王瀟然,陸巍,于欣,王永杰,王勇,廉吉虎,李震霄,宋海濤

前列腺癌(prostate cancer,PC)是男性常見惡性腫瘤,2018年全球PC新發(fā)病例達128萬例,死亡36萬例[1]。目前PC的臨床治療策略包括等待觀察、根治性切除術及根治性放療等[2]。PC治療方式不當、治療不足或治療過度均會嚴重影響患者生活質(zhì)量及死亡率。因此,有必要探索能夠評估PC預后的腫瘤標志物。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(neuregulin-1,NRG1)是一種細胞膜表面糖蛋白,介導細胞—細胞信號傳導,在器官系統(tǒng)的分化發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用[3]。近年來發(fā)現(xiàn),由于DNA結(jié)構(gòu)重排導致NRG基因融合,引起NRG蛋白表達升高,能夠促進肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,是潛在的腫瘤標志物及治療靶點[4]。人表皮生長因子受體3(human epidermal growth factor receptor 3,HER3)屬于受體酪氨酸激酶家族成員,能夠與表皮生長因子結(jié)合形成異二聚體,激活下游信號傳導,導致膀胱癌、乳腺癌細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移[5-6]。目前,PC中NRG1、HER3的表達及臨床意義報道較少。本研究通過免疫組化檢測PC中NRG1、HER3的表達,探討兩者與臨床病理特征及預后的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年2月—2020年2月吉林省人民醫(yī)院泌尿外科診治PC患者96例,年齡45～79(63.15±6.19)歲,病程3天～2個月;既往史:有吸煙史44例,高血壓史24例,糖尿病史9例;術前前列腺特異抗原(prostate specific antigen,PSA)≥20 μg/L者51例,<20 μg/L者45例;采用Gleason評分系統(tǒng)進行病理分級,>7分者39例,≤7分者57例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期60例,Ⅲ期36例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(2023045),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①均接受根治性手術,術后病理明確為PC;②初次治療,無內(nèi)分泌治療及放療等;③體能狀況良好,KPS評分>80分;④臨床資料完整。(2)排除標準:①預期壽命<10年;②合并其他惡性腫瘤;③術前盆腔CT、MR檢查或ECT提示存在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處器官轉(zhuǎn)移;④合并嚴重慢性基礎疾病,不能耐受手術或麻醉。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 NRG1、HER3檢測:留取術中獲取的PC癌組織和癌旁組織,常規(guī)10%中性甲醛固定12 h,石蠟包埋,切片層厚5 μm,65℃烤片2 h。免疫組化染色步驟按照試劑盒(北京中杉金橋公司,貨號SAP9100)說明書進行。NRG1、HER3單克隆抗體購自美國Abcam公司,貨號ab217805、ab255607。DAB顯色5 min,蘇木素復染5 min,鹽酸酒精分化5 s,中性樹脂封片。日本奧林巴斯公司CX31型顯微鏡下(200倍)隨機選取5個視野,行半定量染色評分。染色強度:細胞內(nèi)未見染色評0分,淺黃色或黃色評1分,棕黃色評2分。陽性細胞數(shù)目占總細胞數(shù)目的百分比:≤25%評0分,26%～50%評1分,≥51%評2分。上述兩項評分乘積<2分定義為陰性,≥2分評為陽性。

1.3.2 隨訪:PC患者出院后開始隨訪,采用門診和電話方式進行,術后第1年每1～3個月隨訪1次,以后每3～6個月隨訪1次,隨訪內(nèi)容包括體格檢查、血清PSA、盆腔MR等。記錄患者有無復發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡等。腫瘤進展定義為隨訪過程中連續(xù)2次檢測血清PSA>0.2 μg/L(生化復發(fā))、腫瘤局部臨床復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移或患者死亡。無進展生存時間為自確診至發(fā)生腫瘤進展的時間。隨訪截止至2023年3月1日,隨訪終點為腫瘤進展或隨訪結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示,比較采用χ2檢驗;Pearson卡方檢驗分析NRG1、HER3表達與臨床病理特征的關系;Kaplan-Meier法對PC患者無進展生存率進行分析,繪制生存曲線;多因素Cox風險回歸模型進行多因素預后分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織中NRG1、HER3表達情況 PC癌組織中NRG1、HER3棕黃色陽性染色定位于細胞漿和細胞膜。PC癌組織中NRG1、HER3陽性率分別為78.13%(75/96)、75.00%(72/96),高于癌旁組織NRG1、HER3陽性率6.25%(6/96)、8.33%(8/96),差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=101.670,87.771,P均<0.001),見圖1。

