柯媛媛，高永躍，羅玉玲，周訓蓉*

(1.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥學部，貴州 貴陽 550003)

疏肝胃安湯源于貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院凌湘力老師25年來的臨床經(jīng)驗方。該方主要由柴胡、枳殼、白芍、延胡索、香附等12 味中藥組成。具有疏肝理氣、和胃止痛的功效，適用于肝胃不和型慢性胃炎[1—2]。疏肝胃安湯在臨床上以傳統(tǒng)湯劑的形式服用，因湯劑口感差、煎煮時間長、易霉變[3—4]，故考慮制成顆粒劑，相比于湯劑其適用性強，攜帶儲存運輸方便[5—6]，更符合現(xiàn)代生活需求。Box-Behnken Design(BBD)響應面法是通過多元二次回歸方程擬合各因子與響應值之間的函數(shù)相互作用，從而得到預測的最優(yōu)試驗條件。該研究方法試驗次數(shù)少，應用性強，預測性好[7—8]。本研究通過響應面法擬定試驗方案，從響應面中得到各影響因子對指標的影響趨勢，篩選出最優(yōu)的成型工藝條件[9]，為生產(chǎn)提供理論依據(jù)，進而推進該方在醫(yī)院制劑和臨床應用的發(fā)展。

1 材料與儀器

1.1 材料

中藥飲片柴胡、枳殼、白芍、醋香附、延胡索等12 味藥均購于貴州同濟堂中藥飲片有限公司，符合《中國藥典》(2020年版)一部各項規(guī)定?？扇苄缘矸?批號：210401，安徽山河藥用輔料股份有限公司)、糊精(批號：2022062301，曲阜市藥用輔料有限公司)、膠態(tài)二氧化硅(批號：20220103，上海風泓藥用輔料技術(shù)有限公司)、乳糖(批號：TF46200301，湖南九典宏陽制藥有限公司)、甘露醇(批號：GLC22042604，青島明月海藻集團有限公司)、微晶纖維素(批號：20060904，湖南新綠方藥業(yè)有限公司)、麥芽糊精(批號：220301，長嶺吉隆生物藥業(yè)有限公司)。

1.2 主要儀器與試劑

HPLC 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，型號Agilent1260)、電子天平(沈陽龍騰電子有限公司，型號ESJ182-4)、分析天平(上海菁海儀器有限公司，型號FA2204N)、電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，型號101-2AB)、水分測定儀(奧豪斯儀器(常州)有限公司，型號MB27ZH)、超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司，型號SK5210HP)、藥典篩，純凈水、乙腈(分析純)。

1.3 方法

1.3.1 柚皮苷含量測定

色譜條件：色譜柱Ultimate plus C18(5 μm，4.6 mm× 250 mm)，流動相為乙腈-0.03%磷酸(20:80)，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流速1.0 mL·min–1，檢測波長283 nm，理論塔板數(shù)不低于3000。

取柚皮苷適量，加甲醇制成含量為64.1780 mg·L–1柚皮苷對照品溶液。

于25 mL 容量瓶中，精密加入疏肝胃安水提液1 mL，加50%乙醇定容，搖勻，離心(10000 r·min–1，10 min)，取上層清液，過0.45 μm 濾膜，即得供試品溶液。

1.3.2 提取工藝正交試驗設(shè)計

取1 倍臨床處方量(柴胡6 g、白芍20 g、郁金15 g、香附12 g、枳殼12 g、金錢草12 g、茵陳12 g、黃芩12 g、延胡索12 g、炒麥芽12 g、炒稻芽12 g、甘草3 g)18 份，按照L9(34)正交表煎煮(表1)，過濾，常壓濃縮至500 mL 得到相應的供試品溶液。以柚皮苷含量和總固體收率為指標進行綜合評價。

表1 提取工藝正交試驗因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal test for extraction

1.3.3 成型工藝設(shè)計

1.3.3.1 顆粒劑制備

稱取相應的處方量藥材，按最佳提取工藝煎煮、過濾，濃縮至相對密度1.20～1.29 浸膏。加入輔料，混合，制軟材。擠壓過14 目篩，70～80 ℃烘干。

1.3.3.2 考察指標

(1)成型率 參照《中國藥典》(2020 版)四部通則[10]。將顆粒依次過1 號篩和5 號篩，能通過1 號篩但不能通過5 號篩的顆粒為合格顆粒，稱重。顆粒成型率(%)=合格顆粒質(zhì)量/過篩前顆粒質(zhì)量×100%[11]。

(2)軟材系數(shù) 觀察制粒時軟材情況，通過手感黏度、過篩情況以及顆粒完整性進行評價，依項評分(表2)。

表2 感官評價評分Table 2 Sensory evaluation score

(3)休止角 采用固定漏斗法測定休止角。取合格的顆粒，將顆粒體從一定高度的漏斗中自然落到表面皿上[12]，當顆粒全部漏完后，與平面形成的高度即為錐體高度(h)，圓錐的半徑即為錐體半徑(r)，則顆粒休止角為tanθ=h/r。

