江婷婷，趙文文，武香香，朱紅磊，曾華輝，閆敏，朱鑫*

1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046

3.河南中醫(yī)藥大學(xué) 信息技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450046

黑色素瘤通常是指惡性黑色素瘤是黑色素細(xì)胞來(lái)源的一種高度惡性的腫瘤，多發(fā)生于皮膚，也可見(jiàn)于黏膜和內(nèi)臟，其發(fā)病率占皮膚腫瘤第3 位[1]。目前關(guān)于預(yù)防和治療黑色素瘤的藥物比較匱乏，且效果不理想，5 年生存率不足40%[2]。臨床上治療主要以手術(shù)切除為主，輔助放療、化療、免疫療法以及靶向治療[3-4]。這些方法效果和安全性尚待進(jìn)一步考察，且治療費(fèi)用昂貴[5-6]。因此，近年來(lái)人們更加關(guān)注從天然植物中尋找預(yù)防和治療黑色素瘤的新途徑。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為，黑色素瘤屬中醫(yī)“黑疔”“惡瘡”“癘疽”等范疇，在臨床治療中以“扶正祛邪、清熱解毒、活血化瘀”為主要治則[7]。雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.為衛(wèi)矛科木本植物，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛等功效[8]。雷公藤甲素是雷公藤的主要生物活性成分之一，具有有效的抗癌活性[9]，用于治療炎癥、自身免疫和惡性疾病已有數(shù)百年歷史[10]。雷公藤甲素抗黑色素瘤已有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，稱(chēng)雷公藤甲素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有抗增殖、抗侵襲和促凋亡的作用。楊羽等[12]研究表明雷公藤甲素通過(guò)抑制趨化因子配體2（CCL2）/趨化因子C-C-基元受體2（CCR2）信號(hào)通路調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫逃逸。然而，目前關(guān)于雷公藤甲素治療黑色素瘤的研究仍處于初級(jí)階段，其潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

中藥成分多且復(fù)雜，呈現(xiàn)出多組分、多靶點(diǎn)的特征，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路與中醫(yī)藥多成分、多靶標(biāo)、系統(tǒng)調(diào)控的理念相一致，其整體性以及注重藥物-疾病-靶點(diǎn)相互作用關(guān)系的特點(diǎn)與未來(lái)中藥的發(fā)展趨勢(shì)相吻合[13]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)篩選雷公藤活性成分治療黑色素瘤的相關(guān)靶點(diǎn)和通路，并將篩選后的活性成分與靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，采用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證雷公藤調(diào)控相關(guān)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)作用機(jī)制，為探索雷公藤治療黑色素瘤提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 雷公藤活性成分與靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），檢索雷公藤的所有化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，得到雷公藤的活性成分和靶點(diǎn)。

1.2 雷公藤作用靶點(diǎn)收集和疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找雷公藤活性成分對(duì)應(yīng)潛在靶點(diǎn)。利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入“melanoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，去重后，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)處理后得到標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)。

1.3 “藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.2 項(xiàng)下獲取的藥物活性靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行Venny 2.1 軟件進(jìn)行分析，將其交集靶點(diǎn)再進(jìn)一步用Perl 腳本處理，得出的Network、MolLists、Type 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建出“藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行PPI 分析。以網(wǎng)絡(luò)中各靶基因的節(jié)點(diǎn)degree 值為指標(biāo)，篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白質(zhì)靶標(biāo)，R 軟件繪制靶點(diǎn)條形圖。

1.5 富集功能分析

基于DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），以P＜0.05 為篩選條件，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。利用微生信在線(xiàn)平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）將GO 及KEGG通路富集結(jié)果繪制成柱狀圖和氣泡圖。

1.6 主要活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB 和PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載篩選得到的成分和靶蛋白結(jié)構(gòu)，采用AutoDockTools 進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMOL 進(jìn)行可視化。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，選取結(jié)合能最小的對(duì)接模型。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 細(xì)胞 黑色素瘤B16-F1 細(xì)胞，購(gòu)自于武漢普諾賽有限公司。

