍、檢出限及定量限分析

格列喹酮、格列本脲、格列齊特、格列美脲、甲苯磺丁脲五種藥物的的線性范圍在10～1900 ng/mL 之間，相關(guān)線性相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.99。檢測其組分的定量限和檢出限，其結(jié)果分別為0.0010～0.0050 mg/kg 和0.0014～0.0090 mg/kg。

2.2 供試樣品測定

選取鄭州市各區(qū)市藥品監(jiān)督管理局提供的7種、28批市面上售賣的降糖類中成藥及保健食品作為樣品，采用方法進行檢測，結(jié)果如表2所示。

表2 陽性樣品檢測結(jié)果

由表2可知，一共檢出7份陽性藥品(格列本脲、格列美脲、瑞格列奈、格列齊特)。為驗證所提方法檢測的準確性，分別采用HPLC-DAD方法和HPLC-MS/MS分析方法對其進行了充分檢驗，檢驗了方法的有效性。結(jié)果表明，二次檢驗結(jié)果與設(shè)計方法的檢驗結(jié)果相符，準確率為100%，說明該方法能準確地檢測到降糖類中成藥及保健藥品中的成分，并且檢測結(jié)果基本相符，沒有任何錯誤判斷。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

本文采用 AgilentXDB-C18和 Agilent ZorbaxSB-C18兩種液相色譜柱進行試驗，探究不同體積分數(shù)、不同配比的乙腈、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和磷酸等溶劑對梯度洗脫效果的影響。結(jié)果表明，在 AgilentZorbaxSB-C18作色譜柱的背景下，利用體積分數(shù)為0.02%的磷酸溶液(B)和乙腈(A)溶液進行梯度洗脫，可以較最好地分離出雜質(zhì)。

3.2 樣品提取溶劑的篩選

將待檢測試樣均勻地混合后，稱量 1 g 樣品，然后將其放入 50 mL 的離心管中，分別加入 10 mL 甲醇水溶液和體積分數(shù)為0.1%的甲酸-甲醇溶液，將其與丙酮溶液旋渦攪拌，攪拌時間不低于 2 min。攪拌完成后，5 min 離心，轉(zhuǎn)速 7500 r/min。離心完成后，將 5 mL 上清液放入 20 mL 標準管中，放入 40 ℃ 環(huán)境下用氮氣吹干。殘余物用 1.0 mL 的甲醇進行溶解，用規(guī)格為 0.22 μm 的有機濾膜進行過濾，最終用 HPLC進行分析。結(jié)果顯示，甲醇為最佳萃取條件，回收率均超過80%；采用其余溶液的萃取效果比較好，但其回收率仍然不理想，都小于80%。因此，以甲醇為萃取溶劑可實現(xiàn)5種不同的降糖成分檢測，應用效果更好。

3.3 固相萃取柱的選擇

為優(yōu)化檢測質(zhì)量，對 MCX、 SCX、NH2、EVNI-CARB/LC-NH2、C18等不同色譜柱的應用效果進行對比。在使用之前，先用甲醇 5 mL、二氯甲烷 5 mL 進行萃取柱活化，然后用 5 mL 甲醇-二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷 5 mL、二氯甲烷 2 mL 完成洗小柱，然后抽空，用 5 mL 甲醇-二氯烷-冰乙酸進行洗脫。稱量 1 g 藥劑放入離心管中，向其加入甲醇 10 mL 后攪拌，攪拌時長 2 min，30 min 超聲波，取 5 mL 上清液放入離心管中以 7500 r/min 的速度離心，在 40 ℃ 下用氮氣吹干并溶解殘留物，之后再加 1.8 mL 二氯甲烷用固相萃取柱進行洗脫。經(jīng)過 0.22 μm 的有機濾膜后用高效液相色譜法進行分析，得到的結(jié)果如圖1所示。

圖1 固相萃取柱的凈化效果

研究發(fā)現(xiàn)，MCX柱在純化過程中，某些藥物的洗脫效果不明顯，回收率僅為50%；而 SCX柱對5種藥劑的洗脫效果同樣不明顯，且回收率小于50%。由此可證明，在本文選定的五種降糖類保健品常添加組分，如甲基磺丁脲、格列本脲等的定量檢測過程中，MCX和 SCX都不適合。C18柱具有良好的清除作用，而且工藝簡單、回收率、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，但當降糖藥物添加茶物質(zhì)作為保健品時由于其內(nèi)部含有雜質(zhì)，其凈化作用不大。而NH2柱的純化可很好地去除添加茶物質(zhì)作為降糖保健品的雜質(zhì)，且回收率高。因此，可選用C18固相萃取柱檢測降糖茶之類的保健品，用NH2固相萃取法檢測降糖茶中的化學成分。

4 結(jié)束語

本實驗研究了五種常用降糖類化學藥品，并對其含量進行了測定。該方法主要從三個方面對常見方法進行了優(yōu)化，對其色譜實驗中選用的色譜柱進行優(yōu)化選取，對其梯度洗脫條件進行進一步優(yōu)化，以甲醇為萃取溶劑，選用C18固相萃取柱檢測除降糖茶之外的藥品，用NH2固相萃取法檢測降糖茶中的化學成分，由此完成其條件優(yōu)化，利用實驗證明其先進性。該方法具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對具有降糖效果的中成藥及保健品進行部分藥物組分的定量檢測，可以滿足對該類藥物含量分析的要求，具有一定應用價值。