周鈺杰,楊芳,嚴(yán)晶,錢政,馬鴻旭

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,2020年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)1 931 590例、死亡935 173例,中國新發(fā)病例數(shù)555 477例、死亡286 162例,已成為嚴(yán)重危害我國及全球人民生命健康的公共衛(wèi)生問題[1]。盡管近年來結(jié)直腸癌的診治取得一定進展,但患者預(yù)后仍然較差,早期結(jié)直腸癌5年生存率可達90%,晚期5年生存率僅15%[2]。因此研究結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響相關(guān)因素非常重要。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在結(jié)直腸癌進程中扮演重要角色[3]。研究報道[4],miR-330-5p在結(jié)直腸癌組織和細胞中低表達;同時有學(xué)者指出[5],miR-330-5p與胃癌患者預(yù)后有關(guān)。多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1(polypyrimidine tract binding protein 1,PTBP1)是一種RNA結(jié)合蛋白,能通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝、免疫等影響腫瘤進展[6]。研究報道[7],PTBP1在結(jié)直腸癌細胞中高表達;同時PTBP1表達與非小細胞肺癌患者預(yù)后有關(guān)[8]。但關(guān)于miR-330-5p、PTBP1對結(jié)直腸癌的臨床意義尚缺乏研究報道,基于此本研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年5月南通市中醫(yī)院肛腸科收治結(jié)直腸癌患者101例,男59例、女42例;年齡22～75歲,≥60歲49例、<60歲52例。根據(jù)miR-330-5p、PTBP1 mRNA在結(jié)直腸癌組織表達均值分為高/低表達組。術(shù)中收集部分癌組織及其癌旁組織,存于液氮中。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥18歲;②經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌[9];③TNM分期Ⅰ～Ⅲ期[10]。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①不具備手術(shù)指征;②合并其他惡性腫瘤或入院前已接受任何抗腫瘤治療;③合并急慢性感染;④臨床資料不完整或不能接受隨訪;⑤合并克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等其他腸道疾病。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 miR-330-5p、PTBP1 mRNA水平檢測:液氮下碾磨組織標(biāo)本,使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供的TRIzol試劑盒(編號 R401-01)提取總RNA,分光度計測定純度合格后(吸光度260/280比值1.8～2.0),寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司提供的Takara試劑盒(編號 RR037B)逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(條件:42℃ 30 min,85℃ 5 min)。以互補DNA為模板,按照實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,編號 11202ES08]說明書進行擴增,反應(yīng)體系:Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 10 μl、上下游引物各0.4 μl、模板DNA 5 μl、無菌超純水加至總體積25 μl;擴增程序:95℃ 5 min、95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s,共計40次。獲取循環(huán)閾值(cycle threshold,CT),2-ΔΔCT法計算組織miR-330-5p、PTBP1 mRNA相對表達量。miR-330-5p上游引物5′-TCTCTGGGCCTGTGTCTTAGGC-3′、下游引物5′-CTAAGACACAGCCCAGAGATT-3′;U6上游引物5′-GAGCAGAAACATAAGCTGT-3′、下游引物5′-GCAGAAACATAAGCTGTGG-3′;PTBP1上游引物5′-CTCAACCTCTACATTATACCTAA-3′、下游引物5′-CCTAGGGACCCTGGTATGGATC-3′;GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′、下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.3.2 隨訪情況:結(jié)直腸癌患者出院后隨訪3年(電話或門診6個月1次),隨訪至患者死亡或2023年5月,統(tǒng)計總生存率。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織miR-330-5p、PTBP1 mRNA表達比較 結(jié)直腸癌組織miR-330-5p表達為(0.57±0.11),低于癌旁組織(1.00±0.15);PTBP1 mRNA表達為(1.50±0.20),高于癌旁組織(0.95±0.18)(t=24.000、19.233,P均<0.001)。

