凌雪輝,許文杰,秦勇,王楓

腦卒中因其高發(fā)病率、高殘疾/病死率、高復(fù)發(fā)率等特點成為嚴重危害我國居民生命健康的慢性非傳染性疾病[1]。急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)占腦卒中的69.6%～70.8%,主要因腦血管閉塞導(dǎo)致局部腦血液灌注中斷引起[2],目前患者預(yù)后仍然較差[3-4]。準(zhǔn)確評估ACI患者預(yù)后對促進其預(yù)后改善非常重要。炎性反應(yīng)在ACI發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[5]。研究表明,微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)能通過調(diào)控炎性反應(yīng)參與ACI發(fā)生發(fā)展[6]。miR-22-3p是一個炎性相關(guān)miRNA,能通過調(diào)控多種靶基因抑制炎性反應(yīng)[7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-22-3p與ACI患者免疫浸潤相關(guān)[8]。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)是一種炎性小體,能通過促進促炎細胞因子釋放參與炎性反應(yīng)過程[9]。實驗發(fā)現(xiàn)NLRP3在ACI小鼠腦組織中高表達[10]。本研究擬探討ACI患者血清miR-22-3p、NLRP3水平與炎性因子及預(yù)后不良的關(guān)系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年1月—2022年12月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治ACI患者106例為ACI組,女46例,男60例,年齡33～81(59.61±8.85)歲;另選取同期體檢健康者60例為健康對照組,女26例,男34例,年齡18～73(57.13±12.67)歲;2組人員性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021-02-034),全部受試者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①有完整的臨床和隨訪資料;②符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)[11];③接受靜脈溶栓或血管內(nèi)治療或聯(lián)合靜脈溶栓。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①已知明顯出血傾向、嚴重活動性出血、既往顱內(nèi)出血病史;②既往腦部手術(shù)史或近3個月內(nèi)腦外傷史;③惡性腫瘤;④院內(nèi)死亡;⑤有嚴重的心、肝、腎功能不全;⑥合并自身免疫性疾病;⑦年齡<18歲;⑧妊娠及哺乳期婦女;⑨合并血液系統(tǒng)疾病。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-22-3p水平檢測:收集ACI患者治療前和健康對照組體檢時空腹肘靜脈血3 ml,離心留存血清。部分血清使用TRIzol試劑盒(購自北京簡石生物技術(shù)有限公司,貨號TR205)提取總RNA,取部分樣本使用紫外分光光度儀器(購自日本日立公司,型號 3900H)鑒定純度和完整性合格后。剩余RNA使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自賽默飛世爾科技公司,貨號 4366597)逆轉(zhuǎn)錄為cRNA,再使用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(購自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司,型號 CFX96 Touch)按照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(購自上海捷瑞生物工程有限公司,貨號 GK0221)說明書進行檢測。miR-22-3p上游引物5’-ATGGCATAATCCGGGTGCAA-3＇、下游引物5’-TGTCGCAGATCCAGTCTGATG-3＇;內(nèi)參U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3＇、下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3＇;反應(yīng)總體積共25 μl,cDNA 1 μl、上下游引物各1 μl、2×Hieff?PCR Master Mix 10 μl、去離子水7 μl;循環(huán)參數(shù):95℃ 5min 1次,94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s,共計40次。以2-ΔΔCT法計算血清miR-22-3p相對表達量。

1.3.2 血清NLRP3、炎性因子水平檢測:剩余血清采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(購自北京伊塔生物科技有限公司,貨號 YK-06198、YK-00656、YK-00504、YK-00440)檢測NLRP3和炎性因子[白介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]水平。

1.3.3 資料收集:收集ACI患者性別、年齡、吸煙、飲酒、合并癥、梗死部位、Org 10172在急性腦卒中治療中的試驗(TOAST)分型[12]、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)[13]、收縮壓、舒張壓、血糖、血脂四項、血紅蛋白、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)等資料。

1.3.4 隨訪和分組:通過門診或電話對患者出院后隨訪3個月,使用改良Rankin量表評估預(yù)后,總分值0～6分,≥3分表示預(yù)后不良[14]。根據(jù)改良Rankin量表評分將ACI患者分為預(yù)后不良亞組和預(yù)后良好亞組。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-22-3p、NLRP3和炎性因子水平比較 ACI組血清miR-22-3p水平低于健康對照組,血清NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α水平高于健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 ACI組與健康對照組血清miR-22-3p、NLRP3和炎性因子水平比較Tab.1 Comparison of serum levels of miR-22-3p, NLRP3 and inflammatory factors between the ACI group and the healthy control group

