高雅婷 邱對鑫 高 磊 石開虎

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（江蘇南京 210028）

2 南京中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（江蘇南京 210023）

1 Wnt/β-catenin 信號通路

1.1 概述

Wnt基因最初來源于小鼠乳腺癌中的整合酶-1和果蠅的無翅基因，由于這兩個基因和功能蛋白相似，研究者將其合并為Wnt基因［1］。Wnt信號通路包括非經(jīng)典通路和經(jīng)典通路，Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路中的經(jīng)典通路，Wnt/β-catenin信號通路是一種進化上高度保守的信號通路，對胚胎發(fā)育、器官和神經(jīng)發(fā)育、損傷修復(fù)及組織穩(wěn)態(tài)等至關(guān)重要［2-3］。Wnt分泌的糖蛋白充當(dāng)配體并調(diào)節(jié)下游效應(yīng)β-catenin蛋白［4］。Wnt/β-catenin信號通路包括四個部分：細胞外信號、細胞膜段、細胞質(zhì)段和細胞核段。細胞外信號主要由Wnt蛋白介導(dǎo)，包括Wnt3a、Wnt1、Wnt5a等。細胞膜片段主要含有Wnt受體Frizzled（特異性卷曲跨膜受體Frizzled蛋白）和共同受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5 and 6，LRP 5/6）。細胞質(zhì)段主要包括β-catenin、細胞質(zhì)折疊蛋白（dishevelled，DVL）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）、軸蛋白（axis inhibition protein 2，Axin）、腺瘤性結(jié)腸息肉蛋白（adenomatous polyposis coli protein，APC）和酪蛋白激酶I（casein kinase 1，CK1）。細胞核段主要包括移位到細胞核的β-catenin、T細胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴細胞增強因子（lymphoid enhancing factor，LEF）家族成員和β-catenin蛋白下游靶基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和細胞-骨髓細胞瘤病病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）等［3］。一般情況下β-catenin蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子的TCF/LEF相互作用來激活靶基因從而控制細胞增殖［5］。Wnt信號通路在人體組織中通常為沉默，但在損傷后重新激活。Wnt信號通路沉默時，分泌的卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled-related protein，SFRP）與Wnt結(jié)合，細胞質(zhì)中的β-catenin 被 Axin、CK1、APC、GSK-3β組成的復(fù)合物不斷降解。當(dāng)組織受到損傷時，Wnt信號通路被激活，Wnt與卷曲跨膜受體Frizzled及其共同受體 LRP5/6 結(jié)合，使這種復(fù)合物的下游蛋白DVL被磷酸化，抑制GSK-3β和CK1的活性，并固定Axin，破壞復(fù)合物的形成，從而抑制β-catenin降解，β-catenin就可以穩(wěn)定化聚集并轉(zhuǎn)移到細胞核中與TCF/LEF相互作用，調(diào)節(jié)基因表達。見圖1。

圖1 Wnt/β-catenin 通路示意圖

1.2 Wnt/β-catenin與多種纖維化疾病相關(guān)

近年來的研究表明，Wnt/β-catenin的信息通路在各類纖維化病變，如肺纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、腎纖維化以及心肌纖維化的發(fā)病過程與病程進展中起著主要作用［6-7］。如肺纖維化，有研究者通過讓小鼠吸入聚苯乙烯微塑料激活氧化應(yīng)激和Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)小鼠肺纖維化［8］。Lei等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin激動劑SKL2001降低脂肪酸結(jié)合蛋白5（fatty acid binding protein 5，F(xiàn)ABP5）敲低在轉(zhuǎn)移生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激下對肺外源成纖維細胞的抗纖維化作用。在急性腎損傷中，短暫被激活的Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)修復(fù)和再生，而持續(xù)（不受控制）激活的Wnt/β-catenin信號通路促進與慢性腎臟病相關(guān)的腎臟纖維化、足細胞損傷和礦物質(zhì)骨病［10］。此外，Wnt/β-catenin信號通路在皮膚纖維化中也有重要作用，Jussila等［11］證明了跨膜二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）是一種Wnt/β-catenin響應(yīng)基因和纖維化轉(zhuǎn)化的功能介質(zhì)，此研究將Wnt/DPP4軸確定為細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)和真皮脂肪減少的關(guān)鍵驅(qū)動因素，為減輕組織纖維化的發(fā)生和逆轉(zhuǎn)提供了作用途徑。其中尤為重要的是其對心肌纖維化的作用。

