耿凡毅，劉虹

1 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000；2 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

膿毒癥是一種重癥監(jiān)護(hù)室的常見臨床綜合征，是由于宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙［1］。全球每年約有4890 萬膿毒癥患者，受不同地區(qū)醫(yī)療水平影響，全球死亡率約為52.8%［2］。目前膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，主要認(rèn)為與病原微生物的清除障礙、炎癥反應(yīng)失衡、線粒體損傷、凝血功能障礙、氧化應(yīng)激等有關(guān)，治療仍以早期識別、抗感染、生命支持為主。組蛋白在傳統(tǒng)上被認(rèn)為是真核生物細(xì)胞染色質(zhì)與原核細(xì)胞中的堿性蛋白質(zhì)和DNA 共同組成核小體結(jié)構(gòu)，是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)成分。但是近10年逐漸發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞核外游離組蛋白（cell-free histones， CFHs）的存在，在膿毒癥發(fā)生發(fā)展時(shí)，中性粒細(xì)胞通過形成中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)（Neutrophil extracellular trap， Nets）來捕獲病原體，其中CFHs是NETs的重要組成部分，而且細(xì)胞凋亡壞死導(dǎo)致核膜破裂也會釋放組蛋白至細(xì)胞外形成CFHs。CFHs 在介導(dǎo)膿毒癥的炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙等方面的免疫病理學(xué)作用被不斷研究，并被認(rèn)為是膿毒癥患者有希望的免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，現(xiàn)將CFHs 在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及治療中的作用研究進(jìn)展綜述如下，為今后膿毒癥的治療提供新的思路和方向［3-4］。

1 CFHs在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用

膿毒癥時(shí)CFHs 的含量增多，會引起機(jī)體器官功能的損傷，作為膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì)，目前認(rèn)為CFHs 的抗菌效果及細(xì)胞毒性、促進(jìn)炎性因子的釋放、通過多種方式損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血小板的聚集和凝血的活化等作用，與膿毒癥的多器官功能障礙密切相關(guān)。

1.1 抗菌和細(xì)胞毒性 感染是膿毒癥發(fā)生的前提，引起膿毒癥嚴(yán)重感染的病原體通常包括細(xì)菌、病毒、真菌等，感染的控制是膿毒癥的主要治療方法。CFHs 發(fā)揮其抗菌作用最早在1958年被報(bào)道，JAMES等［5］人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)CFHs可以殺死病原體，但當(dāng)時(shí)認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)組蛋白的基因表達(dá)調(diào)控作用是最主要的，CFHs 的殺菌作用被忽略掉。隨后在2004年發(fā)現(xiàn)了Nets，CFHs 作為NETs 的重要組成部分之一，才引起了人們對組蛋白在免疫方面的作用的興趣。在隨后的多項(xiàng)試驗(yàn)中，CFHs之一的瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）表現(xiàn)出對革蘭氏陰性菌（產(chǎn)氣腸桿菌、腸沙門氏菌和銅綠假單胞菌）、革蘭氏陽性菌（蠟樣芽孢桿菌和變形鏈球菌）和一種真菌菌株（白色念珠菌）有抗菌活性，實(shí)驗(yàn)證明CFHs 可以與病原體表面分子結(jié)合，隨后對病原體細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞而發(fā)揮CFHs的抗菌作用，同時(shí)它的細(xì)胞毒性也是通過破壞細(xì)胞膜所實(shí)現(xiàn)的［6-7］。考慮到CFHs 在宿主防御階段的抗菌及細(xì)胞毒雙重作用，未來也有希望開發(fā)基于CFHs的無細(xì)胞毒性抗菌藥物來進(jìn)行膿毒癥的治療。

1.2 參與炎癥反應(yīng) 當(dāng)組蛋白從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外形成CFHs 時(shí)，被認(rèn)為具有重要的促炎功能［8］。CFHs 通過激活TLRs，如TLR2、TLR4 和TLR9，或結(jié)節(jié)樣受體蛋白（NLPR3）炎癥反應(yīng)途徑引發(fā)先天免疫，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-1B、IL-6、IL-18、TNF等的釋放，進(jìn)而使中性粒細(xì)胞釋放Nets，且上調(diào)組織因子（TF）的表達(dá)［9-10］。HSIEH 等［11］人研究發(fā)現(xiàn)，游離組蛋白H4 在感染或炎癥部位的釋放可能會增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的活化并促進(jìn)額外的炎癥反應(yīng)。XU等［12］人報(bào)道過CFHs 是膿毒癥小鼠死亡的主要介質(zhì)，但是該實(shí)驗(yàn)沒有對膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥因子進(jìn)行進(jìn)一步研究，后續(xù)再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)注射亞致死劑量CFHs 導(dǎo)致了高水平的TNF-α、IL-6 和IL-10，但是TLR4 和TLR2 基因敲除的小鼠卻能抵抗致死劑量CFHs 的打擊，該實(shí)驗(yàn)充分證明了CFHs在TLRs介導(dǎo)下的免疫炎癥反應(yīng)。

