高瑞，肖曉琳，許建春，宋瑋*

1.天津市第五中心醫(yī)院 藥劑科，天津 300450

2.天津市第五中心醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，天津 300450

腎臟疾病分為急性腎損傷和慢性腎臟疾病2 種類型。急性腎臟損傷通常起病急，于7 d 內(nèi)腎臟功能減退。由于腎功能損傷程度不同，臨床表現(xiàn)為血肌酐極微量的升高，以及無尿的急性腎功能衰竭。急性腎功能衰竭是重癥患者死亡的主要原因之一，因急性腎衰竭死亡的重癥患者人數(shù)可達(dá)到50%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)約20%急性腎臟損傷是藥物毒性引起，其中抗生素導(dǎo)致的腎損傷最為常見。萬古霉素能有效治療革蘭陽性菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的感染，在危重患者的抗感染治療中具有重要地位。然而，萬古霉素作為首選藥的同時(shí)所導(dǎo)致的不良反應(yīng)限制該藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，其中最主要的不良反應(yīng)為急性腎臟損傷[2-4]。

萬古霉素引起急性腎損傷的機(jī)理目前還遠(yuǎn)未明確。研究表明，萬古霉素引起腎損傷可能與萬古霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激[5]、細(xì)胞自噬[6]、阻塞性管型形成[7]和基因調(diào)控[8-9]等因素有關(guān)。還有研究證實(shí)萬古霉素引起腎損傷還可能與其有抑制P-糖蛋白（P-gp）功能和P-gp 在細(xì)胞膜上的表達(dá)相關(guān)[10]。

除上述機(jī)制外，研究還發(fā)現(xiàn)，Smad 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）途徑是調(diào)控腎臟疾病中多種病理過程的重要信號(hào)通路[11]。Smad 蛋白家族根據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能分3 個(gè)亞型：調(diào)節(jié)型、共享型、抑制型蛋白。其中，Smad4 是哺乳動(dòng)物中唯一存在的共享型Smad 蛋白。Smad4 作為受體調(diào)節(jié)型Smad 蛋白共同結(jié)合體，影響Smad2/3 在胞漿和胞核中的定位，在腎臟疾病中具有重要作用，且Smad4 在腎臟纖維化和腎臟炎癥中發(fā)揮截然相反的作用[12]。Tsuchida等[13]證實(shí)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)Smad4 截短突變可抑制TGF-β 誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積。Meng 等[14]指出腎小管上皮細(xì)胞特異性敲除Smad4 基因能抑制Smad3 反應(yīng)啟動(dòng)活性，降低Smad3 和靶基因的結(jié)合能力，進(jìn)而減弱單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎臟纖維化；然而敲除Smad4 基因后Smad7 轉(zhuǎn)錄受到抑制，Smad7 蛋白表達(dá)減少，進(jìn)而抑制靶基因核因子κB（NF-κB）的抑制蛋白（IκB）表達(dá)，促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)。目前關(guān)于Smad4 蛋白在萬古霉素誘導(dǎo)的急性腎臟損傷中的作用尚無報(bào)道。實(shí)驗(yàn)通過研究萬古霉素誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞損傷及其Smad4 的表達(dá)，希望能為對(duì)抗萬古霉素腎毒性尋找新的作用靶點(diǎn)。

1 試劑與儀器

HK-2 細(xì)胞購自美國ATCC 公司。

萬古霉素（貨號(hào)V2002）購自美國Sigma 公司。DMEM/F-12 培養(yǎng)基（貨號(hào)11330032）、胎牛血清（貨號(hào)10091-148）、胰蛋白酶（貨號(hào)25200-056）均購自美國Gibco 公司，Anti-Smad4（貨號(hào)ab244370）、Anti-B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）（貨號(hào)ab272102）、Anti-Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax，貨號(hào)ab10813）、Anti-βactin（貨號(hào)ab227387）抗體均購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶（HRP）二抗購自美國Jackson公司。CCK-8 試劑盒（貨號(hào)CA1210）、TUNEL 試劑盒（貨號(hào)T2191）均購自索萊寶公司，Smad4 過表達(dá)質(zhì)粒[pcDNA3.1(+)-Flag-Smad4，PPL00733-2b]購自PPL 質(zhì)粒與蛋白共享庫。

二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo scientific 公司，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自英國Cleaver scientific 公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國BIO-TEK 公司，臺(tái)式高速離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，脫色搖床購自北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司，超純水儀購自德國Merck Millipore 公司。