(4)吸濕率 取疏肝胃安顆粒2 g，精密稱定，將顆粒均勻平鋪于稱量瓶中，置于干燥器(底部放置飽和硫酸銨溶液)內(nèi)，密封72 h 后，將其精確稱重，求得吸濕率[13]。

顆粒吸濕率(%)=(吸濕后顆粒質(zhì)量-吸濕前顆粒質(zhì)量)/吸濕前顆粒質(zhì)量×100%

(5)水分 取顆粒約2 g，均勻平鋪于水分測定儀內(nèi)部稱盤上測量顆粒水分。

1.3.3.3 單因素試驗

首先通過單因素實驗，考察輔料(可溶性淀粉、糊精、微晶纖維素、甘露醇、乳糖、麥芽糊精等)、輔料配比(1:1、2:1、3:1、4:1)、藥輔比(1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5)、膠態(tài)二氧化硅比例(6 %、7 %、8 %、9 %)對成型率、軟材情況、制粒情況、顆粒性狀的影響。取浸膏8 g，糊精和可溶性淀粉混合輔料，輔料與浸膏比1:1 作為固定條件，初步篩選各因素最適條件[14]。

1.3.3.4 Box-Behnken響應面法設(shè)計

基于單因素實驗結(jié)果，以膠態(tài)二氧化硅比例(A)、可溶性淀粉與糊精比例(B)、輔料與浸膏比例(C)為主要影響因素，設(shè)計Box-Behnken響應面法實驗(表3)。對數(shù)值越小越好的指標和數(shù)值越大越好的指標分別進行轉(zhuǎn)換，成型率、軟材系數(shù)的轉(zhuǎn)換公式為(該值–最小值)/(最大值–最小值)，水分、吸濕性、休止角的轉(zhuǎn)換公式為(最大值–該值)/(最大值–最小值)[15]。對轉(zhuǎn)換的數(shù)值采用綜合加權(quán)計算總評得分，總評分=軟材系數(shù)× 0.4 + 成型率× 0.3 + 休止角×0.1 + 水分× 0.1 + 吸濕率× 0.1。不同條件下所得總評值越大，表明制備工藝越優(yōu)。

表3 響應面設(shè)計因素與水平Table 3 Response surface design factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果表明，三個因素對柚皮苷含量和總固體收率的綜合得分均有不同程度的影響，其影響大小為提取次數(shù)C > 加水倍數(shù)A > 提取時間 B，根據(jù)綜合評分得出最優(yōu)組合為A3B2C3(表4)。方差分析顯示，A、B 兩因素無顯著差異，結(jié)合實際情況，在大生產(chǎn)模式下，藥材批量大，設(shè)備容器大，煎煮30 min 提取不完全，本著綠色經(jīng)濟和節(jié)約成本的原則，最終以A1B2C3為最佳提取條件。

表4 L9(34)正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 L9(34)orthogonal experimental design table and results

2.2 最佳提取工藝驗證

平行稱取1 倍處方量3 份，按照最佳水提條件A1B2C3進行驗證，測定柚皮苷含量和總固體收率，得出柚皮苷平均含量為1.91 mg·L–1，總固體收率平均值為21.6%，二者RSD 值均小于5%，與正交試驗結(jié)果相近，表明該提取工藝條件穩(wěn)定可行。

2.3 成型工藝條件

2.3.1 單因素對成型顆粒性狀的影響

單因素實驗結(jié)果表明，選用單一輔料進行制粒時，所需輔料量大，達浸膏量的2～3 倍，導致日服用量增加。乳糖、微晶纖維素、甘露醇易黏篩網(wǎng)，成型率較低，麥芽糊精軟材過硬，不易過篩，成型率最小(表5)。故以淀粉和糊精混合輔料為宜。

表5 輔料及其比例對制粒的影響Table 5 Effects of excipients and their proportion on granulation

輔料比例對制粒成型、顆粒完整性等有較大影響(表5)。隨著糊精占比增加，軟材逐漸變硬，成型率降低，難以過篩。當輔料比(糊精：可溶性淀粉)為1:1、2:1 時，軟材略黏，成型率在90%以上，當比例為1:1 時顆粒細粉較少，顆粒整體更均勻。