圖1 PC患者癌和癌旁組織中NRG1、HER3表達(免疫組化染色,×200)Fig.1 Expression of NRG1 and HER3 in cancer and adjacent tissues of PC patients (immunohistochemistry, × 200)

2.2 癌組織NRG1、HER3表達在PC患者不同臨床病理特征中比較 TNM分期Ⅲ期、Gleason評分>7分及術前PSA水平≥20 μg/L患者癌組織中NRG1、HER3陽性率分別大于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、Gleason評分≤7分及術前PSA水平<20 μg/L,差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 PC癌組織中NRG1陽性、HER3陽性表達在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]Tab.1 Comparison of NRG1 positive and HER3 positive expression in different clinical and pathological characteristics in PC cancer tissues

2.3 癌組織NRG1、HER3表達對PC患者預后的影響 96例PC患者隨訪中失訪2例,進展26例,3年無進展生存率為72.92%(70/96)。NRG1陽性組和陰性組3年無進展生存率分別為68.00%(51/75)、90.48%(19/21),HER3陽性組和陰性組3年無進展生存率分別為66.67%(48/72)、91.67%(22/24)。NRG1陽性組、HER3陽性組3年累積無進展生存率分別低于NRG1陰性組、HER3陰性組,差異均有統(tǒng)計學意義(Log-rankχ2/P=4.267/0.039,5.499/0.019),見圖2。

圖2 Kaplan-Meier曲線分析癌組織NRG1、HER3表達對PC患者預后的影響Fig.2 Kaplan Meier curve analysis of the impact of NRG1 and HER3 expression in cancer tissue on the prognosis of PC patients

2.4 多因素Cox回歸分析影響PC患者預后的因素 以PC患者預后為因變量(1=進展,0=未進展,t=時間),納入年齡(1=≥60歲,0=<60歲)、吸煙史(1=有,0=無)、TNM分期(1=Ⅲ期,0=Ⅰ～Ⅱ期)、Gleason評分(1=>7分,0=≤7分)、術前PSA(1=≥20 μg/L,0=<20 μg/L)、NRG1(1=陽性,0=陰性)、HER3(1=陽性,0=陰性)為自變量,進行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示:TNM分期Ⅲ期、Gleason評分>7分、術前PSA≥20 μg/L、 NRG1陽性、HER3陽性是影響PC患者預后的獨立危險因素(P<0.01),見表2。

表2 PC患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型分析Tab.2 Multivariate Cox proportional risk regression model analysis for the prognosis of PC patients

3 討 論

PC是中國男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,人口標化發(fā)病率為6.59/10萬,人口標化病死率為2.61/10萬[7]。PSA是早期篩查PC最常用的血清標志物,在PC早期診斷及預后風險分層評估中具有重要的參考價值[8]。但PSA具有前列腺器官特異性但并非前列腺癌特異性生物標志物,其表達水平不僅在前列腺增生、前列腺炎等前列腺良性疾病中均可升高,還受到直腸指檢、射精及導尿等因素的影響[9]。因此,有必要積極探索PC的疾病機制,尋找能夠預測PC臨床轉(zhuǎn)歸的生物標志物。