2 心肌纖維化在心血管疾病中的作用

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是影響全球死亡率的首要因素。在中國，CVD一直是導(dǎo)致中國城鄉(xiāng)居民死亡的最主要因素，但近年來由于老齡化問題加重，CVD相關(guān)死亡率也持續(xù)升高，已嚴重威脅民眾的生命安全。據(jù)研究顯示，2019年農(nóng)村和城市CVD死亡人數(shù)分別占總死亡人數(shù)的46.74%和44.26%，每5例死亡者中就有2例死于CVD［12］。在CVD中，明確其病理機制，研究疾病靶點并開發(fā)新型治療藥物尤為重要。大多數(shù)CVD與心肌纖維化相關(guān)，它幾乎代表了所有類型心臟損傷的最終病理表現(xiàn)［13］。心肌纖維化的特征在于細胞外基質(zhì)的過度沉積和心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）的積聚。CFs是成人心臟中的主要細胞類型，是細胞外基質(zhì)的主要生產(chǎn)者，并且顯著促進心肌纖維化［14］。在心臟受到損傷后，CFs 被激活并隨后分化為肌成纖維細胞，后者是病理性重構(gòu)的主要作用細胞。肌成纖維細胞具有增殖和分泌特性，有助于細胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)和膠原沉積［15］。

3 Wnt/β-catenin 在心肌纖維化相關(guān)CVD 中的作用

大量研究結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號通路與心肌梗死、心房顫動、心力衰竭等多種CVD相關(guān)，異常的Wnt/β-catenin信號通路激活會導(dǎo)致心功能不全的發(fā)生和進展，在各種CVD中Wnt/β-catenin信號通路與心肌纖維化的關(guān)系最為密切。

3.1 心肌梗死

急性心肌梗死通常由血栓阻塞動脈或旁路移植物引起，其特征是流向心肌的血流突然減少，最終導(dǎo)致心力衰竭和死亡［16］。Wnt/β-catenin信號通路參與心肌梗死后細胞凋亡、心肌纖維化和毛細血管增生的病理過程，影響心肌梗死患者的預(yù)后［17］。Liu等［18］通過體內(nèi)實驗證明了沙庫巴曲/纈沙坦通過抑制Wnt/β-catenin通路減輕CFs中的膠原沉積從而減輕心肌梗死后小鼠的心肌纖維化并改善心功能。Zhang等［19］發(fā)現(xiàn)，富含脯氨酸/精氨酸的末端富含亮氨酸的重復(fù)蛋白（proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein，PRELP）的過度表達增加了梗死的大小和間質(zhì)纖維化面積，位于PRELP下游的Wnt/β-catenin通路分子的表達在PRELP過表達組中比在心肌梗死組中增加更多。最近的一項研究也同樣發(fā)現(xiàn)，心肌梗死與Wnt/β-catenin通路密切相關(guān)，并證實XAV93（一種 Wnt/β-catenin信號通路阻滯劑）可以通過促進β-catenin的降解，成功阻斷心肌梗死后心肌細胞中的Wnt/β-catenin通路激活［20］。近期一項研究將急性心肌梗死 PCI患者分為兩組，研究組術(shù)中使用替羅非班，對照組不使用替羅非班，通過對比觀察到治療后兩組Wnt/β-catenin表達水平較治療前均明顯降低，研究組Wnt/β-catenin表達水平顯著低于對照組，這表明了替羅非班對急性心肌梗死的治療作用可能是通過對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用［21］。Hind等［22］采用GSK-3β全身性基因敲除小鼠模型，在心肌梗死后GSK-3β全身性基因敲除的小鼠心臟中纖維化反應(yīng)增多，GSK-3β通過直接調(diào)節(jié)經(jīng)典TGF-β1-SMAD-3信號通路發(fā)揮在梗死心臟中心肌纖維化重塑的核心作用。這些數(shù)據(jù)表明，GSK-3β是受損心臟中心肌纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，維持GSK-3β處于活性狀態(tài)，尤其是在心肌梗死后的重塑階段，是抑制纖維化的一種治療選擇，從而限制不良的心肌重塑。目前在臨床上，已經(jīng)提出了靶向GSK-3β家族的藥理學(xué)抑制劑，可用于特定的疾病，但需警惕此類抑制劑引起的不良纖維化重塑，特別是在心肌梗死后長期使用的情況下。

