侯婷婷，劉渝鈳，楊勝男，孫萌萌，胡海鵬，王廣途，王晗光，吳賀君，蒲 祥

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，四川 雅安 625014)

有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)是農(nóng)業(yè)院校面向化學(xué)、藥學(xué)、生科、食品等眾多專(zhuān)業(yè)開(kāi)設(shè)的基礎(chǔ)課?，F(xiàn)有有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材內(nèi)容側(cè)重于培養(yǎng)學(xué)生掌握基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)原理與基本操作技能，合成物質(zhì)包括天然化合物、藥用有機(jī)化合物以及有機(jī)基礎(chǔ)原料，如香豆素[1]、阿司匹林[2]和乙酸乙酯[3]等物質(zhì)的制備。然而，藥用或食用的天然活性成分的綜合性制備實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目仍偏少，且實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)與科研和生產(chǎn)實(shí)踐之間缺乏有效聯(lián)系。這不利于化學(xué)、藥學(xué)、生科、食品等相關(guān)專(zhuān)業(yè)學(xué)生在有機(jī)化學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程學(xué)習(xí)過(guò)程中培養(yǎng)從事有機(jī)化學(xué)研究或生產(chǎn)的從業(yè)興趣[4]。黃酮化合物是一類(lèi)重要的天然化合物，隨化學(xué)化工行業(yè)發(fā)展人們對(duì)其研究也逐步深入，其中的花青素作為抗氧化的熱門(mén)分子，其相關(guān)合成實(shí)驗(yàn)在有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中仍較少。因此，有必要有計(jì)劃地將花青素的合成實(shí)驗(yàn)融入有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程。

1 實(shí)驗(yàn)背景

花青素是一種普遍存在于植物液泡中的水溶性色素，廣泛分布在植物的花朵、葉片和果實(shí)之中。它具有A-C-B典型三環(huán)結(jié)構(gòu)，且B環(huán)上的羥基與生物活性密切相關(guān)，以致于其具有抗氧化、延緩衰老、抗癌、抗心血管疾病等作用[5]。2016年，Sui等[6]人發(fā)現(xiàn)，花青素的顏色會(huì)隨著熱處理從紅色漸變至橙色。由于具有顏色變化效應(yīng)、無(wú)毒無(wú)害且有益于人體健康等眾多優(yōu)點(diǎn)，使得花青素可作為食用色素[7-8]。

花青素具有抗氧化活性。抗氧化性是多酚類(lèi)化合物的共同特點(diǎn)，即向活性自由基提供一個(gè)氫原子，而自身由于結(jié)構(gòu)的高度離域，可使生成的自由基比之前的結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。Plaza等[9]人對(duì)類(lèi)黃酮化合物抗氧化能力研究的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，取代基跟抗氧化性能密切相關(guān)。A環(huán)上5位和8位、7位和8位的成對(duì)羥基取代，均能對(duì)抗氧化能力做出有益貢獻(xiàn)；5位和7位的同時(shí)取代，對(duì)活性沒(méi)有影響；7位單獨(dú)取代沒(méi)有貢獻(xiàn)；6位單獨(dú)羥基取代反而會(huì)降低抗氧化活性；但5位的單獨(dú)取代可提高活性。B環(huán)上鄰位多羥基結(jié)構(gòu)比羥基單取代結(jié)構(gòu)抗氧化活性更強(qiáng)；C環(huán)上3位羥基為抗氧化活性必需基團(tuán)?；ㄇ嗨氐腃環(huán)結(jié)構(gòu)高度離域，且pH變化時(shí)具有形成共振結(jié)構(gòu)能力，所以能生成穩(wěn)定的自由基，展現(xiàn)高抗氧化活性，與槲皮素具有活性相當(dāng)?shù)目寡趸芰9]。

在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)上，花青素大多是從藍(lán)莓、黑枸杞、葡萄和玉米等中提取，并通過(guò)分離純化制備。天然花青素的應(yīng)用前景廣泛，但價(jià)格昂貴，因此尋找一種低成本、合成簡(jiǎn)便的方法極具實(shí)用價(jià)值。矢車(chē)菊素是花青素中含量相對(duì)豐富的一種，其結(jié)構(gòu)上有多個(gè)羥基。羥基保護(hù)常見(jiàn)的方法是甲基化保護(hù)法，采用的甲基化試劑通常為硫酸二甲酯和碘甲烷[10]，但二者均為致癌物質(zhì)。2006年Kondo等[11]人采用TBSCl作為羥基保護(hù)試劑，描述了酚類(lèi)TBS基團(tuán)在酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定，類(lèi)黃酮等多酚類(lèi)物質(zhì)的TBS保護(hù)基在酸性條件下很容易脫保護(hù)。TBSCl使用安全，但活性較低，通過(guò)加入催化劑DMAP可改變這一不足，還可以得到與甲基化保護(hù)法相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率，并且免去了脫除保護(hù)基步驟。該法酸化的同時(shí)可脫保護(hù)，與其它方法相比可減少損失，因此本實(shí)驗(yàn)選用TBS保護(hù)羥基的方法。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