NRG1編碼基因位于人類8號染色體,編碼產(chǎn)生的NRG1蛋白在結(jié)構(gòu)上具有表皮生長因子結(jié)構(gòu)域,膜結(jié)合形式蛋白能水解為游離形式[10]。研究發(fā)現(xiàn),NRG1能結(jié)合和激活周圍細胞表面的HER3和HER4,活化下游Yes相關蛋白、絲裂原活化蛋白激酶信號通路,發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖的效應[11]。本研究中,PC癌組織中NRG1表達升高,與不良臨床病理特征有關,表明NRG1能促進PC腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PC中NRG1的表達升高與NRG1基因重排及腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關成纖維細胞分泌NRG1增多有關。有研究報道,肺癌、腎癌及前列腺癌等惡性腫瘤中均存在NRG1基因重排的現(xiàn)象,引起NRG1的異常表達上調(diào),NRG1與其他融合伴侶包括CD74、SDC4等形成融合蛋白,激活磷脂酰肌醇3激酶/AKT信號通路,促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。另外,PC腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關成纖維細胞也能夠分泌產(chǎn)生NRG1,NRG1能通過旁分泌途徑,結(jié)合激活相鄰PC腫瘤細胞表面的HER3受體,促進腫瘤過度增殖[13]。本研究中,NRG1陽性PC患者無進展生存預后較差,提示NRG1是新的評估PC預后的腫瘤標志物。筆者分析,一方面是NRG1的表達升高能夠增加腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,術中難以徹底切除腫瘤微小病灶,造成術后復發(fā)或轉(zhuǎn)移。另一方面,NRG1陽性的PC腫瘤細胞術后抗雄激素治療耐藥性較強,腫瘤術后容易復發(fā)。有學者在PC小鼠模型和前列腺癌類器官培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),腫瘤相關成纖維細胞能夠分泌產(chǎn)生NRG1,能夠誘導PC腫瘤細胞抗雄激素治療的耐藥性形成及雄激素抵抗的發(fā)生,予以NRG1抗體進行治療,則能夠重新恢復PC腫瘤細胞對抗雄激素治療的敏感性[13]。因此,NRG1的表達上調(diào)促進PC腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可能是新的評估PC預后的腫瘤標志物。

HER3是表皮生長因子受體家族第三成員,由于HER3缺乏關鍵催化殘基不能催化其他激酶,既往認為是其他家族成員的信號傳導底物[14]。近年來發(fā)現(xiàn),HER3激酶區(qū)域具有變構(gòu)激活功能,能夠與HER2形成異源二聚體,促進HER2陽性乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移[15]。本研究中,PC癌組織中HER3表達升高,與不良臨床病理特征有關,提示HER3促進PC的腫瘤發(fā)生發(fā)展。PC中HER3的表達上調(diào)與紅細胞凝集素的表達調(diào)控有關。研究發(fā)現(xiàn),紅細胞凝集素能夠以自分泌的方式促進HER3的表達及磷酸化激活,促進PC腫瘤細胞中磷脂酰肌醇3激酶/Akt信號通路的過度活化,導致腫瘤惡性增殖[16]。Lee等[17]報道,G蛋白偶聯(lián)受體也可通過反式激活HER3,進一步活化絲裂原活化蛋白激酶及蛙皮素受體,促進腫瘤惡性增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥性形成。本研究中,HER3陽性PC患者預后較差,表明檢測PC癌組織中HER3的表達有助于評估患者臨床預后。分析其原因,HER3陽性的PC腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移能力較強,腫瘤細胞對抗雄激素等藥物治療的耐藥性較強,導致患者不良預后。研究表明,腫瘤中HER2/HER3異源二聚體的形成能夠降低腫瘤細胞對帕妥珠單抗治療的敏感性,促進腫瘤腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生[18]。有研究證實,HER3特異性抑制劑或靶向HER3的抗體藥物偶聯(lián)物U3-1402均能夠顯著抑制去勢抵抗性前列腺癌腫瘤類器官的惡性增殖和轉(zhuǎn)移[19]。本研究中,PC癌組織中NRG1和HER3表達呈顯著正相關,表明PC中兩者存在協(xié)同促癌的作用。這與既往研究發(fā)現(xiàn)的NRG1能夠結(jié)合并激活HER3,然后HER3與HER2形成異源二聚體,激活下游增殖信號通路的報道結(jié)果一致[13, 20]。因此,以NRG1/HER3為靶點的治療是潛在的PC治療方案,值得臨床深入研究。

綜上所述,PC癌組織中NRG1、HER3表達升高,NRG1,HER3表達與Gleason評分、TNM分期及術前PSA水平有關,均參與PC的腫瘤進展。NRG1陽性、HER3陽性PC患者的無進展生存預后較差,是影響PC患者無進展生存預后的獨立危險因素,是新的PC預后相關腫瘤標志物。本研究也存在一定的局限,本研究樣本量及隨訪時間有限,并且未能對NRG1、HER3的具體作用機制進行實驗研究,有待今后進行深入的基礎和臨床研究進一步探索。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王瀟然、陸巍:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;于欣、王永杰:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;王勇、廉吉虎:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;李震霄:進行統(tǒng)計學分析;宋海濤:論文撰寫