陳詩陽,王曉景,董玉杰,張美春

膿毒性心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy,SIC)是由膿毒癥(sepsis)引起的發(fā)生在膿毒性休克早期的可逆性心肌功能障礙[1],其為膿毒癥最嚴重的并發(fā)癥之一。最新研究表明膿毒癥伴有心功能障礙的患者病死率可高達70%,不伴有心功能障礙的膿毒癥患者病死率僅為20%[2]。機體失控性炎性反應學說被認為是膿毒癥發(fā)病機制的重要基礎。炎性細胞過度激活并釋放大量炎性細胞因子是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[3],其中cTnI、CK-MB、BNP等心肌損傷標志物以及 TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子在臨床常用且敏感性高,是膿毒癥患者疾病嚴重程度和預后的明確指標[4-5]。Toll樣受體4 (TLR4)/NF-κB信號通路在參與膿毒性心肌病調(diào)節(jié)中起著至關重要的作用。膿毒癥過程中,TLR4參與介導了NF-κB 信號途徑的激活,從而大量釋放TNF-α、IL-6、IL-1等炎性因子,對其后的級聯(lián)反應起引領作用,進而引起心肌功能障礙[6]。本研究旨在探討TLR4抑制劑對脂多糖(LPS)誘導SIC小鼠心肌損傷的改善作用,并進一步了解其潛在機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物:SPF級C57BL/6小鼠9只,雄性,6～8周齡,購自湖北省實驗動物研究中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2020-0018,使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0045]。在光照 12 h / d、濕度 50%～65%、溫度20～24℃的環(huán)境下喂養(yǎng) 1 周。(2)試劑與設備:LPS、TLR4抑制劑(TAK-242)購自美國Sigma公司;cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司;兔多抗TLR4、兔多抗NF-κB購自江蘇親科生物研究中心有限公司;兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司;HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。 (3)儀器設備:顯微鏡(尼康Fi3型生物顯微鏡),脫水機(武漢俊杰JT-12J電腦生物組織脫水機),化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自杭州申花科技有限公司,冷凍高速離心機購自湖南可成儀器設備有限公司,電熱恒溫培養(yǎng)箱購自日本ASONE,小動物超聲成像系統(tǒng)購自百勝公司。

1.2 實驗方法 本研究經(jīng)武漢科技大學醫(yī)學倫理委員會批準(2023102),于2023年3—6月在武漢科技大學動物實驗中心進行實驗。將小鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、SIC組、TLR4抑制劑干預組(干預組),每組3只。除對照組外,其余2組小鼠以LPS(15 mg/kg)腹腔注射構建膿毒性心肌病小鼠模型;干預組在腹腔注射LPS前1 h,經(jīng)尾靜脈以0.3 mg·kg-1·h-1速度靜脈泵入TLR4抑制劑;對照組腹腔注射生理鹽水(15 mg/kg)代替LPS。采用小動物超聲成像系統(tǒng)測量小鼠24 h左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF),LVEF<50%證明SIC小鼠模型構建成功[7]。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 小鼠心肌組織形態(tài)學變化:采用HE染色觀察。造模完成24 h后,頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠左心室心室肌組織,首先對組織進行脫水、透明、浸蠟處理,12 h后從生物組織脫水機中取出,再次進行包埋、切片烤片以及脫蠟處理,再將切片行蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色處理,風干后中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察小鼠心肌組織的形態(tài)學變化。

1.3.2 血清心肌損傷和炎性標志物檢測:采用酶聯(lián)吸附實驗(ELISA)法檢測。小鼠造模24 h后,異氟烷吸入麻醉,從心臟取血1.0～1.5 ml,離心留取血清標本。使用cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒,嚴格按照廠家說明書檢測上述標志物含量。在酶標儀450 nm波長處測量每孔的光密度,并計算相應的濃度。