掌握矢車(chē)菊素的三步合成法，通過(guò)形成硅醚以進(jìn)行羥基保護(hù)，隨后將4位羰基還原為亞甲基，再加入三氟乙酸形成佯鹽并脫除保護(hù)基；掌握有機(jī)相洗滌、氫化鋁鋰后處理以及萃取純化等后處理方法；熟悉顏色變化現(xiàn)象與矢車(chē)菊素結(jié)構(gòu)的聯(lián)系，利用顏色變化來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程；學(xué)會(huì)利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用和根據(jù)紫外特征對(duì)矢車(chē)菊素進(jìn)行定性鑒別。

3 實(shí)驗(yàn)原理

該實(shí)驗(yàn)以槲皮素為原料，依次通過(guò)三步反應(yīng)制備矢車(chē)菊素：采用TBS保護(hù)方法對(duì)羥基進(jìn)行保護(hù)，利用四氫鋁鋰對(duì)4位羰基進(jìn)行還原，在甲醇溶劑和三氟乙酸中進(jìn)行成鹽并脫除TBS保護(hù)基。合成路線如圖1所示。

圖1 矢車(chē)菊素合成路線

羥基保護(hù)方法有成酯、成醚(烷基醚、硅醚)。成酯法后續(xù)脫除保護(hù)基需要在堿性條件下水解，而產(chǎn)物在堿性條件下有開(kāi)環(huán)分解的風(fēng)險(xiǎn)，故不適用。成烷基醚，若在芐位，脫除可采用氫解，鄰二羥基結(jié)構(gòu)可采用形成縮酮的方法進(jìn)行成醚保護(hù)。甲基醚常用試劑為硫酸二甲酯和碘甲烷[12]，前者為危化試劑，致癌致畸，后者易揮發(fā)，具有肝臟毒性，不適用于本科實(shí)驗(yàn)。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)底物結(jié)構(gòu)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作，選擇采用TBSCl進(jìn)行羥基保護(hù)。

針對(duì)羰基還原為亞甲基，有利用鋅汞齊和鹽酸酸性條件下的克萊門(mén)森還原、氫氧化鉀和肼的堿性條件下進(jìn)行的黃鳴龍還原、利用二硫醇形成硫縮酮然后進(jìn)行氫解的中性條件下的還原。相較于這些條件，直接利用氫化鋁鋰進(jìn)行還原不失為一種直接簡(jiǎn)便的方法。氫化鋁鋰是一種強(qiáng)的金屬化合物還原試劑，利用負(fù)氫離子進(jìn)攻羰基碳，鋁離子絡(luò)合氧，進(jìn)而拔除氧原子，通過(guò)控制LiAlH4用量，可將底物還原成亞甲基[12]。機(jī)理如圖2所示。

圖2 LiAlH4還原羰基的機(jī)理

4 試劑與儀器

槲皮素、叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、四氫呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、咪唑購(gòu)自上海阿拉丁。AR級(jí)無(wú)水碳酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、氫氧化鈉、乙酸乙酯、石油醚、正己烷購(gòu)自成都科隆化學(xué)。三氟乙酸(TFA)、氫化鋁鋰(LAH)購(gòu)自河南北方偉業(yè)計(jì)量。薄層色譜硅膠板GF254購(gòu)自青島海洋化工。

DF-101FS集熱式恒溫磁力攪拌器和SHZ-D(III)循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器)、F80A制冰機(jī)(斯科茨曼制冰系統(tǒng)有限公司)、FA2004C電子天平(上海佑科)、DHG-9101恒溫干燥箱(上海三發(fā))、ZF-1三用紫外分析儀(江蘇海門(mén)其林貝爾)、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(愛(ài)來(lái)寶生物)、8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)、Agilent Infinity Lab液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫)。

5 實(shí)驗(yàn)操作步驟

5.1 羥基保護(hù)反應(yīng)

