曾妮,高芳芳,王愛(ài)華,陳應(yīng)超,盧嶺,李鵬程

隨著對(duì)喉癌發(fā)病機(jī)制研究深入,基因水平的標(biāo)志物在喉癌病情及預(yù)后中因敏感度及特異度高而更具有臨床價(jià)值[1-2]。miR-552具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等功能,與多種惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制、病情及預(yù)后密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-552通過(guò)靶向p53基因而促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[4]。熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α,HSP90α)與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān),在多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著升高,可作為病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物[5]。研究發(fā)現(xiàn)喉癌患者血清HSP90α蛋白表達(dá)顯著升高,可提高喉癌診斷的敏感度及特異度[6]。目前miR-552及HSP90α與喉癌臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性尚未明確,本研究對(duì)此進(jìn)行探討,為提高喉癌的臨床診療水平提供客觀證據(jù),報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2017年1月武漢市第三醫(yī)院耳鼻喉科診治的喉癌患者87例為研究對(duì)象(LGC組),另選擇同期喉良性疾病患者(聲帶息肉、慢性喉炎等)45例為對(duì)照(非LGC組),LGC組和非LGC組患者在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(Eastern cooperative oncology group,ECOG)評(píng)分、吸煙史、糖尿病、高血壓及家族史等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),具有可比性,見(jiàn)表1。本研究經(jīng)武漢市第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(YLL071),全部患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 非LGC組和LGC組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between non LGC group and LGC group patients

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、病理組織學(xué)檢查等確診為喉癌;(2)首次起病,既往無(wú)喉癌相關(guān)病史,未行手術(shù)、放療、化療等相關(guān)治療;(3)可配合本研究,隨訪過(guò)程中無(wú)脫落;(4)臨床病理資料完整;(5)預(yù)計(jì)生存期≥6個(gè)月,ECOG評(píng)分≤3分。排除標(biāo)準(zhǔn):排除合并嚴(yán)重心腦肺血管疾病、其他喉部良惡性腫瘤、神經(jīng)精神疾病、嚴(yán)重肝腎功能異常等。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 組織miR-552和HSP90α表達(dá)檢測(cè):2組患者均行電子喉鏡檢查取病灶活檢組織, 存于液氮中待后續(xù)檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)檢測(cè)miR-552和HSP90α表達(dá),檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司(批號(hào)分別為20150623、20150418)。提取活檢組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR擴(kuò)增(美國(guó)ABI公司,型號(hào)為HT 7500),miR-552上游引物5’-GTTTAACCTTTTGCCTGTTGG-3’,下游引物5’-CGAACGCTTCACGAATTTG-3’;HSP90α上游引物5’-CTAGTTAATGCTGCGGACAACA-3’,下游引物5’-CATTTCGACCACCTGTCACTT-3’。反應(yīng)體系25 μl,反應(yīng)條件為:50℃孵育20 min,95℃預(yù)變性1 min;56℃退火1 min,65℃延伸擴(kuò)增45 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán),最后一輪72℃反應(yīng)8 min。HSP90α選擇β-actin為內(nèi)參,miR-552選擇U6為內(nèi)參,采用2-△△ct法分別計(jì)算miR-552和HSP90α相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 隨訪情況:LGC組患者每3個(gè)月隨訪1次(電話或門診),隨訪內(nèi)容包括生存狀況、預(yù)后狀況,隨訪時(shí)間終點(diǎn)為2023年1月,統(tǒng)計(jì)患者生存期及預(yù)后狀況(存活或死亡)。

2 結(jié) 果

2.1 2組組織miR-552和HSP90α表達(dá)比較 LGC組患者miR-552和HSP90α表達(dá)高于非LGC組患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 LGC組和非LGC組患者miR-552和HSP90α表達(dá)比較Tab.2 Patients in the LGC and non LGC groups miR-552 and HSP90 α Expression comparison

