羅昕驍,邱妮,趙殊藝,何武書,肖晨亮,徐路,肖玉鴻

口腔癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,中國2022年口腔癌新發(fā)病例和死亡病例分別為31 733例、15 745例[1]。目前口腔癌患者病死率仍然較高[2],早期評(píng)估口腔癌預(yù)后轉(zhuǎn)歸很有必要。研究表明,DNA甲基化和生物力學(xué)信號(hào)改變?cè)诳谇话┌l(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[3-4]。賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶,能通過去甲基化作用啟動(dòng)或抑制基因轉(zhuǎn)錄以參與腫瘤過程[5]。壓電型機(jī)械敏感離子通道組件1(piezo-type mechanosensitive ion channel component 1,PIEZO1)是一種感應(yīng)力學(xué)信號(hào)蛋白,能通過改變生物力學(xué)信號(hào)改變細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[6]。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道,LSD1和PIEZO1在口腔癌細(xì)胞中異常表達(dá)[7-8]?，F(xiàn)分析口腔癌組織中LSD1、PIEZO1表達(dá)與患者病理特征和預(yù)后轉(zhuǎn)歸關(guān)系,旨在為口腔癌預(yù)后評(píng)估提供參考,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性選取2013年1月—2018年3月聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院口腔外科收治的口腔癌患者113例,男73例, 女40例;年齡27～72 (60.68±8.63)歲,≥60歲79例、<60歲34例;病理類型:鱗狀細(xì)胞癌105例,其他類型8例;腫瘤大小:>3 cm 61例,≤3 cm 52例;分化程度:低分化51例,中高分化62例;浸潤深度:>5 mm 41例,≤5 mm 72例;TNM分期[9]:Ⅰ～Ⅱ期75例,Ⅲ期38例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移82例。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1) 納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥18歲;②接受根治或姑息性切除;③經(jīng)術(shù)后病理診斷為口腔癌。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并口腔扁平苔蘚、牙周炎等其他口腔疾病;②入院前已接受放化療等抗腫瘤治療;③自身免疫疾病或合并其他部位惡性腫瘤;④急慢性感染或合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器損害;⑤精神疾病;⑥拒絕隨訪;⑦病歷資料不完整。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 LSD1、PIEZO1檢測:收集術(shù)中部分口腔癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣>3 cm),常規(guī)固定、脫水、透明、切片、脫蠟后。磷酸緩沖鹽溶液修復(fù),抗原加入一抗LSD1(1∶150)、PIEZO1(1∶100)和磷酸緩沖鹽溶液(對(duì)照),4℃孵育過夜,后將對(duì)應(yīng)二抗滴入載玻片孵育60 min。切片顯色、染色,滴加鹽酸酒精溶液分化組織切片,返藍(lán)后用梯度酒精、二甲苯干燥透明,最后用中性樹脂封閉切片。使用奧林巴斯生物倒置顯微鏡(型號(hào) APX100)觀察LSD1、PIEZO1表達(dá)情況。

1.3.2 口腔癌組織和癌旁組織免疫組織化學(xué)評(píng)分、陽性細(xì)胞比評(píng)價(jià):無陽性細(xì)胞(0分)、陽性細(xì)胞比<10%(1分)、陽性細(xì)胞比10%～<51%(2分)、陽性細(xì)胞比51%～80%(3分)、陽性細(xì)胞比>80%(4分);細(xì)胞染色強(qiáng)度:無著色(0分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。二者乘積0～2分為陰性,>2分為陽性[10]。

1.3.3 隨訪預(yù)后轉(zhuǎn)歸:患者術(shù)后通過門診復(fù)診、電話、互聯(lián)網(wǎng)等方法隨訪,統(tǒng)計(jì)患者生存情況,隨訪截至2023年3月。根據(jù)口腔癌組織LSD1、PIEZO1表達(dá)情況分為LSD1陽性表達(dá)組、LSD1陰性表達(dá)組,PIEZO1陽性表達(dá)組、PIEZO1陰性表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS 28.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn);Kaplan-Meier法繪制口腔癌患者生存曲線,組間生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn);多因素Cox回歸分析影響口腔癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 口腔癌組織與癌旁組織LSD1、PIEZO1表達(dá)比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,LSD1、PIEZO1陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)?？谇话┙M織LSD1、PIEZO1陽性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.01),見表1和圖1。