稱(chēng)取槲皮素 (5 mmol)1.6914 g、 咪唑 (70 mmol)4.767 g，TBSCl(70 mmol)10.55 g，加入5%～10%當(dāng)量的DMAP，用 100 mL DMF溶解，于室溫(25 ℃)下攪拌4～5 h。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到 250 mL 分液漏斗中，加入 40 mL 的正己烷，震蕩搖勻后，加入 40 mL 的水搖勻洗滌，靜置分液，去除水相，再次加入 40 mL 水重復(fù)洗滌3次以除去DMF。加入 40 mL 飽和Na2CO3水溶液，洗滌3次除去DMAP。加入 40 mL 飽和NaCl溶液洗滌有機(jī)相3次。轉(zhuǎn)移有機(jī)相至燒杯，向其中加入適量無(wú)水硫酸鎂，攪拌后抽濾搜集濾液，減壓濃縮得到產(chǎn)物1(棕黃色)。

5.2 羰基還原反應(yīng)

向裝有產(chǎn)物1的圓底燒瓶中投入攪拌子，加入 8 mL THF和 2 mL 的 1 mol/100 mL LiAlH4四氫呋喃溶液，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，25 ℃ 下反應(yīng) 30 min(呈紅棕色)。冰浴條件下，進(jìn)行反應(yīng)的淬滅，向圓底燒瓶中加入 20 mL THF稀釋?zhuān)偌尤?0.76 mL(與LAH質(zhì)量相等)水、0.76 mL 15%氫氧化鈉溶液，再加入 2.28 mL(三倍LAH的質(zhì)量)的水，然后升溫至 25 ℃，并且恒溫?cái)嚢?15 min。再加入無(wú)水硫酸鎂，直至加入的無(wú)水硫酸鎂不再結(jié)塊，攪拌 15 min。抽濾，取濾液進(jìn)行減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到產(chǎn)物2(紅棕色)。

5.3 成鹽與脫保護(hù)反應(yīng)

向裝有產(chǎn)物2的圓底燒瓶中加入正己烷 40 mL，全部溶解，加入 20 mL 甲醇(結(jié)合TBS基團(tuán)從而脫除保護(hù))、TFA(25 mmol)2.595 mL 室溫下攪拌過(guò)夜，脫除保護(hù)基。通過(guò)觀察上層正己烷的顏色判斷反應(yīng)進(jìn)行的程度，當(dāng)上層由紅色變?yōu)辄S色即可。取甲醇層，減壓蒸發(fā)除溶劑，得產(chǎn)品(磚紅色)。實(shí)驗(yàn)流程與典型實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象如圖3所示。

圖3 實(shí)驗(yàn)流程與典型實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象圖

6 結(jié)果與討論

6.1 保護(hù)反應(yīng)試劑用量及反應(yīng)時(shí)間的確定

6.1.1 羥基保護(hù)反應(yīng)時(shí)間、溫度及用量的確定

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，篩選反應(yīng)時(shí)間(0.5～6 h)，每半小時(shí)檢測(cè)1次。通過(guò)TLC發(fā)現(xiàn)，在4、5、6 h 時(shí)，各物質(zhì)點(diǎn)無(wú)明顯差別，確定羥基保護(hù)反應(yīng)時(shí)間為 4 h。反應(yīng)溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(15～45 ℃)表明，溫度過(guò)高不利于反應(yīng)進(jìn)行，因?yàn)門(mén)BSCl對(duì)羥基進(jìn)行保護(hù)后產(chǎn)生的HCl迅速被DMAP、咪唑兩種堿所中和，體系放出大量的熱。溫度過(guò)低也不利于反應(yīng)進(jìn)行，因?yàn)檫_(dá)不到反應(yīng)進(jìn)行所需的活化能。溫度為 25 ℃ 與 35 ℃ 時(shí)，TLC比較無(wú)明顯差異，因此最終確定的反應(yīng)最佳溫度為 25 ℃。通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)不同量的TBSCl(5～15 eq)進(jìn)行羥基保護(hù)反應(yīng)時(shí)間為 4 h 時(shí)的雜質(zhì)點(diǎn)狀況，得出最佳TBSCl用量為14當(dāng)量，即 10.5504 g。TBSCl易吸潮水解為T(mén)BSOH，溶劑及空氣中的水分均易使其變質(zhì)。