1.3 引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷 內(nèi)皮損傷會導(dǎo)致液體滲漏和白細(xì)胞的聚集，被認(rèn)為是膿毒癥器官和組織損傷的主要原因。有學(xué)者［13］研究發(fā)現(xiàn)，正常的核小體不具有細(xì)胞毒性，但被降解后的核小體會釋放CFHs對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞毒性。另外，CFHs對細(xì)胞膜磷脂中的磷酸二酯鍵的強(qiáng)親和力促進(jìn)其整合到膜中，進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷。也有學(xué)者［14］發(fā)現(xiàn)，Cit-H3 作為一種CFHs，可通過對細(xì)胞黏著連接的開放和細(xì)胞骨架的重組作用損傷內(nèi)皮細(xì)胞。MONA等人將Nets 的組成部份（中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶、髓過氧化物酶、CFHs）分別作用于肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，以觀察各組分對細(xì)胞的直接影響，發(fā)現(xiàn)了CFHs誘導(dǎo)了上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，而單獨(dú)抑制中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶并不能抑制Nets 介導(dǎo)的細(xì)胞毒性［15］。其次，在血漿中CFHs 會增大鈣離子向內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)流，引起內(nèi)皮細(xì)胞死亡和血管功能障礙［16］。SILVESTIR 等［17］人也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外游離組蛋白H4 可通過在血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成孔洞而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而導(dǎo)致血管組織損傷。

1.4 導(dǎo)致凝血功能障礙 膿毒癥期間會引起嚴(yán)重的凝血功能障礙，凝血系統(tǒng)的激活被認(rèn)為是人體對病原體入侵的初始免疫應(yīng)答的一部分，可以觸發(fā)先天防御機(jī)制，TF 是凝血的主要發(fā)起者。CFHs 通過鈣離子內(nèi)流、細(xì)胞間縫隙鏈接斷裂破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障，使原本存在于細(xì)胞質(zhì)膜的TF暴露于循環(huán)FVII因子，使FVII因子與TF結(jié)合，生成FXa因子，啟動(dòng)凝血級聯(lián)反應(yīng)。CFHs還可以通過TLRs信號通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的TF 表達(dá)，甚至可以直接與FXa 因子結(jié)合而產(chǎn)生不需要磷脂的凝血酶原，形成一種替代凝血酶原復(fù)合物的物質(zhì)［18-19］。目前有研究［20］顯示，血小板也參與了先天性免疫反應(yīng)，膿毒癥期間血小板反應(yīng)性增加，血小板所具有的DAMPs會被毒素所激活，從而導(dǎo)致機(jī)體凝血系統(tǒng)的紊亂，進(jìn)一步導(dǎo)致出血或血栓的形成。血小板對感染的反應(yīng)研究最重要之一就是血小板與中性粒細(xì)胞相互作用，Nets 為血栓的形成提供了一個(gè)支架和刺激，其中CFHs 可以通過TLR2 和TLR4 途徑刺激膿毒癥期間血小板的聚集［12，21］。另外，細(xì)胞外游離組蛋白H3、H4 觸發(fā)NLRP3 炎癥小體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血小板中caspase-1的裂解，這也可能導(dǎo)致隨后的血栓形成［22］。

2 CFHs作為膿毒癥潛在治療靶點(diǎn)

CFHs 參與了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程，因此將CFHs 作為膿毒癥潛在治療靶點(diǎn)具有一定可行性。目前的實(shí)驗(yàn)研究中出現(xiàn)了抑制CFHs 的產(chǎn)生、降解循環(huán)中的CFHs 或使用降低CFHs 細(xì)胞毒性的藥物等方法，因此以CFHs 作為治療靶點(diǎn)有望會成為膿毒癥治療的新策略。

2.1 抑制CFHs 的產(chǎn)生發(fā)揮治療作用 CFHs 的重要產(chǎn)生方式之一與NETs 有關(guān)。NETs 釋放CFHs 是由于細(xì)胞內(nèi)組蛋白在肽基精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）催化下進(jìn)行瓜氨酸化，形成瓜氨酸化組蛋白，導(dǎo)致染色質(zhì)解螺旋使得組蛋白釋放至細(xì)胞外形成CFHs。PAD 抑制劑氯—嘧啶可以抑制PAD4 的生成，間接抑制組蛋白瓜氨酸化從而抑制CFHs 的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)［23］表明，氯—嘧啶可以顯著降低膿毒癥兔子的AKI 評分、血肌酐、血尿素氮水平，證實(shí)了抑制CFHs的產(chǎn)生在膿毒癥治療中的潛力。

2.2 降低循環(huán)中CFHs 的含量發(fā)揮治療作用 在致死性脂多糖誘導(dǎo)休克的小鼠模型中，用新開發(fā)的抗CitH3單克隆抗體中和CitH3 可減弱炎癥反應(yīng)、器官損傷，改善急性肺損傷并提高存活率，因此減少循環(huán)中的CFHs 可能是治療膿毒癥的潛在治療方法［7，24］。