圖1 口腔癌組織與癌旁組織LSD1、PIEZO1免疫組化染色(×200)Fig.1 Immunohistochemical staining of LSD1 and PIEZO1 in oral cancer tissue and adjacent tissues

表1 口腔癌組織與癌旁組織LSD1、PIEZO1陽性表達(dá)比較 [例(%)]Tab.1 Comparison of LSD1 and PIEZO1 Positive Expressions in Oral Cancer and Paracancerous Tissues

2.2 口腔癌組織LSD1、PIEZO1表達(dá)在不同臨床/病理特征中差異比較 LSD1、PIEZO1在分化程度低、浸潤深度>5 mm、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中陽性表達(dá)率升高(P<0.05),而在不同性別、年齡、病理類型、腫瘤大小的口腔癌患者中陽性表達(dá)率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 不同臨床病理特征患者口腔癌組織LSD1、PIEZO1陽性表達(dá)比較Tab.2 Comparison of LSD1 and PIEZO1 positive expression in oral cancer tissues of patients with different pathological characteristics

2.3 口腔癌組織LSD1、PIEZO1表達(dá)與生存率的關(guān)系 隨訪5年,113例口腔癌患者失訪5例,死亡49例,5年總生存率為56.64%(64/113)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,LSD1陽性表達(dá)組(59例)、PIEZO1陽性表達(dá)組(52例)5年總生存率為42.37%(25/59)、42.31%(22/52),分別低于LSD1陰性表達(dá)組(54例)72.22%(39/54)、PIEZO1陰性表達(dá)組(61例)68.85%(42/61),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=12.097、9.795,P=0.001、0.002),見圖2。

圖2 LSD1、PIEZO1陽性/陰性表達(dá)口腔癌患者Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Kaplan Meier survival curve of oral cancer patients with positive/negative expression of LSD1 and PIEZO1

2.4 影響口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的Cox回歸分析 以影響口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸為因變量(賦值:是為“1”;否為“0”),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示:低分化、浸潤深度>5 mm、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和LSD1、PIEZO1陽性表達(dá)為影響口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表3。

表3 影響口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的Cox回歸分析Tab.3 Cox regression analysis on the prognostic outcomes of oral cancer patients

3 討 論

口腔癌是起源于口腔黏膜上皮的惡性腫瘤,臨床中90%以上為鱗狀細(xì)胞癌,其發(fā)病可能與口腔衛(wèi)生差、病毒感染、吸煙、飲酒、口腔黏膜相關(guān)病變、環(huán)境等因素有關(guān)[11]。截至目前,根治性切除手術(shù)仍然是早期口腔癌最有效的治療方法,盡管近年來其早期診斷率有所提升,但臨床中仍有超過60%的口腔癌患者為初診晚期,失去最佳治療時(shí)機(jī),5年生存率僅40%～50%[12]。雖然近年來部分免疫、靶向藥物被用于口腔癌治療,但由于口腔癌具有高度異質(zhì)性、侵襲性和轉(zhuǎn)移性,仍有部分患者難以獲得較好臨床效益[13-14]。因此,有必要確定更多口腔癌預(yù)后轉(zhuǎn)歸生物標(biāo)志物,以指導(dǎo)臨床干預(yù)和改善患者預(yù)后。