2.2 結(jié)直腸癌組織miR-330-5p與PTBP1 mRNA表達的相關(guān)性 經(jīng)Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示,miR-330-5p與PTBP1存在結(jié)合位點,見圖1;Pearson相關(guān)性分析顯示,結(jié)直腸癌組織miR-330-5p與PTBP1 mRNA表達呈負相關(guān)(r=-0.679,P<0.001)。

圖1 miR-330-5p與PTBP1結(jié)合位點Fig.1 Binding sites of miR-330-5p to PTBP1

2.3 結(jié)直腸癌組織miR-330-5p與PTBP1 mRNA表達在不同臨床病理參數(shù)中比較 不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小中結(jié)直腸癌組織miR-330-5p、PTBP1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與低分化程度、TNM Ⅲ期 、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化程度、TNMⅠ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織miR-330-5p升高、PTBP1 mRNA表達降低比較(P<0.05或P<0.01),見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織miR-330-5p與PTBP1 mRNA表達在不同臨床病理參數(shù)中差異比較Tab.1 Comparison of differences in miR-330-5p and PTBP1 mRNA expression in colorectal cancer tissues under different clinical and pathological parameters

2.4 結(jié)直腸癌組織miR-330-5p、PTBP1 mRNA表達與總生存率的關(guān)系 101例結(jié)直腸癌患者高/低miR-330-5p表達分別57例、44例,高/低PTBP1 mRNA表達分別45例、56例。隨訪結(jié)束,有4例失訪,17例死亡,3年總生存率為82.47%(80/97) 。K-M生存曲線分析顯示,miR-330-5p高表達組(≥0.57)3年總生存率91.23%(52/57)高于低表達組(<0.57)的72.73%(32/44)(Log-rankχ2=6.466,P=0.011);PTBP1 mRNA高表達組(≥1.50)3年總生存率68.89%(31/45)低于低表達組(<1.50)的94.64%(53/56)(Log-rankχ2=11.697,P=0.001),見圖2。

圖2 高/低miR-330-5p、PTBP1 mRNA表達結(jié)直腸癌患者K-M生存曲線Fig.2 K-M survival curve of colorectal cancer patients with high/low miR-330-5p and PTBP1 mRNA expression

2.5 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 以隨訪時間為時間變量,影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后為因變量(賦值:死亡/存活=1/0),性別(賦值:男/女=1/0)、年齡(賦值:≥60歲/<60歲=1/0)、腫瘤位置(賦值:結(jié)腸/直腸=1/0)、腫瘤直徑(賦值:≥5 cm/<5 cm=1/0)、分化程度(賦值:低分化/中高分化=1/0)、TNM分期(賦值:Ⅲ期/Ⅰ～Ⅱ期=1/0)、miR-330-5p(賦值:≥0.57/<0.57=1/0)、PTBP1 mRNA(賦值:≥1.50/<1.50=1/0)為自變量,進行多因素Cox回歸模型分析。結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌患者死亡的獨立危險因素為低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和PTBP1 mRNA≥1.50,獨立保護因素為miR-330-5p≥0.57(P<0.05),見表2。

表2 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Tab.2 Cox regression analysis of multiple factors affecting the prognosis of colorectal cancer patients

3 討 論

結(jié)直腸癌發(fā)病可能與環(huán)境、遺傳、生活飲食習(xí)慣、藥物使用等有關(guān),83%的結(jié)直腸癌患者在初診時處于中晚期,失去最佳治療時機[11-12]。盡管近年來免疫、靶向藥物有助于改善晚期結(jié)直腸癌預(yù)后,但由于晚期結(jié)直腸癌極易發(fā)生多部位轉(zhuǎn)移,其臨床獲益有限,且隨著治療時間延長獲得性耐藥愈發(fā)嚴(yán)重,導(dǎo)致患者總體預(yù)后仍然較差[13-14]。研究結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響機制,對指導(dǎo)治療措施制定和促進預(yù)后改善意義重大。