1.3.3 心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達檢測:采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western Blot)法檢測。將少量剪碎的小鼠心室肌組織塊置于冰上30 min充分裂解,4℃下離心,留取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20℃保存。采用BCA法測定蛋白濃度,經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,隨后封閉,封閉完成后加入兔多抗GAPDH、兔多抗TLR4、兔多抗p65(均1∶1 000稀釋),4℃孵育過夜。第二日在洗去一抗液后,HRP標記羊抗兔二抗以1∶10 000稀釋,室溫搖床孵育2 h后再次洗去多余二抗,隨后將預混好的免疫熒光(ECL)發(fā)光液滴加于PVDF膜上,反應數(shù)分鐘待熒光帶明顯后,用濾紙吸去多余的底物液,覆上保鮮膜,X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影,沖洗、晾干、掃描膠片,用ipp6.0軟件分析膠片灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心肌組織病理形態(tài)變化 在各組小鼠造模完成24 h后顯微鏡下可見: 對照組心肌組織形態(tài)結(jié)構完整,心肌纖維排列規(guī)則,心肌細胞整齊未見明顯病變,未見炎性細胞浸潤; SIC組心肌組織形態(tài)結(jié)構相對完整,心肌纖維排列紊亂,部分心肌細胞水腫,胞體崩解消融(黑色箭頭),間質(zhì)內(nèi)可見明顯炎性細胞浸潤(黃色箭頭); 干預組心肌組織形態(tài)結(jié)構相對完整,心肌纖維排列規(guī)則,少量心肌細胞損傷伴有空泡樣變(黑色箭頭),間質(zhì)內(nèi)可見零散炎性細胞浸潤(黃色箭頭),見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)改變( HE 染色,×200)Fig.1 Pathological changes in myocardial tissue of rats in each group under light microscopy (HE staining, × 200)

2.2 各組血清心肌損傷標志物及炎性因子水平比較 在小鼠造模24 h后,與對照組比較,SIC組cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均升高(t=26.274、32.979、26.782、36.031、23.266、34.881,P均<0.001);與SIC組比較,干預組cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均下降(t=15.181、22.537、20.697、21.428、19.241、22.228,P均<0.001),見表1。

表1 3組小鼠血清心肌組織損傷標志物及炎性因子水平比較Tab.1 Comparison of serum myocardial tissue injury markers and inflammatory factor levels among three groups of mice

2.3 各組心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達比較 在小鼠造模24 h后,與對照組比較,SIC組TLR4、NF-κB蛋白表達顯著上調(diào)(t=15.611、9.977,P均<0.001),與SIC組比較,干預組TLR4、NF-κB表達下調(diào)(t=28.067、7.320,P均<0.01),見圖2、表2。

表2 3組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達比較Tab.2 TLR4 and NF in myocardial tissue of three groups of mice-κB Comparison of protein expression

圖2 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白印記圖Fig.2 TLR4 and NF in myocardial tissue of mice in each group-κB protein blot

2.4 血清炎性因子水平與心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達的相關性 進一步行相關性研究分析示,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平與小鼠心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白表達呈高度正相關(P<0.01),見表3。

表3 炎性因子水平與TLR4、NF-κB蛋白表達的相關性Tab.3 Inflammatory factor levels and TLR4, NF-κB The correlation between protein expression

3 討 論

關于膿毒性心肌病的有效治療手段,至今仍是國內(nèi)外懸而未決的一大難題。近年來,關于膿毒性心肌病的發(fā)生發(fā)展機制已有了一定的深入研究,其中由于炎性因子的過度表達而引起一系列的惡性循環(huán)基本取得了專家們的共識。因此在關于膿毒性心肌病的治療上,除了重視引起膿毒癥感染的原發(fā)病以外,抗炎治療現(xiàn)已成為首要的治療原則[8]。由于在發(fā)生膿毒性心肌病時,機體會釋放大量炎性因子,如果僅僅只是通過針對單一炎性因子的抑制來達到抗炎的目的,顯然是不足以改善機體發(fā)生的炎性瀑布反應。治療膿毒性心肌病的干預靶點應著眼于調(diào)節(jié)炎性因子的關鍵部位。目前膿毒性心肌病藥物治療效果不理想,研究者認為這可能與現(xiàn)階段治療膿毒性心肌病藥物的靶點共性不高,對于早期炎性因子表達的抑制作用較差相關。因此,在現(xiàn)有的介導炎性因子表達的信號通路上,探索各信號傳導通路之間的交互作用,在不同信號通路的交叉點上開發(fā)靶點藥物,為治療膿毒性心肌病提供新思路。

