張彥昕，柴貝貝，石玉節(jié)，李海利

(1.鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450000)

露水草 (CyanotisarachnoideaC.B.Clark)又名珍珠露水草，一般指蛛絲毛藍(lán)耳草，為鴨趾草科 (Commelinaceae)多年生宿根性草本，主要分布于印度、 越南等東南亞地區(qū)。 我國主要分布于大陸南部及臺灣等地，生長于海拔 2700 m 以下的溪邊、 山谷濕地或者濕潤巖石上。 露水草通常每年八月下旬至十月下旬采收 (洗凈，鮮用或曬干)，以全草入藥，味甘、 性平，可用于治療風(fēng)濕痹痛、 虛熱不退、 咽喉腫痛、 蛇蟲咬傷等。

β-蛻皮甾酮(β-ecdysone)又稱20-羥基蛻皮甾酮(20-Hydroxy ecdysterone)、露水草素，是露水草中主要活性物質(zhì)之一，用于防治害蟲及提高蝦蟹產(chǎn)量?，F(xiàn)代藥理研究表明，β-蛻皮甾酮可以上調(diào)mRNA的合成速率，促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成[1]；治療風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎[2]；調(diào)節(jié)糖代謝、促進(jìn)脂類代謝[3]；免疫調(diào)節(jié)[4]；影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5]；促進(jìn)分化人體表皮細(xì)胞，合成人體中膠原蛋白[6-7]；心血管保護(hù)作用；等等[8-9]。因此β-蛻皮甾酮廣泛用于水產(chǎn)業(yè)、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)，主要劑型有針劑、膏劑、片劑等。

近幾年，學(xué)者或工業(yè)上對露水草的研究主要集中在生物活性及藥理作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)條件，優(yōu)化提取工藝，利用HPLC測定最優(yōu)工藝露水草提取物中β-蛻皮甾酮的含量，研究其體外抗氧化能力，為露水草的生產(chǎn)和開發(fā)利用提供參考。

1 試劑與儀器

露水草(云南)，經(jīng)河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院付運(yùn)星鑒定為鴨趾草科露水草干燥根莖。β-蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)品(北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)、屈臣氏蒸餾水、 乙醇(分析純)、甲醇、乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

電子天平(Quintix125d-1CN)，油浴磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司 DZKW-C)，高效液相色譜儀(安捷倫1260 美國)，時(shí)間分辨熒光酶標(biāo)儀(TECAN)。

ABTS試劑盒和DPPH試劑盒，均采購于南京建成生物工程研究所。

2 研究方法

2.1 樣品前處理

取適量干燥露水草根，為適應(yīng)生產(chǎn)型企業(yè)的提取方式，只剪碎露水草根，備用。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 溫浸提取

參考傳統(tǒng)工廠生產(chǎn)提取露水草的工藝，本研究選擇 60、80、100 ℃ 溫浸提取，料液比1 g∶20 mL，共提取兩次，2 h/次，提取時(shí)用保鮮膜封住瓶口，考察溫度對β-蛻皮甾酮的提取影響。提取續(xù)濾液合并濃縮，加入85%乙醇進(jìn)行醇沉 12 h，取醇沉上清液真空濃縮至干，得到干燥提取物，避光保存。

2.2.2 加熱回流提取

回流提取通過加熱和冷卻來分離有效成分，可以大大增加提取率。 本研究分別考察了 60、 80、 100 ℃ 回流提取，料液比1 g∶20 mL，共提取兩次，2 h/次。 提取續(xù)濾液合并濃縮，加入85%乙醇進(jìn)行醇沉 12 h，取醇沉上清液真空濃縮至干，得到干燥提取物，避光保存。

2.3 高效液相檢測

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液配制

精密稱定β-蛻皮甾酮 0.00100 g 于 10 mL 棕色容量瓶，甲醇定容刻度，得質(zhì)量濃度為 0.100 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.3.2 供試品溶液配制

精密稱定各個(gè)樣品的干燥提取物至 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到樣品溶液，每個(gè)樣品檢測三次。為方便記錄，對樣品進(jìn)行編號，如表1所示。

表1 提取物樣品及編號

2.3.3 儀器色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；色譜條件：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=28∶14∶58，等度洗脫 15 min，柱溫30±2 ℃，波長 243 nm，流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL。

2.4 體外抗氧化研究

1)DPPH法檢測露水草提取物的抗氧化能力。根據(jù)待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量，配制適當(dāng)?shù)?200 μmoL/L DPPH 儲備液。同時(shí)用無水乙醇配置不同質(zhì)量濃度的Y6樣品溶液和 Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(終質(zhì)量濃度分別為 0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mg/mL)。每個(gè)樣品分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并在空白對照孔、標(biāo)準(zhǔn)曲線孔和樣品孔中分別加入 20 μL 無水乙醇溶液、不同質(zhì)量濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，隨后在每孔加入 180 μL DPPH儲備液，室溫靜置孵育 30 min 后，測定其在λ=517 nm 處的吸光度。