3.2 心房顫動

心房顫動是臨床疾病中常見的心律失常之一。心房纖維化是心房顫動發(fā)展和維持的重要病理生理機制。Lv等［23］通過構(gòu)建大鼠心房顫動模型，miR-27b-3p過表達組心房顫動的發(fā)生率明顯降低，持續(xù)時間縮短，心房纖維化的程度也隨之減輕，心房縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達增加，降低通路相關(guān)蛋白Wnt3a以及磷酸化的β-catenin的表達，同時也降低了纖維狀膠原蛋白I（collagen I，COL-I）、纖維狀膠原蛋白III（collagen III，COL-III）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等纖維化相關(guān)蛋白的表達，從而證實在心房顫動心肌纖維化過程中，miR-27b-3p可以通過靶向Wnt3a調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路來減輕心肌纖維化。Zhu 等［24］通過體外熒光素酶測定證實，Axin1是miR-124-3p的靶點，在miR-124-3p過表達的CFs中，Axin1的表達減少，而β-catenin、COL-I和α-SMA的表達增加，這些結(jié)果表明，miR-124-3p通過Axin1調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進成纖維細胞活化和增殖，從而減輕心房顫動心肌纖維化。Yang等［25］證實了三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）促進心房成纖維細胞的增殖和遷移，TMAO還通過激活β-catenin途徑促進心房成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化、遷移和膠原分泌，外源性Wnt3a和TMAO協(xié)同促進心房成纖維細胞中β-catenin途徑的活化和表型轉(zhuǎn)化。

3.3 心力衰竭和心臟肥大

心力衰竭綜合征是由于心臟結(jié)構(gòu)、功能、節(jié)律或傳導(dǎo)異常引起的，其中病理性的心臟肥大與心肌細胞死亡增加和纖維化重塑有關(guān)，其特征是收縮和舒張功能降低，常進展為心力衰竭。Yang等［26］采用橫主動脈收縮（transverse aortic coarctation，TAC）誘導(dǎo)心力衰竭的小鼠模型，通過檢測發(fā)現(xiàn)心臟組織中的Wnt1、Wnt3a、活性β-catenin和總β-catenin蛋白的表達升高，并且出現(xiàn)小鼠心臟纖維化，說明Wnt/β-catenin在TAC后的小鼠心臟中被激活，用ICG-001（Wnt通路抑制劑）治療后降低了TAC誘導(dǎo)的心臟中心肌纖維化及Wnt通路相關(guān)蛋白的表達，在原代心肌細胞和CFs的體外模型中也同樣觀察到這種變化，因此證明了阻斷Wnt/β-catenin信號通路能夠預(yù)防心力衰竭，減輕心肌纖維化，改善心臟損傷。Methatham等［27］同樣使用TAC小鼠模型，Masson染色顯示TAC小鼠心臟組織中的間質(zhì)纖維化增加，ICG001處理后明顯減少，心臟中β-catenin在TAC小鼠中表達增加，但在ICG001處理的TAC小鼠中被顯著抑制，這些實驗結(jié)果表明，ICG001可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路減少心肌纖維化來預(yù)防和改善心臟肥大和心力衰竭。Ahn等［28］發(fā)現(xiàn)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7（protein arginine methyltransferase 7，PRMT7）基因敲除小鼠會引起心臟肥大和心肌纖維化，而PRMT7缺失的心臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，與Wnt信號通路相關(guān)的基因表達譜發(fā)生了改變，通過機制研究表明，PRMT7通過精氨酸殘基93處β-catenin的甲基化來抑制Wnt信號通路，這對于調(diào)節(jié)β-catenin的活性控制心臟肥大和心肌纖維化至關(guān)重要。