TLR4/NF-κB信號通路的異常調(diào)控與膿毒癥、缺血再灌注損傷、癌癥、消化性潰瘍、炎性腸病、肥厚性心肌病、COVID-19等多種疾病相關[9-15]。炎性因子的大量釋放也與TLR4信號通路的表達、激活密不可分。TLR4/NF-κB信號通路是膿毒性心肌病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的一個重要的信號通路[16],當機體收到LPS刺激后,LPS與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合并轉(zhuǎn)移到細胞表面的CD14上。然后,TLR4作為一種Ⅰ型跨膜蛋白與LPS結(jié)合后再與輔助蛋白MD-2相互作用,激活下游各種信號傳導通路,包括NF-κB、JNK、p38MAPK以及PI3K/AKT信號通路[17],進而導致炎性因子的大量釋放引起心肌損傷。因此TLR4作為各傳導通路的共同上游信號通路,標志著TLR4可能成為有效治療膿毒性心肌病的新靶點。TLR4抑制劑作為治療某些疾病的藥物,糾正TLR4信號通路過度激活的主要方法有3種:包括下調(diào)TLR4的表達;直接與髓樣分化復合物2(MD2)結(jié)合抑制TLR4信號通路;直接與TLR4或TLR4/MD2復合物結(jié)合抑制TLR4活性[18]。在研究TLR4抑制劑干預膿毒癥的相關作用機制方面,國內(nèi)外學者均做了大量的工作。Selfridge等[19]設計了一些納曲酮衍生物,構效關系表明,用納曲酮可以顯著提高TLR4的抑制活性。劉新強等[20]通過實驗得出TLR4抑制劑E5564可通過與TLR4結(jié)合并抑制其與LPS的結(jié)合,阻斷LPS-TLR4信號通路的激活,進而減輕心臟炎性反應,改善心功能。楊夢等[21]提出TLR4特異性抑制劑TAK-242是通過抑制TLR4/NF-κB通路的激活,從而減輕膿毒癥大鼠肝臟的炎性反應。Achek等[22]在小鼠實驗中證實磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)通過特異性結(jié)合TLR4上的MD2結(jié)合位點,從而抑制TLR4/MD2復合物的形成,進一步抑制LPS誘導的多種促炎因子的產(chǎn)生。

LPS常用于建立以心室擴張、左心室射血分數(shù)降低和心功能不全為特征的膿毒癥模型。本研究發(fā)現(xiàn),LPS處理組(SIC組+干預組)小鼠血清cTnI、CK-MB、BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高,且與TLR4、NF-κB蛋白表達呈正相關。經(jīng)TLR4特異性抑制劑TAK-242干預后,上述損傷標志物及炎性因子較SIC組均明顯下降,進一步證實了該型抑制劑可通過下調(diào)TLR4、NF-κB蛋白表達有效降低心肌損傷標志物以及炎性因子的釋放,進而改善心功能。

綜上所述,TLR4抑制劑干預可改善LPS所致的心肌損傷,其機制推測與其下調(diào)TLR4/NF-κB信號通道蛋白表達從而抑制炎性反應相關。因此TLR4作為治療膿毒性心肌病一個重要的靶點,設計和開發(fā)針對這一靶點的抑制性藥物具有很高的治療潛力。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

陳詩陽:設計研究方案,實施研究過程,撰寫論文;王曉景:提出研究思路,設計研究方案;董玉杰:協(xié)作實施研究過程;張美春:提出研究方向、研究選題,論文審核