CFHs 對膿毒癥的凝血級聯(lián)的影響可以通過利用活化蛋白C（APC）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）來應(yīng)對。在膿毒癥狒狒上使用APC，發(fā)現(xiàn)其可以降解細(xì)胞外游離組蛋白H3、H4，其作用可能是通過APC 切割組蛋白并降低了CFHs的細(xì)胞毒性來實(shí)現(xiàn)的［25］。TM是一種主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗凝蛋白，既往研究揭示了TM 的抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用。有研究采用重組人血栓調(diào)節(jié)蛋白（RTM）顯著降低了細(xì)胞外游離組蛋白H3 水平并改善腎損傷，RTM 組膿毒癥小鼠存活率也明顯升高［26-27］。

肝素對CFHs 有很高的親和力，但僅限于普通肝素及低分子肝素，類肝素磺達(dá)肝癸鈉則表現(xiàn)出了低親和力［28］。當(dāng)使用肝素這種能去除CFHs 的抗凝劑時(shí)，它能像脫氧核糖核酸酶一樣有效的拆除Nets并從Nets 中去除血小板聚集物，表明肝素可以通過拮抗CFHs 而不是抗凝血來保護(hù)膿毒癥小鼠免受器官損傷和死亡［29］。在膿毒癥小鼠模型中，肝素已經(jīng)被證明與CFHs 結(jié)合并中和其細(xì)胞毒性［30］。它具有一部分抗炎效果，這取決于它的硫酸化水平，實(shí)驗(yàn)證明完全去除硫酸基團(tuán)的肝素并不具有與組蛋白結(jié)合的能力，意味其抗凝血效果和抗炎效果是分開的［31］?；诖?，KARIN 等［32］人通過層析法從普通肝素中去除抗凝血?jiǎng)┎糠?，開發(fā)了非抗凝劑肝素（AADH），他們的結(jié)果表明，AADH 顯著結(jié)合CFHs，預(yù)防組蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，并降低小鼠模型膿毒癥的死亡率；更重要的是，用AADH治療正常小鼠的劑量是普通肝素的5 倍，并沒有顯著延長小鼠出血時(shí)間。目前肝素對CFHs 的作用在動(dòng)物試驗(yàn)中開展較多，臨床上危重患者的凝血功能大多存在障礙，凝血時(shí)間延長及DIC 的出現(xiàn)，對于肝素在臨床上的應(yīng)用保持慎重的態(tài)度，AADH 是否可以應(yīng)用在臨床預(yù)防組蛋白的毒性，可以作為新的研究方向。

目前也出現(xiàn)了血液灌流靶向吸附CFHs 的治療方法，細(xì)胞因子吸附器、肝素化吸附器，都可以顯著降低膿毒癥患者血液中循環(huán)CFHs 水平，為膿毒癥患者的異常免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)提供新的見解［33］。

2.3 降低CFHs的細(xì)胞毒性發(fā)揮治療作用 C-反應(yīng)蛋白（CRP）在抵抗細(xì)菌感染的先天免疫中起著重要的防御作用。CFHs會引起鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，CRP 可以競爭性地結(jié)合組蛋白與磷脂脂質(zhì)體，形成CRP-組蛋白復(fù)合物，防止CFHs進(jìn)入細(xì)胞膜并防止鈣內(nèi)流，因此膿毒癥患者高水平的CRP具有對循環(huán)CFHs的解毒作用，可以一定程度的抵御CFHs 產(chǎn)生的細(xì)胞毒性［13，16］。研究［15，34］發(fā)現(xiàn)，CFHs的毒性可能是由于其陽離子的特性導(dǎo)致，而利用聚唾液酸（高負(fù)電荷的聚糖）可以有效降低Nets介導(dǎo)的CFHs細(xì)胞毒性。

綜上所述，膿毒癥目前仍是重癥監(jiān)護(hù)室中的常見綜合征，發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，其病理生理過程復(fù)雜。隨著Nets的不斷研究，CFHs也越來越被人們所認(rèn)識，它在膿毒癥中以游離的形式從多個(gè)方面對機(jī)體進(jìn)行作用，具有一定抗菌效果，也會發(fā)揮細(xì)胞毒性、加劇炎癥反應(yīng)促進(jìn)炎性因子的釋放、通過多種方式損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、影響凝血功能導(dǎo)致出血風(fēng)險(xiǎn)或血栓形成，以此延長膿毒癥的病程、加重病情。由于CFHs 密切參與了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，各種以CFHs為靶點(diǎn)的治療手段也得到了很大的進(jìn)步，抑制CFHs的產(chǎn)生、降解循環(huán)中的CFHs或降低CFHs細(xì)胞毒性的藥物在膿毒癥動(dòng)物模型中提供了顯著的預(yù)防死亡的作用，發(fā)揮了治療作用，但由于缺乏可靠臨床證據(jù)，目前可用的抗組蛋白藥物均未被任何臨床指南批準(zhǔn)用于治療危重疾病的免疫調(diào)節(jié)，未來應(yīng)進(jìn)行更深入研究以開發(fā)其潛在的臨床價(jià)值。