DPPH 自由基清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。其中，Y6樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值記為A1；空白對照孔的吸光度值記為A0。

2)ABTS法檢測露水草提取物的抗氧化能力。ABTS溶液和氧化劑溶液體積比1∶1配制適量的ABTS工作母液，避光放置 16 h 后，使用80%乙醇將其稀釋成ABTS工作液，同時(shí)配置不同濃度的樣品溶液和Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液 (終質(zhì)量濃度分別為 0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，空白對照孔、標(biāo)準(zhǔn)曲線孔和樣品孔中分別加入 10 μL 80%乙醇溶液、不同質(zhì)量濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液。每孔加入適量ABTS工作液，室溫靜置孵育 5 min，測定其在λ=405 nm 處的吸光度。

ABTS自由基清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。其中，Y6樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值記為A1；空白對照孔的吸光度值記為A0。

3 研究結(jié)果

3.1 提取方式的選擇

根據(jù)峰面積，計(jì)算不同提取方式下β-蛻皮甾酮的含量。由表2可知，選擇加熱回流提取的含量高于溫浸提取的。

表2 各樣品出峰時(shí)間、峰面積及 β-蛻皮甾酮含量

3.2 提取溫度的選擇

根據(jù)峰面積，計(jì)算不同提取溫度下β-蛻皮甾酮的含量。由表2可知，100 ℃ 溫度提取時(shí)有效物質(zhì)含量最高。

3.3 高效液相色譜方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

1)專屬性考察結(jié)果。取對照品溶液、Y6樣品，按上述方法制備供試品溶液、陰性對照品溶液。按照2.3色譜條件下進(jìn)樣，每針進(jìn)樣三次，記錄色譜圖(圖1)。由圖1可知，陰性對照品色譜在對照品出峰位置上無干擾峰，即本實(shí)驗(yàn)條件下對測定干擾較小，系統(tǒng)誤差較小。

(a)陰性對照色譜圖

(c)樣品色譜圖

2)精密度考察結(jié)果。取Y6樣品，按上述方法制備供試品溶液。在2.3色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣7次，記錄并分析色譜峰，如表3所示。由表3可知，每次進(jìn)樣色譜峰相對保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。

表3 精密度測定結(jié)果

3)重復(fù)性考察結(jié)果。取Y6樣品，按上述方法制備供試品溶液7份。在2.3色譜條件下進(jìn)樣，記錄并分析色譜峰，如表4所示。由表4看出，每次進(jìn)樣色譜峰相對保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性測定結(jié)果

4)穩(wěn)定性考察結(jié)果。取Y6樣品，按上述方法制備供試品溶液。在2.3項(xiàng)色譜條件下，在制備后分別于 0、2、4、8、12、24 h、48 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄分析色譜峰，如表5所示。由表5看出，每次進(jìn)樣色譜峰相對保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性測定結(jié)果

5)線性考察結(jié)果。 取標(biāo)準(zhǔn)儲備液精密稀釋至質(zhì)量濃度為 0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取上述質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與 0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液各 10 μL 進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣三次，結(jié)果見圖2。

圖2 β-蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

6)加標(biāo)回收率考察結(jié)果。精密稱取已知含量的Y6樣品6份(每份0.0010 g)，再分別精密加入對照品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品含量為樣品含量的80%、100%、120%，超聲混勻，濾過。按2.3色譜條件測定，每份進(jìn)樣3次，結(jié)果見表6。

表6 加標(biāo)回收率測定結(jié)果

3.4 體外抗氧化結(jié)果

如圖3所示，露水草提取物對于DPPH自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度升高而增加，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到 0.8 mg/mL 以上時(shí)，抗氧化能力趨于穩(wěn)定，此時(shí)對DPPH自由基的清除率達(dá)到85%；同樣，ABTS抗氧化能力檢測結(jié)果顯示，露水草提取物對ABTS的自由基也表現(xiàn)出較好的清除能力，為95%左右。

(a)DPPH自由基清除結(jié)果圖

(b)ABTS自由基清除結(jié)果圖

4 結(jié)論

露水草在各行業(yè)中應(yīng)用廣泛，但對其提取工藝研究的不多。為結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)與利用，本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察了露水草中β-蛻皮甾酮的最優(yōu)提取方式。在以水為溶劑，100 ℃ 加熱回流提取條件下，β-蛻皮甾酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到28%左右。在本實(shí)驗(yàn)建立完整的液相檢測條件下，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9999，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率的RSD均小于2%。通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)得出，露水草提取物可以有效清除自由基，為露水草以后的應(yīng)用提供參考。