3.4 其他心肌纖維化及相關(guān)CVD

炎癥性擴張型心肌病是一種獨特的疾病，在被定義為心肌炎癥所導(dǎo)致的心功能障礙。心肌纖維化是擴張型心肌病心功能不全的重要原因，纖維化導(dǎo)致心壁順應(yīng)性降低，為了維持心功能，心臟不斷擴大，CFs對細胞外基質(zhì)蛋白的過度沉積在擴張型心肌病的病理過程中起著關(guān)鍵作用［29］。國外學(xué)者用分泌的sFRP2沉默細胞外Wnt表達或用Wnt-C59抑制Wnt分泌，阻止TGF-β介導(dǎo)的炎性前體和CFs向致病性肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化；用ICG-001抑制TCF/β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或β-catenin的遺傳缺失也可以阻止TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細胞形成；還發(fā)現(xiàn)了阻斷Smad非依賴性TGF-β激活激酶1（TCF-β-activated kinase 1，TAK1）通路可以完全消除TGF-β誘導(dǎo)的Wnt分泌，同樣阻止了CFs的形成；最后在心肌炎患者的心臟標(biāo)本中Wnt-1/Wnt-5a的水平升高也證實了Wnt軸對于心肌纖維化的關(guān)鍵作用［30］。這表明抑制Wnt分泌或TCF/β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可以減輕心肌炎后心肌纖維化的程度，在組織重塑期間Wnt分泌確實對心肌纖維化的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用，由TAK 1介導(dǎo)的Wnt蛋白快速分泌是人和小鼠心肌炎中TGF-β介導(dǎo)的肌成纖維細胞分化和心肌纖維化進展的一種新的下游關(guān)鍵機制。這些結(jié)果都充分說明了細胞外Wnt或Wnt/β-catenin的藥理學(xué)靶向可能是一種有效的治療方法，可以防止病理性肌成纖維細胞的積聚，使心肌纖維化減輕，這種抗纖維化治療能防止炎癥性心肌病患者的疾病進展。Edyta等［31］使用人CFs模型闡明了TGF-β、Wnt/β-catenin和IL-11之間的相互作用，并提出了一種控制心肌纖維化的新機制，表明Wnt/β-catenin通路的特異性激活促進了TGF-β誘導(dǎo)的CFs到肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)變。成纖維細胞和心肌細胞之間的Wnt依賴性相互作用在心臟損傷和修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用。表達Wnt1的心外膜細胞在心臟受到損傷后以β-catenin依賴的方式發(fā)生上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以適應(yīng)成纖維細胞的分化結(jié)局［32］。在人類心臟中，心臟內(nèi)源性抗衰老物質(zhì)Klotho的丟失，包括調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝在內(nèi)的多效性作用，促進TGF-β1信號傳導(dǎo)，并通過上調(diào)Wnt信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致明顯的心肌纖維化［33］。小鼠TAC導(dǎo)致的心臟壓力超負荷會激活導(dǎo)致CFs中的Wnt/β-catenin信號通路，導(dǎo)致心肌纖維化，β-catenin是心臟損傷后CFs中ECM基因表達所必需的。在TAC后β-catenin缺失的CFs中，間質(zhì)纖維化顯著減少，保護了心臟功能［34］。在缺乏DVL-1的小鼠中，阻斷Wnt信號可以減輕壓力超負荷誘導(dǎo)的心肌肥大和間質(zhì)纖維化的發(fā)生［35］。總之，這些研究說明Wnt/β-catenin信號通路通過從心外膜和內(nèi)皮細胞的分化過渡到間質(zhì)狀態(tài)來響應(yīng)損傷，從而促進心肌纖維化。Nayakanti等［36］發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路分子在肺動脈高壓患者的右心室和右心室超負荷動物模型中表達上調(diào)，Wnt/β-catenin信號通路是通過激活FOS樣抗原1（FOS-like antigen1，F(xiàn)OSL1）和FOS樣抗原2（FOS-like antigen 2，F(xiàn)OSL2）基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致右心室的重構(gòu)，抑制β-catenin、FOSL1/2或WNT3a會使右心室成纖維細胞顯著降低膠原合成和其他重塑基因，研究中使用LGKK-974抑制Wnt信號，減輕了纖維化和心肌肥厚，從而改善了肺動脈高壓和右心室功能。經(jīng)歷EMT的內(nèi)皮細胞促進心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展，CD146是一種在細胞外基質(zhì)中高度表達的黏附分子，Zhang等發(fā)現(xiàn)［37］CD146敲低上調(diào)了Wnt通路相關(guān)基因，并增加了β-catenin的蛋白質(zhì)水平和核易位，由此證明了CD146的上調(diào)可能對內(nèi)皮細胞EMT和心肌纖維化起到保護作用。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，抑制Wnt/β-catenin信號通路能夠減少心肌纖維化，Wnt/β-catenin信號通路在心肌纖維化中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。雖然迄今為止專注于Wnt/β-catenin靶向治療的臨床研究大多局限于癌癥方面，但目前的實驗研究也能夠證明Wnt/β-catenin信號通路在CVD，尤其是心肌纖維化中具有重要作用，因此值得在未來進一步開發(fā)Wnt/β-catenin信號通路的靶向藥物。希望后續(xù)的研究者能夠?qū)⒉煌瑒游锬Ｐ椭械亩嗉毎綄嶒灢呗耘c更高層次的系統(tǒng)分析相結(jié)合，將基礎(chǔ)研究的結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，最終研究出Wnt依賴性的靶向藥物治療人類CVD。