6.1.2 脫除保護(hù)基反應(yīng)試劑用量及選擇

脫除TBS保護(hù)基機(jī)理如圖4所示。

圖4 脫除TBS保護(hù)基機(jī)理

在酸作用下，TBSOR1 (中間產(chǎn)物2)由硅醚轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)BSOR (叔丁基二甲基硅酯)，再在甲醇作用下形成硅甲醚并產(chǎn)生酸。 加入酸時(shí)體系立即變?yōu)樽霞t色，而后攪拌脫保護(hù)過(guò)程中顏色無(wú)明顯變化。 得出反應(yīng)是先進(jìn)行酸化形成佯鹽，再進(jìn)行脫保護(hù)，TBS對(duì)顏色無(wú)明顯影響，即對(duì)吸光度影響小。 TFA用量設(shè)置為底物槲皮素量的1當(dāng)量、 5當(dāng)量、 10當(dāng)量、 20當(dāng)量，即TFA用量為 0.143 mL、0.72 mL、1.43 mL、2.85 mL。當(dāng)使用TFA量為 0.143 mL 時(shí)，攪拌 12 h 后靜置，得到分界模糊且上層正己烷仍為紅色體系。而使用 0.72 mL、1.43 mL、2.85 mL 的TFA時(shí)，分別在 9 h、8 h、8 h 得到分界明顯且上層正己烷為亮黃色，下層為紫紅色體系。因此確定最佳TFA用量為 1.43 mL。三氟甲磺酸、三氟乙酸、乙酸三者酸性由大到小，通過(guò)觀察體系由均相變?yōu)樯蠈訛榱咙S色，下層為紫紅色的時(shí)間。發(fā)現(xiàn)三氟甲磺酸具有最強(qiáng)的脫保護(hù)能力，所需時(shí)間約為 5 h。而乙酸在 12 h 以后仍無(wú)明顯分層現(xiàn)象。確定最佳的脫保護(hù)試劑為三氟甲磺酸。

6.2 結(jié)構(gòu)分析和表征

6.2.1 中間產(chǎn)物1的FT-IR

圖5 底物槲皮素(A)和產(chǎn)物1(B)的紅外譜圖

6.2.2 產(chǎn)物3的LC-MS及UV

首先對(duì)制備得到的終產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物在正離子模式下相對(duì)分子質(zhì)量為288，與矢車(chē)菊素相對(duì)分子質(zhì)量一致(圖6A)。同時(shí)進(jìn)行終產(chǎn)物紫外吸收光譜分析，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為 520 nm(圖6B)，由此表明成功制備矢車(chē)菊素。

圖6 目標(biāo)產(chǎn)物EIC圖(m/z 288)與紫外吸收?qǐng)D

6.2.3 矢車(chē)菊素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在矢車(chē)菊素純化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其不穩(wěn)定，因此進(jìn)行了pH(1～11)和溫度(-20～65 ℃)穩(wěn)定性測(cè)試。結(jié)果表明(圖7)，隨pH增加，吸光度降低明顯，即pH增大降解速度加快，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，矢車(chē)菊素降解程度變大，顏色明顯從紅色變?yōu)樽攸S色。時(shí)間為 0 h 時(shí)，顏色均為紅色，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間放置后，僅pH為1的溶液呈紅色，pH為3呈粉紅色，pH為5和7的呈棕黃色，pH為9和11的呈無(wú)色，說(shuō)明其在pH為1時(shí)最為穩(wěn)定。不同溫度條件下矢車(chē)菊素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，隨測(cè)試溫度逐漸升高，產(chǎn)物降解程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提高，說(shuō)明矢車(chē)菊素對(duì)溫度敏感，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選得出最佳的儲(chǔ)存溫度為 -20 ℃。

圖7 目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

7 結(jié)語(yǔ)

本文探究了矢車(chē)菊素的一種半合成方法，以槲皮素為底物，TBSCl進(jìn)行羥基保護(hù)，LiAlH4進(jìn)行4位羰基還原，最后用TFA脫保護(hù)并形成佯鹽，同時(shí)探索了關(guān)鍵反應(yīng)試劑的用量、反應(yīng)時(shí)間以及合適的后處理途徑。實(shí)驗(yàn)共耗時(shí)14～15 h，矢車(chē)菊素終產(chǎn)率可達(dá)51.74%。本實(shí)驗(yàn)所選用的試劑與原料價(jià)格比較便宜、毒性低且易于購(gòu)買(mǎi)。實(shí)驗(yàn)操作包括萃取、分液及濃縮等有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作，同時(shí)涉及磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外和紅外吸收光譜儀等常用儀器的使用，即可鞏固學(xué)生對(duì)黃酮類(lèi)成分理化性質(zhì)的認(rèn)知，又可掌握食用色素矢車(chē)菊素的合成方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程顏色變化現(xiàn)象明顯，易于通過(guò)肉眼觀察判斷反應(yīng)進(jìn)程，可有效激發(fā)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣。因此本實(shí)驗(yàn)適于開(kāi)設(shè)為高等農(nóng)業(yè)院校的有機(jī)化學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)。