口腔癌的發(fā)生發(fā)展是多因素和多機(jī)制共同作用的過程,表觀遺傳改變?cè)谄渲邪l(fā)揮重要作用[15]。DNA甲基化是哺乳動(dòng)物調(diào)控基因表達(dá)的主要表觀遺傳學(xué)形式,能通過阻礙轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控序列結(jié)合、阻礙甲基CpG結(jié)合蛋白結(jié)合到甲基化CpG位點(diǎn)、阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方式抑制基因表達(dá),進(jìn)而參與口腔癌發(fā)生發(fā)展[3]。LSD1是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑,又稱BHC110、AOF2、KDM1A,能通過其高度保守結(jié)構(gòu)域中黃素腺嘌呤二核苷氧化作用,特異性催化組蛋白第三亞基4/9號(hào)賴氨酸的單甲基化和二甲基的去甲基化,直接或間接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性和穩(wěn)定性,其異常表達(dá)與癌基因或抑癌基因異常表達(dá)密切相關(guān)[16]。近年來多項(xiàng)研究報(bào)道了LSD1與惡性腫瘤的關(guān)系,如LSD1在乳腺癌中高表達(dá),能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Slug誘導(dǎo)的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[17];LSD1在甲狀腺癌中高表達(dá),能通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α促進(jìn)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活,進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展[18]。已有學(xué)者報(bào)道,LSD1在口腔癌中高表達(dá),并影響口腔癌細(xì)胞惡性進(jìn)展[7],同時(shí)有學(xué)者指出,LSD1高表達(dá)與卵巢癌、胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)[19-20],因此推測LSD1可能影響口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸。本研究結(jié)果顯示,口腔癌組織LSD1陽性表達(dá)率升高,與上述研究報(bào)道結(jié)果相符[7]。結(jié)果還顯示,LSD1在分化程度低、浸潤深度>5 mm、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中陽性表達(dá)率升高,提示LSD1參與口腔癌發(fā)生發(fā)展。分析原因LSD1升高能上調(diào)核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基α2表達(dá),激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路,加速腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力等作用,促進(jìn)口腔癌發(fā)生發(fā)展[21]。此外LSD1還能抑制免疫細(xì)胞浸潤,以阻礙宿主免疫對(duì)口腔癌細(xì)胞的清除能力,并促進(jìn)口腔癌細(xì)胞免疫逃逸,導(dǎo)致口腔癌發(fā)生發(fā)展[16,22]。

生物力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)是指流體剪切力、牽拉力、擠壓力、基質(zhì)硬度等力學(xué)刺激改變細(xì)胞生物學(xué)功能,將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)或生物信號(hào)的過程,異常的生物力學(xué)信號(hào)會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)等促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。機(jī)械敏感性離子通道是細(xì)胞表面將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為生物力學(xué)信號(hào)的機(jī)械感受器,PIEZO1是組成機(jī)械敏感性離子通道的成孔狀亞基單位,受力學(xué)刺激激活后可開放離子通道,讓帶正電的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),以產(chǎn)生相應(yīng)的生化反應(yīng)[23]?；赑IEZO1對(duì)生物力學(xué)信號(hào)的重要作用,近年來多項(xiàng)研究也報(bào)道了其與惡性腫瘤的關(guān)系,如PIEZO1在卵巢癌中高表達(dá),能激活河馬/yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein,YAP)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[24]。PIEZO1在前列腺癌中高表達(dá),能激活原癌基因Src/YAP軸促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[25]。有學(xué)者報(bào)道,抑制PIEZO1能抑制口腔癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[8]。同時(shí)有學(xué)者指出,PIEZO1高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良有關(guān)[26]。然而關(guān)于PIEZO1與口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系尚未可知。本研究結(jié)果顯示,口腔癌組織PIEZO1陽性表達(dá)率升高,符合上述研究報(bào)道結(jié)果[8]。結(jié)果還顯示,PIEZO1在分化程度低、浸潤深度>5 mm、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中陽性表達(dá)率更高,提示PIEZO1參與口腔癌的發(fā)生發(fā)展。分析其原因可能與PIEZO1高表達(dá)激活了YAP信號(hào)有關(guān)。YAP是應(yīng)力刺激的轉(zhuǎn)錄共激活因子,也是介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要致癌基因,應(yīng)力刺激下YAP激活能放大機(jī)械信號(hào)以進(jìn)一步激活自身,進(jìn)而激活促癌信號(hào)通路和增強(qiáng)癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、侵襲等能力促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。PIEZO1高表達(dá)能傳導(dǎo)生物力學(xué)信號(hào)激活YAP信號(hào),進(jìn)而促進(jìn)口腔癌細(xì)胞惡性進(jìn)展[27]。

本研究通過隨訪分析發(fā)現(xiàn),LSD1陽性表達(dá)組、PIEZO1陽性表達(dá)組5年總生存率低于LSD1陰性表達(dá)組、PIEZO1陰性表達(dá)組,且LSD1陽性表達(dá)、PIEZO1陽性表達(dá)為影響口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。說明口腔癌組織LSD1、PIEZO1表達(dá)還與口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。

綜上所述,LSD1、PIEZO1在口腔癌組織中高表達(dá),與分化程度、浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),是口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可能成為口腔癌患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸評(píng)估的生物標(biāo)志物。但本研究結(jié)果還需多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

羅昕驍、何武書:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫,研究構(gòu)思,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;邱妮、趙殊藝:提出研究思路,課題設(shè)計(jì),分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;肖晨亮、徐路、肖玉鴻:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改,論文撰寫