2 方法

2.1 顯微鏡觀察萬古霉素對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響

HK-2 細(xì)胞使用DMEM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素和100 μg/mL 鏈霉素），于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞接種于6 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素處理24 h，觀察不同濃度萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞活力的影響

HK-2 細(xì)胞使用DMEM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素和100 μg/mL 鏈霉素），于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞接種于3 塊96 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，分別加入不同終濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素依次處理6、12、24 h 后，分別加入濃度為10%的CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出96 孔板，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在波長為450 nm 處的吸光度（A）值。同時(shí)折算出存活率作圖分析。

2.3 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況

取對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞接種于6 孔板（底部放置多聚賴氨酸包被的蓋玻片），經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同終濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素處理24 h 后用4%多聚甲醛固定，3%雙氧水封閉10 min，0.1% Triton-100 穿透3 min，用原位細(xì)胞死亡監(jiān)測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)，用TUNEL 反應(yīng)混合液標(biāo)記凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核用4′,6-二脒基-2 苯基吲哚（DAPI）染色，熒光顯微鏡隨機(jī)獲取圖像，并檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測(cè)HK-2 細(xì)胞中Smad4 蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞接種于6 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同終濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素處理24 h，收集蛋白。將等量的蛋白裂解物在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%的牛奶室溫封閉l h，在4 ℃用不同的一抗對(duì)膜進(jìn)行過夜孵育，將一抗清洗干凈，用二抗在室溫孵育l h，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液ECL 并使用C-Digit 印跡掃描儀成像，檢測(cè)Smad4 的蛋白表達(dá)水平。

2.5 Western blotting 檢測(cè)HK-2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞接種于6 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同終濃度的萬古霉素（0、1、2、3、4、5 mmol/L）處理24 h，收集蛋白。按2.4 項(xiàng)下方法，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液ECL 并使用C-Digit 印跡掃描儀成像，檢測(cè)Bax 和Bcl-2 的蛋白水平的表達(dá)，采用Image PRO Plus 6.0 分析軟件測(cè)定相關(guān)蛋白條帶的灰度值。

2.6 過表達(dá)Smad4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證

根據(jù)lipofectamineTM2000（invitrogen）說明書操作步驟，將pcDNA3.1(+)-Flag-Smad4 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HK-2 細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)。通過Western blotting 驗(yàn)證Smad4 的過表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)置空載對(duì)照組。

2.7 過表達(dá)Smad4 對(duì)HK-2 細(xì)胞損傷的影響

取上述轉(zhuǎn)染48 h并驗(yàn)證Smad4過表達(dá)后的HK-2 細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組（DMEM/F-12 培養(yǎng)基）、萬古霉素2 mmol/L 組。同時(shí)空載組也隨機(jī)分為對(duì)照組（DMEM/F-12 培養(yǎng)基）、萬古霉素組（2 mmol/L），共同培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察HK-2 細(xì)胞形態(tài)變化情況；同時(shí)將上述分組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，3%雙氧水封閉10 min，0.1% Triton-100 穿透3 min，用原位細(xì)胞死亡監(jiān)測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)，用TUNEL 反應(yīng)混合液標(biāo)記凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核用4′,6-二脒基-2 苯基吲哚染色，熒光顯微鏡獲取圖像，檢測(cè)萬古霉素誘導(dǎo)的過表達(dá)HK-2 細(xì)胞凋亡情況。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 顯微鏡下觀察萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響

顯微鏡下顯示，隨著萬古霉素濃度的逐漸升高，HK-2 細(xì)胞的活性細(xì)胞數(shù)量逐漸變少，細(xì)胞體積逐漸萎縮變圓，而細(xì)胞凋亡數(shù)量逐漸增多，如圖1所示。

圖1 萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）Fig.1 Effect of vancomycin on HK-2 cell morphology (× 100)

3.2 CCK-8 法檢測(cè)萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果顯示，隨著萬古霉素濃度升高，作用時(shí)間增長，HK-2 細(xì)胞增殖能力逐步降低；與6 h 組相比，12 h 組不同濃度萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞存活無顯著影響，而24 h 組不同濃度萬古霉素可顯著抑制HK-2 細(xì)胞存活（P＜0.05、0.01），見圖2。

圖2 萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞活力的影響（，n =3）Fig.2 Effect of vancomycin on the viability of HK-2 cells(,n =3)

3.3 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，隨著萬古霉素濃度升高，TUNEL 陽性細(xì)胞逐漸增多，見圖3。

圖3 萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of vancomycin on apoptosis of HK-2 cells