1.7.2 試藥與儀器 雷公藤甲素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，批號(hào)LGTJS20180126，西安昊軒公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（批號(hào)：31800，北京索萊寶科技有限公司））；胎牛血清（批號(hào)42Q9281K，美國(guó)Gibco 公司）；CCK-8 試劑盒（批號(hào)CA1210，北京索萊寶科技有限公司）；Trizol（批號(hào)R1100，北京索萊寶科技有限公司）；BeyoRTTMcDNA 第一鏈合成試劑盒（批號(hào)D7178M，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PCR 引物（蘇州金唯智生物科技有限公司）；Green PCR Master Mix（批號(hào)A25742，美國(guó)Thermo 公司）。

3111 型恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；TG16-WS 型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；SW-CJ-2F 型超凈臺(tái)（蘇州蘇潔凈化公司）；AL204 型精密電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；1510-02820C 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；TS100 型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；A00947 型RNA 逆轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)Thermo 公司）；QuantStudio 7 FleX 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.7.3 B16-F1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) B16-F1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，以2.5×103個(gè)/孔，接種96 孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，每孔分別加入不同質(zhì)量濃度（0、2.5、5、10、15、20、25、30 ng/mL）的雷公藤甲素100 μL 作用細(xì)胞24 h，按CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，450 nm 處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞活力，另設(shè)對(duì)照組（無(wú)血清培養(yǎng)基）。

1.7.4 熒光定量PCR 檢測(cè)蛋白激酶B1（Akt1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）mRNA 的表達(dá) 將細(xì)胞分為對(duì)照組及不同質(zhì)量濃度（10、11.36、15 ng/mL）雷公藤甲素處理組，用Trizol 試劑提取各組B16-F1 細(xì)胞總RNA，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴(kuò)增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，再用2-ΔΔCt法求算目的基因的表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.7.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤活性成分及治療黑色素瘤潛在靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，篩選出雷公藤51 種成分，成分靶點(diǎn)共121 個(gè)。根據(jù)degree 值排名，其中主要活性成分7 個(gè)，見(jiàn)表2。

表2 雷公藤主要活性成分基本信息Table 2 Basic information of main active ingredients of Tripterygium wilfordii

2.2 藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取

在GeneCards 和OMIM 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索有關(guān)黑色素瘤的疾病靶點(diǎn)，去重后，得疾病相關(guān)靶點(diǎn)7 615 個(gè)。利用Venny 分析工具對(duì)雷公藤靶點(diǎn)和黑色素瘤靶點(diǎn)取交集，其中與黑色素瘤相關(guān)的靶點(diǎn)有100 個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 雷公藤與黑色素瘤重合的靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Veen diagram of the overlap of Tripterygium wilfordii and melanoma

2.3 “藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)和篩選的藥物活性成分，用Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。藥物活性成分中degree 值排前2位的分別是山柰酚（degree＝44）、雷公藤甲素（degree＝32）。

圖2 雷公藤活性成分-疾病靶點(diǎn)圖Fig.2 Active ingredients of Tripterygium wilfordii -disease target map

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 分析。如圖3 所示，PPI 含有100 個(gè)靶蛋白和1 092 條互作邊。其關(guān)鍵靶點(diǎn)包括Akt1、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2（VEGF2）、AP-1 轉(zhuǎn)錄因子亞基（JUN）、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）等，可能是雷公藤治療黑色素瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制成靶點(diǎn)條形圖，見(jiàn)圖4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建Fig.3 Construction of the PPI network diagram

圖4 核心靶點(diǎn)條形圖Fig.4 Bar plots of core targets

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析

在GO 富集分析中，富集到436 條生物過(guò)程（BP）、52 條細(xì)胞組成（CC）、102 條分子功能（MF）條目。以P＜0.05 為篩選條件。取前10 個(gè)GO 條目繪制條形圖，見(jiàn)圖5。