2.2 組織miR-552和HSP90α表達(dá)在不同臨床病理因素中的差異 LGC組患者miR-552和HSP90α在性別、年齡、腫瘤部位和病理組織學(xué)類型方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),低分化、腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者miR-552和HSP90α表達(dá)高于中—高分化、腫瘤最大徑<3 cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 LGC組患者miR-552和HSP90α表達(dá)在不同臨床病理因素中比較Tab.3 LGC group patients miR-552 and HSP90 α Comparison of expression in different clinical pathological factors

2.3 組織miR-552及HSP90α表達(dá)預(yù)測(cè)喉癌患者死亡效能 繪制miR-552及HSP90α表達(dá)預(yù)測(cè)喉癌患者死亡效能的ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:miR-552、HSP90α及二項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)喉癌患者死亡效能的AUC分別為0.812、0.806、0.925,二項(xiàng)聯(lián)合的AUC最大(Z/P=4.218/0.009、4.416/0.007),見(jiàn)表4、圖1。

圖1 miR-552和HSP90α 預(yù)測(cè)喉癌患者死亡ROC曲線Fig.1 miR-552 and HSP90 α Predicting the ROC curve for mortality in laryngeal cancer patients

表4 miR-552和HSP90α預(yù)測(cè)喉癌患者死亡的效能分析Tab.4 miR-552 and HSP90 α Efficiency analysis of predicting mortality in laryngeal cancer patients

2.4 喉癌患者死亡危險(xiǎn)因素分析 以喉癌患者死亡為因變量(賦值:是為“1”;否為“0”),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,miR-552≥1.7(賦值:<1.7=0,≥1.7=1)、HSP90α≥0.8(賦值:<0.8=0,≥0.8=1)、腫瘤分化程度低(賦值:中—高分化=0,低分化=1)、腫瘤最大徑≥3 cm(賦值:<3 cm=0,≥3 cm=1)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值:無(wú)=0,有=1)、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期(賦值:Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ+Ⅳ期=1)為喉癌死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 喉癌患者死亡多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of mortality in laryngeal cancer patients

2.5 miR-552和HSP90α與喉癌生存關(guān)系 LGC組患者隨訪至隨訪終點(diǎn)時(shí)死亡64例,存活23例。miR-552≥1.7且HSP90α≥0.8的喉癌患者中位生存期為(31.6±5.4)月,短于miR-552<1.7且HSP90α<0.8患者的(38.3±6.1)月 (Log-rank=7.412,P=0.003)。

3 討 論

miR-552為位于染色體1p34.3上的小非編碼RNA,其表達(dá)水平在多種惡性腫瘤的組織或細(xì)胞中顯著上調(diào)。miR-552可以靶向多個(gè)基因,這些靶基因在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞遷移和侵襲等生物過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。miR-552可與細(xì)胞色素P450家族2亞家族E成員1(CYP2E1)形成DNA-RNA雜交體并調(diào)節(jié)CYP2E1的表達(dá),從而抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。Han等[7]發(fā)現(xiàn)miR-552調(diào)節(jié)肝臟腫瘤起始細(xì)胞擴(kuò)張和索拉非尼耐藥。miR-552抑制Wnt抑制因子1(WIF1)的表達(dá),并可調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期,miR-552誘導(dǎo)的WIF1表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少,G1期細(xì)胞數(shù)量增加,從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[3]。張明等[8]發(fā)現(xiàn)miR-552-3p通過(guò)抑制Dachshund家族轉(zhuǎn)錄因子1(DACH1)促進(jìn)肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-552在卵巢癌、喉癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),與臨床病理因素密切相關(guān)[4,9]?；谀壳暗难芯窟M(jìn)展,推測(cè)miR-552在惡性腫瘤中具有促癌基因功能。本研究中,喉癌患者miR-552表達(dá)顯著高于喉良性疾病患者,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān),證實(shí)miR-552與喉癌發(fā)病機(jī)制及臨床病理因素存在關(guān)聯(lián)。

