張冬梅，闕慧卿，李 唯

(福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院 福建省醫(yī)學(xué)測試重點實驗室，福建 福州 350001)

有充足氧氣供給的腫瘤細胞會快速異常增殖，然而，快速異常增殖所需要的高耗氧量又會導(dǎo)致氧氣供應(yīng)不足。氧氣供應(yīng)不足導(dǎo)致腫瘤缺氧環(huán)境的形成[1]。缺氧可以通過激活腫瘤細胞內(nèi)相關(guān)基因和蛋白改變，促進腫瘤的發(fā)展，使腫瘤產(chǎn)生耐藥性方面[2-3]。因此缺氧作為腫瘤的主要特征，是藥物研發(fā)所面臨的問題[4-6]。

雷公藤內(nèi)酯醇在1972年從雷公藤中提取出來，是一個結(jié)構(gòu)獨特的二萜類化合物[7]。雷公藤內(nèi)酯醇具有廣泛的很強的抗腫瘤、抗炎、抗免疫活性。雷公藤內(nèi)酯醇除了顯示出很強的抗腫瘤活性外，還顯示出廣譜的抗腫瘤活性，在體內(nèi)外對多種腫瘤有效[8-10]。就多因素引起的腫瘤耐藥性來說，雷公藤內(nèi)酯醇可以作用于多個信號通路，具有抗腫瘤耐藥性的特點[11]。然而，雷公藤內(nèi)酯醇的選擇性差、毒性大，導(dǎo)致在臨床上的應(yīng)用受到限制。為了達到降低雷公藤內(nèi)酯醇毒性的目的，將前藥策略應(yīng)用在雷公藤內(nèi)酯醇上應(yīng)該是一個有效的解決方法[12-16]。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

實驗儀器包括：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型號：DHG-9070A)、分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：LE104E/02)、定時恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠有限公司，型號：90-2)、薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海，型號：B-220)、循環(huán)冷卻器(上海-恒科學(xué)儀器有限公司，型號：BWR-03A)、核磁共振儀(德國布魯克、型號：Ascend 400)、循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司，型號：SHZ-D )、EYEAL高溫反應(yīng)槽(JAPAN，型號：PS-1000)。

實驗試劑包括：雷公藤內(nèi)酯醇(福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院)、阿霉素(羅恩試劑，97%)、吉它西濱(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，99%)、2-硝基咪唑(羅恩試劑，97%)、3-溴丙酸乙酯(羅恩試劑，98%)、碘化鉀(羅恩試劑，AR)、碳酸鉀(羅恩試劑，AR)、N，N-二甲基甲酰胺(上海麥克林生化科技股份有限公司，AR)、甲醇(羅恩試劑，AR)、氫氧化鋰(羅恩試劑，98%)、二氯甲烷(羅恩試劑，AR)、乙酸乙酯(羅恩試劑，AR)、N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，99%)、4-二甲氨基吡啶(羅恩試劑，99%)。

1.2 化合物1、Dox1和Gem1的合成

化合物1、Dox1和Gem1的合成路線如圖1所示。

圖1 化合物1、Dox1和Gem1的合成路線圖

1.3 實驗操作

1.3.1 3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯(1-1)的合成

將2-硝基咪唑 (0.018 moL，2 g)、 3-溴丙酸乙酯 (0.027 moL，3.46 mL)、 碘化鉀 (0.009 moL，1.49 g) 和適量碳酸鉀裝入 25 mL 圓底燒瓶中，加入干燥N，N-二甲基甲酰胺8 mL，加熱 100 ℃，攪拌 2 h。反應(yīng)結(jié)束，后處理，濕法過柱 [V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=100∶5]，得3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯，收率為54%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.65(1H，d，J=0.96)，7.16(1H，d，J=0.96)，4.63(2H，t，J=7.2)，3.6(3H，s)，2.95(2H，t，J=7.2)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C8H11NaN4O3，236.0750；Found，236.0750。

1.3.2 3- (2-硝基-1H-咪唑-1-基) 丙酸 (1-2)的合成

將3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯溶解于甲醇-水[V(甲醇)∶V(水)=5∶1]溶液中，緩慢加入氫氧化鋰2.59 mL，將反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。真空除去有機溶劑，用濃鹽酸調(diào)pH值至偏酸性，得3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸白色沉淀。過濾，烘干得白色固體，收率為80%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.65(1H，d，J=0.96)，7.16(1H，d，J=0.96)，4.58(2H，t，J=6.9)，2.85(2H，t，J=6.9)；HRMS (ESI)calcd for[M+Na]+：C6H7NaN4O3，208.0437；Found，208.0436。

1.3.3 目標產(chǎn)物(1)的合成

取雷公藤甲素(0.1 mmoL，50 mg)溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺2 mL中，攪拌條件下加入N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺(0.1 mmoL，20.6 mg)和催化量4-二甲氨基吡啶，攪拌30 min。將3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺2 mL中，加入到溶有雷公藤甲素的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，繼續(xù)攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，后處理，濕法過柱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶2]，得到目標產(chǎn)物，收率為60%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.60(1H，d，J=7.56)，7.14(1H，d，J=7.56)，4.91-4.78(2H，m)，4.31-4.30(1H，m)，4.21(2H，t，J=6.48)，3.87(1H，d，J=5.16)，3.40(1H，d，J=6)，2.97(1H，d，J=1.32)，2.73(2H，t，J=6.48)，2.69-2.67(1H，m)，2.34(1H，q，J=6.84)，2.20-2.13(2H，m)，2.00-1.96(m，1H)，1.89-1.84(1H，m)，1.41-1.38(1H，m)，1.28-1.23(1H，m)，0.96(3H，s)，0.91(3H，d，J=6.84)，0.79(3H，d，J=6.84)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C26H29NaN9O3，550.1904；Found，550.1907。