圖5 GO 功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis

根據(jù)DAVID 篩得到KEGG 通路147 條，根據(jù)P值排序繪制排名前20 位的KEGG 氣泡圖，見(jiàn)圖6?？深A(yù)測(cè)雷公藤對(duì)黑色素瘤的治療作用主要分布在癌癥通路、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/Akt、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）-17、VEGF等信號(hào)通路。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)果顯示山柰酚、雷公藤甲素與Akt1、PTGS2、VEGFA 核心靶點(diǎn)結(jié)合能均小于-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合活性，見(jiàn)表3。提示這2 個(gè)活性成分在雷公藤治療黑色素瘤中起著較為重要的作用，進(jìn)一步通過(guò)PyMol 軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖7。

圖7 分子對(duì)接圖Fig.7 Molecular docking diagram

表3 山柰酚和雷公藤甲素抗黑色素瘤關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能Table 3 Prediction of binding energy of key targets of kaempferol and triptolide against melanoma

2.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.7.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，雷公藤甲素能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈濃度相關(guān)性，IC50為11.36 ng/mL，見(jiàn)圖8。

圖8 雷公藤甲素對(duì)B16-F1 細(xì)胞毒性的影響（，n =4）Fig.8 Effect of triptolide on cytotoxicity of B16-F1 (,n =4)

2.7.2 熒光定量PCR 檢測(cè)Akt1、VEGFAmRNA 的表達(dá) 通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR 結(jié)果可知給予不同質(zhì)量濃度10、11.36、15 ng/mL 雷公藤甲素后，Akt1、VEGFAmRNA 表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01、0.001），見(jiàn)圖9。

圖9 雷公藤甲素對(duì)Akt1、VEGFA mRNA 的表達(dá)的影響（，n =3）Fig.9 Effect of triptolide on expression of Akt1 and VEGFA mRNA (,n =3)

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，構(gòu)建出“藥物活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步明確化學(xué)成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。其中活性成分排在前2位的是山柰酚和雷公藤甲素。因山柰酚在雷公藤中的成分含量較低，不能真正發(fā)揮中藥在臨床上的藥用價(jià)值，故選取雷公藤甲素作為抗黑色素瘤的主要成分[14]。已有文獻(xiàn)表明雷公藤甲素能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[15]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點(diǎn)為Akt1、PTGS2、VEGFA、JUN 等靶點(diǎn)參與多個(gè)BP，如炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡等。KEGG 富集結(jié)果表明，雷公藤抗黑色素瘤的作用可能與癌癥通路、PI3K/Akt、TNF、IL-17、VEGF 等信號(hào)通路有關(guān)。并且與上述核心靶標(biāo)存在一定的聯(lián)系。有研究表明PI3K/Akt 信號(hào)通路廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期等生理病理活動(dòng)，該通路的失調(diào)與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。VEGFA 是一種具有高度特異性，并可促進(jìn)血管生成的因子，通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合發(fā)揮作用[17]，抑制VEGF 表達(dá)能夠減少新生血管的生成，從而抑制細(xì)胞增殖與侵襲能力[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGFA/VEGFR1 信號(hào)通路可作為預(yù)防黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)[19]。

分子對(duì)接結(jié)果表明，雷公藤甲素與Akt1、PTGS2、VEGFA 這3 個(gè)靶蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合活性，借助氫鍵等分子間作用力產(chǎn)生較穩(wěn)定構(gòu)象。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)證明了雷公藤甲素呈劑量相關(guān)性降低B16-F1 細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGFA 和Akt1 的表達(dá)，抑制B16-F1 細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗黑色素瘤作用。

綜上所述，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了雷公藤治療黑色素瘤的潛在機(jī)制，證明了雷公藤多靶點(diǎn)、多通路治療黑色素瘤，為雷公藤治療黑色素瘤后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突