HSP90α作為分子伴侶主要參與蛋白質(zhì)新生肽鏈的正確折疊及穩(wěn)定性,在惡性腫瘤細(xì)胞中維持多種促癌基因相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性,并抑制抑癌基因的蛋白合成,在細(xì)胞周期、增殖侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)行為中具有重要調(diào)控作用[10- 11]。腫瘤細(xì)胞在應(yīng)對(duì)熱刺激及氧缺乏等應(yīng)激反應(yīng)時(shí),熱休克因子1會(huì)從與HSP90、共伴侶蛋白p23和含有TPR結(jié)構(gòu)域的免疫親和素形成的抑制復(fù)合物中釋放出來(lái),同時(shí)會(huì)三聚化遷移入核與HSP90上游的熱休克元件結(jié)合而誘導(dǎo)HSP90的表達(dá)[12-13]。HSP90α在腫瘤中主要為促癌作用,通過(guò)促進(jìn)促癌基因相關(guān)蛋白表達(dá)及抑制降解而參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[14]。崔翠蓮等[15]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中HSP90水平異常增高且與病情及預(yù)后相關(guān),在非小細(xì)胞肺癌的診斷及鑒別診斷中具有一定價(jià)值。劉斌等[16]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)檢測(cè)HSP90α較CA125在胰腺癌臨床分期中具有更高的特異度及敏感度。張芬等[6]檢測(cè)喉癌患者血清HSP90α蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)HSP90α水平顯著升高,可作為喉癌診斷的標(biāo)志物。本研究檢測(cè)喉癌患者HSP90α表達(dá),發(fā)現(xiàn)HSP90α表達(dá)顯著升高且與臨床病理因素、死亡及生存期密切相關(guān),提示HSP90α與喉癌病情及預(yù)后密切相關(guān)。

目前喉癌患者病情及預(yù)后評(píng)估主要依賴于MR檢查及術(shù)后病理組織學(xué)TNM分期,存在敏感度、特異度低及普適性差等缺點(diǎn),尤其不適用于無(wú)法行根治手術(shù)取得病理標(biāo)本的進(jìn)展期喉癌患者,不依賴于術(shù)后病理標(biāo)本的檢測(cè),可能更具有臨床價(jià)值[17]。隨著對(duì)喉癌發(fā)病機(jī)制的深入研究及基因檢測(cè)水平的提高,基因水平標(biāo)志物在喉癌病情及預(yù)后評(píng)估中可能具有更高的敏感度及特異度而更具有臨床應(yīng)用價(jià)值[18-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-552和HSP90α在多種惡性腫瘤中水平顯著升高且與病情及預(yù)后相關(guān),可作為多種病情及預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物[20-22]?；谀壳暗难芯考氨狙芯堪l(fā)現(xiàn)推測(cè)miR-552和HSP90α可能在喉癌病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值。本研究中,miR-552聯(lián)合HSP90α預(yù)測(cè)喉癌患者死亡的效能較高,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-552≥1.7、HSP90α≥0.8、腫瘤分化程度低分化、腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期為喉癌死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,miR-552≥1.7且HSP90α≥0.8喉癌患者中位生存期顯著縮短,表明miR-552和HSP90α在喉癌預(yù)后不良預(yù)測(cè)中具有重要價(jià)值,miR-552聯(lián)合HSP90α檢測(cè)可提高敏感度及特異度,臨床上應(yīng)密切檢測(cè)喉癌患者miR-552和HSP90α,為喉癌診療決策制定提供客觀證據(jù)。

綜上所述,喉癌患者miR-552和HSP90α顯著升高,與臨床病理因素及預(yù)后密切相關(guān),在喉癌患者病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要臨床價(jià)值,可作為喉癌病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物,但本研究為單中心研究且臨床病例較少,喉癌患者miR-552和HSP90α與臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性亟需大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

曾妮:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程;高芳芳:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;王愛(ài)華:實(shí)施研究過(guò)程,論文修改;陳應(yīng)超:資料搜集整理;盧嶺:分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);李鵬程:課題設(shè)計(jì),論文撰寫,論文審核