隨著輔料與浸膏比例增加，成型率先增加后下降，軟材逐漸變黏，過篩困難，成型率降低。當輔料與浸膏比例為1:1 時，軟材略黏，顆粒均勻，成型率高(表6)。

表6 藥輔比例對制粒的影響Table 6 Effects of drug-assisted ratio on granulation

由表7 可以看出，隨著膠態(tài)二氧化硅比例逐漸增加，成型率先升后降，當比例為8%時，成型率最高，軟材適中，顆粒性狀完整。

表7 二氧化硅比例對制粒的影響Table 7 Effects of silica ratio on granulation

2.3.2 響應面法篩選最佳成型工藝

采用Box-Behnken響應面法擬定試驗，實驗設(shè)計與結(jié)果見表8。運用軟件Design-Expert.V8.0.6.1對影響因素進行擬合分析，總評值(Y)為擬合因變量，得到二次多項式回歸方程為Y=0.70+0.027A–8.125×10–3B+0.17C–0.064AB+0.051AC–0.025BC–0.014A2–0.044B2–0.16C2。通過方程分析可以得出，該模型擬合度良好(表9)。 因素C、C2、B2、AB、AC 對總評值影響顯著，交互項BC 影響不顯著，輔料和浸膏比例對總評值影響較大。

表8 響應面法實驗設(shè)計與結(jié)果Table 8 Experimental design and results

表9 響應面方差分析Table 9 Response surface analysis of variance

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對試驗結(jié)果進行分析，得到總評值與膠態(tài)二氧化硅用量、輔料比例、輔料與浸膏比例交互作用的三維響應面圖和等高線圖(圖1～圖4)。由此可得疏肝胃安顆粒最佳成型工藝為：膠態(tài)二氧化硅比例(A)為8 %、可溶性淀粉與糊精比例(B)為1:1、輔料與浸膏比例(C)為1:1。

圖1 可溶性淀粉與糊精比例與膠態(tài)二氧化硅比例對總評影響3D 圖Fig.1 3D diagram of the effect of the ratio of soluble starch to dextrin and colloidal silica on the overall evaluation

圖 2 輔料與浸膏比與膠態(tài)二氧化硅比例對總評影響3D 圖Fig.2 The effect of the ratio of excipients to extract to colloidal silica on the overall evaluation 3D

圖3 輔料與浸膏比與可溶性淀粉與糊精比例對總評影響3D 圖Fig.3 3D diagram of the effect of excipients to extractratio and soluble starch to dextrin ratio on the overall evaluation

圖4 可溶性淀粉與糊精比例與膠態(tài)二氧化硅比例對總評等高線圖Fig.4 Overall contour plot of the ratio of soluble starch to dextrin versus the ratio of colloidal silica

2.3.3 最佳成型工藝條件驗證

平行稱取3 份同批次浸膏，按優(yōu)化制粒工藝制備3 批疏肝胃安顆粒。取合格顆粒，代入方程計算，求得總評值平均為0.737(表10)，與模型擬合方程理論預測值0.766，兩者偏差1.93%(小于5%)，表明該方案合理、可行、穩(wěn)定，有利于工藝生產(chǎn)參數(shù)的優(yōu)化。

表10 優(yōu)化成型工藝驗證結(jié)果Table 10 Three batches of verification test results

3 討論

疏肝胃安方是由柴胡、白芍、枳殼、延胡索、香附等12 味中藥組成。藥理研究表明，柴胡、白芍具消炎、鎮(zhèn)痛、保護和修復胃黏膜屏障功能[16]；枳殼的揮發(fā)油和檸檬烯均能促進胃腸蠕動[17—18]；香附所含揮發(fā)油能誘導細胞凋亡而起到顯著的抑菌作用且具有促進胃腸蠕動作用[19—20]；延胡索具有鎮(zhèn)痛、抗胃潰瘍等藥理作用[21]。不管是單方藥還是配方藥，對胃炎和潰瘍都發(fā)揮著重要的治療作用。

本實驗對疏肝胃安顆粒的制備工藝進行系統(tǒng)研究，通過正交試驗，以柚皮苷含量和總固體收率為綜合指標，選出最佳的水提工藝條件。在顆粒成型工藝單因素考察中，由于中藥浸膏中含有蛋白質(zhì)、糖類、鞣制等成分，使得浸膏黏度增加，單味輔料雖能制成符合規(guī)定的顆粒，但過篩困難，易黏篩網(wǎng)，顆粒硬度較大，溶化性差，且日服用量大，導致患者順應性差，故考慮采用糊精淀粉為混合輔料改善軟材和制粒情況，在此基礎(chǔ)上加入膠態(tài)二氧化硅，能大大縮減輔料用量。單因素實驗初步確定了輔料的種類和比例范圍，再通過響應面法得到的3D 立體圖和等高線圖，以及對前期相關(guān)的數(shù)據(jù)進行方差分析、模型診斷，精準篩選出該方顆粒最佳制備工藝參數(shù)。驗證結(jié)果表明，該制備工藝穩(wěn)定可靠，軟材好，成型率高，流動性好，吸濕率低，輔料價格低廉。響應面法是篩選工藝條件、降低成本、提升和優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量以及解決問題的一種經(jīng)濟有效的方法[22]，能對影響因素進行快速且有效的優(yōu)化，提高實驗的準確性與可信度[23]，在疏肝胃安顆粒成型工藝篩選的應用中具有可行性和合理性[24]。