非編碼RNA能通過調(diào)控表觀遺傳機制改變參與惡性腫瘤過程,miRNA作為一種單鏈非編碼RNA,能通過靶基因互補配對降解或抑制mRNA翻譯,進而調(diào)控結(jié)直腸癌進程[3]。miR-330-5p定位于人染色體19q13.32,是一個與腫瘤密切相關(guān)的miRNA,如miR-330-5p能靶向CCHC型鋅指核酸結(jié)合蛋白抑制黑色素瘤細胞生長和侵襲[15];miR-330-5p能靶向單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4促進膀胱癌糖酵解和細胞生長[16]。實驗報道,上調(diào)miR-330-5p能抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡[4]。另有研究指出,miR-330-5p與宮頸癌、三陰性乳腺癌患者預(yù)后有關(guān)[17-18]。因此筆者推測miR-330-5p可能影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后。本結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織miR-330-5p表達下調(diào),與不良病理特征有關(guān),符合上述研究結(jié)果,說明miR-330-5p低表達參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。分析其機制可能是miR-330-5p表達降低會導(dǎo)致Wnt/β-連環(huán)蛋白、絲裂原活化蛋白激酶1信號通路激活,上調(diào)多種原癌基因,從而促進結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲[19-20]。

RNA結(jié)合蛋白PTBP1定位于人染色體19q13.3,不僅能調(diào)控mRNA翻譯、穩(wěn)定性等加工過程影響腫瘤進程,還能作為剪接因子結(jié)合靶基因前體mRNA的特定序列產(chǎn)生不同mRNA亞型,進而通過Warburg效應(yīng)、細胞周期、運動、分化、凋亡和免疫等促進惡性腫瘤進展[21]。如PTBP1能正向調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、己糖激酶2和乳酸脫氫酶A等糖酵解酶表達,促進胃癌細胞生長和耐藥[22];抑制PTBP1能抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,降低黑色素瘤細胞增殖活性和遷移、侵襲能力[23];抑制PTBP1能促進肺腺癌細胞免疫浸潤,進而抑制肺腺癌細胞增殖和遷移[24]。實驗報道,下調(diào)PTBP1能抑制結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移與侵襲[7]。有研究指出,PTBP1與胃癌、骨肉瘤患者預(yù)后有關(guān)[25]。因此推測PTBP1可能影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后。本結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織PTBP1 mRNA表達上調(diào),與不良病理特征有關(guān),說明PTBP1 mRNA高表達參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。分析其機制可能與PTBP1 mRNA高表達能增強結(jié)直腸癌細胞能量代謝、細胞周期進展、上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫逃逸,進而促進結(jié)直腸癌惡性進展有關(guān)[6,21]。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-330-5p與PTBP1存在結(jié)合位點,且二者在結(jié)直腸癌組織中表達呈負相關(guān),提示miR-330-5p與PTBP1可能共同參與結(jié)直腸癌進展。王磊等[26]報道,上調(diào)miR-330-5p能靶向抑制PTBP1促進結(jié)腸癌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),miR-330-5p高表達患者3年總生存率升高,可降低結(jié)直腸癌患者死亡風(fēng)險,PTBP1 mRNA高表達患者3年總生存率降低,會增加結(jié)直腸癌患者死亡風(fēng)險。這說明miR-330-5p、PTBP1 mRNA表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān),有望成為患者預(yù)后潛在指標(biāo)。但本研究結(jié)果還有待進一步分析。

綜上所述,miR-330-5p低表達和PTBP1 mRNA高表達可能共同參與結(jié)直腸癌組織進展,與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

周鈺杰:提出研究思路,實施研究過程,分析試驗數(shù)據(jù),統(tǒng)計學(xué)分析,論文撰寫,論文審核;楊芳:設(shè)計研究方案,實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;嚴(yán)晶:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核,課題設(shè)計;錢政:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;馬鴻旭:統(tǒng)計學(xué)分析