2.2 ACI患者血清miR-22-3p、NLRP3與炎性因子水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示,血清miR-22-3p與NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α水平均呈負相關(guān)(r=-0.733、-0.719、-0.683、-0.680,P均<0.001),血清NLRP3與IL-1β、IL-18、TNF-α水平均呈正相關(guān)(r=0.716、0.715、0.707,P均<0.001)。

2.3 2亞組ACI患者血清miR-22-3p、NLRP3及臨床資料比較 隨訪3個月,106例ACI患者預(yù)后不良37例(34.91%)。 預(yù)后不良亞組患者年齡大于預(yù)后良好亞組,血管內(nèi)治療或聯(lián)合靜脈溶栓比例、NIHSS評分、IL-1β、IL-18、TNF-α、NLRP3水平高于預(yù)后良好亞組,miR-22-3p水平低于預(yù)后良好亞組(P<0.01),2亞組患者性別、吸煙、飲酒、合并癥、梗死部位、TOAST分型、血脂、血壓、血糖、白細胞、血小板、淋巴細胞、中性粒細胞計數(shù)等資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 預(yù)后不良亞組和預(yù)后良好亞組ACI患者臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data of ACI patients with poor prognosis and good prognosis

2.4 ACI患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析 以ACI患者預(yù)后情況(賦值:不良=1,良好=0)為因變量,以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量,建立多因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示:NIHSS評分高、IL-1β高、IL-18高、TNF-α高、NLRP3升高為ACI患者預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05),miR-22-3p升高為保護因素(P<0.05),見表3。

表3 ACI患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of poor prognosis of ACI patients

2.5 血清miR-22-3p、NLRP3水平預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的價值 繪制血清miR-22-3p、NLRP3水平預(yù)測ACI患者預(yù)后不良價值的ROC曲線,并計算AUC,結(jié)果顯示:血清miR-22-3p、NLRP3水平聯(lián)合預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的AUC為0.875,大于血清miR-22-3p、NLRP3水平單獨預(yù)測的0.786、0.759(Z=2.405、2.517,P=0.016、0.012),見表4和圖1。

圖1 血清miR-22-3p、NLRP3水平預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的ROC曲線Fig.1 ROC curves of serum miR-22-3p and NLRP3 levels predicting poor prognosis in ACI patients

表4 血清miR-22-3p、NLRP3水平對ACI患者預(yù)后不良的預(yù)測價值Tab.4 Predictive value of serum miR-22-3p and NLRP3 levels in poor prognosis of ACI patients

3 討 論

ACI是顱內(nèi)供血動脈血栓閉塞導(dǎo)致的局限性腦組織缺血、缺氧或壞死并引起相應(yīng)神經(jīng)癥狀的急性腦血管疾病,及時恢復(fù)受損腦組織供血和挽救尚未死亡的神經(jīng)組織是改善ACI患者神經(jīng)功能的重要治療目的[11]。近年來隨著藥物、技術(shù)和材料的改進,ACI患者靜脈溶栓或血管內(nèi)治療后預(yù)后得以顯著改善,但仍有部分患者因ACI后缺血再灌注損傷、血腦屏障破壞、凝血功能紊亂等原因?qū)е律窠?jīng)損傷加重,進而降低預(yù)后[4,15]。本組ACI患者預(yù)后不良發(fā)生率為34.91%,與王麗香等[16]報道的36.74%接近,說明ACI患者預(yù)后不良發(fā)生率較高。