3.4 Western blotting 檢測(cè)HK-2 細(xì)胞Bax、Bcl-2、Smad4 蛋白的表達(dá)

免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著萬古霉素濃度升高，Bax 蛋白表達(dá)顯著升高，Smad4、Bcl-2 表達(dá)顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），見圖4、5。

圖4 萬古霉素對(duì)HK-2 細(xì)胞中Smad4、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of vancomycin on Smad4,Bax,and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells

圖5 HK-2 細(xì)胞中Smad4、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)量化結(jié)果（，n =3）Fig.5 Quantitative results of Smad4,Bax,and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells (,n =3)

3.5 過表達(dá)Smad4 對(duì)萬古霉素誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞損傷的影響

Western blotting 檢測(cè)HK-2 細(xì)胞中Smad4 蛋白的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)Smad4 過表達(dá)的HK-2 細(xì)胞中Smad4 蛋白表顯著增高（P＜0.01），見圖6。

圖6 HK-2 細(xì)胞中構(gòu)建的過表達(dá)Smad4 蛋白表達(dá)情況（，n =3）Fig.6 Expression of overexpressed Smad4 protein constructed in HK-2 cells (,n =3)

顯微鏡下顯示，空載對(duì)照組HK-2 細(xì)胞狀態(tài)良好，呈正常梭形、背景清晰，貼壁正常；空載萬古霉素2 mmol/L 組HK-2 細(xì)胞失去正常形態(tài)，出現(xiàn)較多凋亡小體，活性細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡數(shù)量明顯增多。轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)較好，基本無凋亡；轉(zhuǎn)染萬古霉素2 mmol/L 組HK-2 細(xì)胞與空載萬古霉素2 mmol/L 組相比，活性細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡數(shù)量減少，見圖7。TUNEL 法檢測(cè)過表達(dá)HK-2 細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)熒光顯微鏡下，與空載對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組陽性凋亡HK-2 細(xì)胞數(shù)量無顯著變化；空載萬古霉素2 mmol/L 組陽性凋亡HK-2 細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P＜0.001）。與空載萬古霉素2 mmol/L 組相比，轉(zhuǎn)染萬古霉素2 mmol/L 組陽性凋亡HK-2 細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖8。

圖7 過表達(dá)Smad4 對(duì)萬古霉素誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)變化（×100）Fig.7 Morphological changes of vancomycin-induced HK-2 cell injury induced by overexpression of Smad4 (× 100)

圖8 萬古霉素誘導(dǎo)對(duì)過表達(dá)Smad4 的HK-2 細(xì)胞凋亡情況的影響（，n =3）Fig.8 Effect of vancomycin induction on apoptosis of HK-2 cells overexpressing Smad4 (,n =3)

4 討論

萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起嚴(yán)重感染的一線抗生素，然而腎毒性是萬古霉素治療常見的不良反應(yīng)[15]。萬古霉素可誘導(dǎo)急性腎損傷逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁阅I病，在早期主要表現(xiàn)為腎功能不全和腎細(xì)胞凋亡，在后期腎臟纖維化和炎癥明顯加重[16]。

本研究通過加入不同濃度的萬古霉素處理HK-2 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)萬古霉素抑制HK-2 細(xì)胞的細(xì)胞活力，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制HK-2 細(xì)胞中Smad4 蛋白表達(dá)，且呈劑量相關(guān)性。研究結(jié)果表明，萬古霉素可能通過調(diào)控Smad4 蛋白降解導(dǎo)致急性腎臟損傷。

此外，Smad 蛋白家族是TGF-β 下游最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等過程中發(fā)揮重要作用。Shen 等[17]研究發(fā)現(xiàn)抑制Smad4 信號(hào)通路可發(fā)揮抗纖維化作用。另外，氧化應(yīng)激在急慢性腎損傷的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，醉茄素A 可通過抑制Smad4 表達(dá)，降低TGF-β 及其下游信號(hào)分子水平，對(duì)腎損傷模型大鼠具有潛在的腎保護(hù)作用[18]。Zhang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)大黃可通過抑制TGF-β/Smad 通路，改善慢性腎臟疾病異常代謝，預(yù)防腎損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Smad4 可降低萬古霉素誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的損傷，再次提示萬古霉素可能通過調(diào)控Smad4 蛋白降解導(dǎo)致急性腎臟損傷。

綜上所述，萬古霉素可能通過調(diào)控Smad4 蛋白降解導(dǎo)致急性腎臟損傷，為對(duì)抗萬古霉素腎毒性尋找了新的作用靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突