1.3.4 Gem1的合成

方法同目標產(chǎn)物(1)的合成方法，吉西他濱、3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸、N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺和催化量4-二甲氨基吡啶，獲得最終產(chǎn)物，收率為60%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：11.10(1H，s)，8.27(1H，d，J=7.56)，7.61(1H，s)，7.21(1H，d，J=7.56)，7.16(1H，s)，6.33(1H，d，J=5.94)，6.17(1H，t，J=7.02)，5.31(1H，s)，4.67(2H，t，J=6.48)，4.20-4.18(1H，m)，3.91-3.89(1H，m)，3.81(1H，d，J=12.36)，3.66(1H，d，J=12.36)，3.04(2H，t，J=6.48)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C15H16NaF2N6O7，453.1049；Found，453.1050。

1.3.5 Dox1的合成

方法同目標產(chǎn)物(1)的合成方法，多柔比星、3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸、N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺和催化量4-二甲氨基吡啶，獲得最終產(chǎn)物，收率為45%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：14.02(1H，s)，13.24(1H，s)，9.30(1H，s)，7.77-7.75(1H，m)，7.67-7.66(1H，m)，7.42(1H，d，J=7.56)，7.39-7.38(1H，m)，7.26(1H，d，J=7.56)，5.47(1H，s)，5.37(1H，s)，4.91(1H，s)，4.80(1H，s)，4.69(2H，s)，4.07-4.05(1H，m)，4.01(2H，t，J=6.48)，3.9(3H，s)，3.55-3.51(1H，m)，3.38-3.36(1H，m)，3.26-3.23(1H，m)，3.14-3.11 (1H，m)，2.66(2H，t，J=6.48)，2.27-2.24(1H，m)，2.01-1.98 (1H，m)，1.93-1.90 (1H，m)，1.69-1.64 (1H，m)，1.56-1.53(1H，m)，1.07(3H，s)；HRMS (ESI)calcd for[M+Na]+：C33H34NaN14O4，733.2072；Found，733.2073。

2 結(jié)果

雷公藤內(nèi)酯醇是一個具有獨特結(jié)構(gòu)特征的三環(huán)二萜類化合物。確證結(jié)構(gòu)中存在著三個關(guān)鍵官能團(一個α，β-不飽和內(nèi)酯酮，三個環(huán)氧環(huán)，三個甲基)，再加上確證結(jié)構(gòu)中其他氫信號在氫譜中的大致分布和氫的個數(shù)與標準的雷公藤內(nèi)酯醇氫譜一致，就能確證此結(jié)構(gòu)為雷公藤內(nèi)酯醇。目標化合物是雷公藤內(nèi)酯醇14-OH酯化產(chǎn)物。雷公藤內(nèi)酯醇14-OH的信號消失，存在3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸酯的信號，再加上確證了雷公藤內(nèi)酯醇的母核結(jié)構(gòu)，就能確證目標化合物的結(jié)構(gòu)。目標化合物的結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)。 4.91至4.78存在多重裂縫的2個氫信號說明α，β-不飽和內(nèi)酯酮中的活性亞甲基的存在，表明α，β-不飽和內(nèi)酯酮的存在。4.31-4.30(1H，m)，3.87(1H，d，J=5.16)，3.40(1H，d，J=6)，2.97(1H，d，J=1.32)這幾個信號表明三個環(huán)氧環(huán)的存在。0.96(3H，s)，0.91(3H，d，J=6.84)，0.79(3H，d，J=6.84)說明三個甲基的存在。其余譜圖氫與標準譜圖氫的分布類似，而且氫的個數(shù)相等，說明雷公藤內(nèi)酯醇的母核結(jié)構(gòu)正確。加之7.60(1H，d，J=7.56)，7.14(1H，d，J=7.56)兩個硝基咪唑環(huán)上面的低場氫信號和兩對脂肪氫的信號，說明14-OH上連接著3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸酯。綜上確證了目標化合物的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

本文合成了雷公藤內(nèi)酯醇乏氧激活前藥，并對所合成的目標化合物進行了結(jié)構(gòu)確證。首先以2-硝基咪唑和具有強刺激性氣味的3-溴丙酸乙酯為起始原料，通過親核取代和水解兩步反應(yīng)，合成了3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸。起先用酸在常溫下水解酯鍵，但是當反應(yīng)結(jié)束之后，用薄層層析板監(jiān)測反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)完全，有雜質(zhì)產(chǎn)生。因此使用堿在常溫下水解酯鍵?？s合反應(yīng)采用傳統(tǒng)的Steglich酯化反應(yīng)，但是分析純的N，N-二甲基甲酰胺會很大程度的影響反應(yīng)的進行。最后使用無水的N，N-二甲基甲酰胺，使得反應(yīng)的收率提高。此外，還合成了兩個對照品Gem1和Dox1，為后續(xù)的抗腫瘤研究提供了有效的支持。