炎性反應(yīng)貫穿ACI發(fā)生發(fā)展全過程,在ACI發(fā)病初期炎性反應(yīng)能損傷血管內(nèi)皮促進動脈粥樣硬化和血栓形成,導(dǎo)致ACI發(fā)生;ACI發(fā)病后炎性反應(yīng)又能加劇神經(jīng)損傷、缺血再灌注損傷、血腦屏障破壞等導(dǎo)致患者預(yù)后降低[5]。IL-1β、IL-18、TNF-α是ACI病理過程中常見的促炎細胞因子,本研究結(jié)果顯示,IL-1β、IL-18、TNF-α升高為ACI患者預(yù)后不良的獨立危險因素,說明炎性反應(yīng)增強會降低ACI患者預(yù)后,符合上述研究報道。miRNA是一種非編碼小RNA,能通過結(jié)合靶基因3'-非翻譯端抑制蛋白質(zhì)翻譯,負向調(diào)控靶基因表達進而參與ACI炎性反應(yīng)過程[17]。miR-22-3p定位于人染色體9q34.3,最初研究發(fā)現(xiàn)miR-22-3p能特異性抑制內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng),因而近年來多項研究報道了miR-22-3p的抗炎作用,如miR-22-3p能靶向高遷移率族蛋白B1/ Toll樣受體4/核因子-κB信號通路,進而緩解膿毒癥誘導(dǎo)的腎細胞炎性反應(yīng)[18];miR-22-3p還能靶向上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1減輕鉛誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞炎性反應(yīng)[19]。同時Zhang等[20]實驗指出,上調(diào)miR-22-3p能抑制ACI大鼠神經(jīng)細胞IL-1β、IL-18表達,進而改善腦缺血/再灌注損傷。本研究結(jié)果也顯示,ACI患者血清miR-22-3p與IL-1β、IL-18、TNF-α水平呈負相關(guān)?；诖送茰ymiR-22-3p可能通過炎性反應(yīng)影響ACI患者預(yù)后。本研究結(jié)果顯示,ACI患者血清miR-22-3p水平降低,miR-22-3p水平升高是ACI患者預(yù)后不良的獨立保護因素,說明血清miR-22-3p水平升高能降低ACI患者預(yù)后不良風(fēng)險。其原因可能是miR-22-3p水平升高能通過靶向多種基因抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)和血腦屏障破壞,縮小梗死面積并增強神經(jīng)細胞活性,進而改善ACI患者預(yù)后[21]。

NOD樣受體是真核生物免疫細胞感知危險的主要途徑,機體在免疫反應(yīng)起始階段能通過NOD樣受體等損傷相關(guān)模式分子介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)過程[22]。NLRP3是NOD樣受體家族研究最多的成員,主要表達于皮膚、眼睛、肝、腎、肺、結(jié)腸等,在被炎性反應(yīng)等危險信號分子或病原體激活后能募集前體半胱氨酸蛋白酶-1聚集形成NLRP3炎性小體,促進IL-1β、IL-18、TNF-α等炎性因子成熟和分泌,促進炎性反應(yīng)發(fā)展和細胞炎性壞死(細胞焦亡)[23-25]。蔣潔等[26]實驗報道,抑制NLRP3表達能抑制炎性反應(yīng),進而改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能。王麗軒等[27]研究指出,血清NLRP3水平與ACI患者惡性腦水腫發(fā)生獨立相關(guān)。同時本研究結(jié)果顯示,ACI患者血清NLRP3與IL-1β、IL-18、TNF-α水平呈正相關(guān)。因此推測NLRP3可能通過炎性反應(yīng)影響ACI患者預(yù)后。本研究結(jié)果顯示,血清NLRP3水平升高是ACI患者預(yù)后不良的獨立危險因素,說明血清NLRP3水平升高會增加ACI患者預(yù)后不良風(fēng)險。其原因可能是NLRP3水平升高能通過內(nèi)外源性損傷相關(guān)分子模式完成自身組裝活化,促進IL-1β、IL-18、TNF-α等炎性因子分泌,加劇神經(jīng)炎性反應(yīng)和血腦屏障破壞,導(dǎo)致預(yù)后不良風(fēng)險增加[28-29]。

本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),ACI患者血清miR-22-3p與NLRP3水平呈負相關(guān),提示miR-22-3p和NLRP3可能共同影響ACI患者預(yù)后。最近李利超等[30]實驗也報道,上調(diào)miR-22-3p能靶向下調(diào)NLRP3抑制腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞炎性壞死,進一步佐證了本研究結(jié)果。此外本研究結(jié)果還顯示,NIHSS評分升高反映神經(jīng)缺損更嚴重,故預(yù)后更差。通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),血清miR-22-3p、NLRP3水平為0.89、152.84 ng/L時,預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的AUC分別為0.786、0.759;血清miR-22-3p、NLRP3水平聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.875,大于miR-22-3p、NLRP3單獨預(yù)測。說明檢測血清miR-22-3p、NLRP3水平有助于ACI患者預(yù)后預(yù)測,且聯(lián)合檢測血清miR-22-3p、NLRP3水平能提升預(yù)測價值。但本研究結(jié)果還需多中心研究進一步驗證。

綜上所述,血清miR-22-3p水平降低和NLRP3水平升高與ACI患者炎性因子水平升高有關(guān),是預(yù)后不良的獨立危險因素。血清miR-22-3p、NLRP3水平預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的價值較高,可能成為ACI患者預(yù)后不良的輔助預(yù)測指標(biāo)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

凌雪輝:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;許文杰:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;秦勇:資料搜集整理,進行統(tǒng)計學(xué)分析;王楓:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核