董杰,楊松,肖俊,李鵬程

基因水平的標(biāo)志物檢測在胃癌病情及預(yù)后評估中更具有臨床價值,其敏感度及特異度高于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA199等)、影像學(xué)及病理組織學(xué)TNM分期,但需要多個標(biāo)志物聯(lián)合檢測以提高特異度及敏感度[1-2]。剪接因子3b亞基4(splicing factor 3b subunit 4,SF3B4)具有調(diào)控前體mRNA剪接及3’端加工等功能,在卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)且與惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[3-4]。微小RNA-96(miR-96)可靶向多個基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)miR-96可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲,為潛在的胃癌病情及預(yù)后評估標(biāo)志物[7]。目前SF3B4、miR-96在胃癌病情及預(yù)后評估中的臨床價值尚未明確。本研究旨在檢測胃鏡活檢組織SF3B4及miR-96表達(dá)并研究其臨床價值,為胃癌臨床診療策略制定提供基因水平證據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1—12月洪湖市人民醫(yī)院和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院診治的胃癌患者95例為研究對象(胃癌組)。另以同期胃良性疾病(包括胃良性潰瘍、慢性胃炎、胃息肉等)患者60例為非胃癌組。2組患者在性別、年齡、美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分(總分0～5分,評分越高表示一般狀況越差)、體表面積、幽門螺桿菌(HP)感染方面比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核及批準(zhǔn)(YXLL-073),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 非胃癌組及胃癌組患者臨床病理資料比較Tab.1 Comparison of clinical and pathological data between non gastric cancer group and gastric cancer group patients

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)入選標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)增強(qiáng)CT、普通胃鏡、超聲胃鏡和/或術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診;②首次確診,既往無胃癌病史且未行相關(guān)治療;③臨床資料完整,有明確的臨床TNM(cTNM)分期。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他良惡性腫瘤、嚴(yán)重心肺血管病及其他胃良惡性腫瘤等;②胃繼發(fā)性腫瘤、胃癌復(fù)發(fā)等;③合并精神神經(jīng)疾病;④隨訪脫訪者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 組織SF3B4、miR-96表達(dá)檢測:胃癌組患者行胃鏡活檢取腫瘤組織及癌旁組織,非胃癌組患者取病變組織。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測胃癌組腫瘤組織、癌旁組織、非胃癌組病變組織SF3B4及miR-96表達(dá)。SF3B4上游引物序列5’-GGATGAGAAGGTTAGTGAACCGC-3’,下游引物序列5’-GGCATAGTCAGCATCTTCCTCAC-3’,miR-96上游引物序列5’-CTCGAGTCCTTGAAGGTCATCTTGGGCT-3’,下游引物序列5’-GCGGCCGCAGGCAGTGTAAGGCGATCT-3’。引物由上海生工公司合成純化。RT-qPCR檢測試劑購自大連Takara公司(產(chǎn)品名稱Titanium One-Step RT-PCR Kit,批號639503),PCR儀器為美國安捷倫公司(儀器型號為Mx3000),反應(yīng)體系25 μl,反應(yīng)條件為:52℃孵育20 min,94℃預(yù)變性1 min;58℃退火1 min,64℃延伸擴(kuò)增40 s,共計32個循環(huán),最后一輪72℃反應(yīng)8 min。SF3B4選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,miR-96選擇U6為內(nèi)參,采用2-△△ct計算SF3B4及miR-96相對表達(dá)量。

1.3.2 患者預(yù)后及隨訪調(diào)查:胃癌組患者每3個月電話或門診隨訪1次,隨訪時間至2023年5月,隨訪內(nèi)容包括血常規(guī)、肝腎功能、影像學(xué)檢查。統(tǒng)計患者預(yù)后狀況(隨訪終點時死亡或存活、總生存期),其中隨訪1年時出現(xiàn)死亡、腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤進(jìn)展、嚴(yán)重并發(fā)癥(腸梗阻、惡病質(zhì)、胃嚴(yán)重出血)等定義為1年預(yù)后不良。

2 結(jié) 果

2.1 組織SF3B4、miR-96表達(dá)比較 胃癌組腫瘤組織SF3B4、miR-96表達(dá)均高于癌旁組織及非胃癌組病灶組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。胃癌組癌旁組織與非胃癌組病灶組織SF3B4、miR-96表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 胃癌組和非胃癌組患者SF3B4、miR-96表達(dá)比較Tab.2 Comparison of SF3B4 and miR-96 expression between gastric cancer group and non gastric cancer group patients

2.2 組織SF3B4、miR-96表達(dá)在不同臨床資料中的比較 胃癌組腫瘤組織SF3B4、miR-96表達(dá)在性別、年齡、HP感染、腫瘤部位、CEA、CA199、病理類型方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 而在腫瘤低分化、腫瘤最大直徑≥5 cm、T3-4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及cTNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者SF3B4及miR-96表達(dá)顯著高于腫瘤中-高分化、腫瘤最大直徑<5 cm、T1-2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及cTNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者(P均<0.01),見表3。

表3 不同臨床病理資料中胃癌組腫瘤組織SF3B4、miR-96表達(dá)比較Tab.3 Comparison of SF3B4 and miR-96 expression in tumor tissues of gastric cancer in different clinical and pathological data

2.3 組織SF3B4、miR-96表達(dá)預(yù)測胃癌1年預(yù)后不良的價值分析 繪制SF3B4、miR-96表達(dá)預(yù)測胃癌1年預(yù)后不良價值的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:SF3B4、miR-96及二者聯(lián)合預(yù)測胃癌1年預(yù)后不良的AUC分別為0.785、0.779、0.952,二者聯(lián)合優(yōu)于單獨預(yù)測效能(Z/P=3.451/0.017、3.565/0.014),見表4。

表4 SF3B4、miR-96預(yù)測胃癌1年預(yù)后不良的價值分析Tab.4 Value analysis of SF3B4 and miR-96 in predicting 1-year poor prognosis of gastric cancer

2.4 胃癌患者1年預(yù)后不良的死亡危險多因素Logistic回歸分析 以胃癌患者1年預(yù)后不良死亡(賦值:存活=0,死亡=1)為因變量,以SF3B4、miR-96、腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、cTNM分期為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:SF3B4≥1.51(賦值:<1.51=0,≥1.51=1)、miR-96≥1.28(賦值:<1.28=0,≥1.28=1)、腫瘤分化程度低(賦值:中-高分化=0,低分化=1)、腫瘤最大直徑≥5 cm(賦值:<5 cm=0,≥5 cm=1)、腫瘤浸潤深度T3-4(賦值:T1-2=0,T3-4=1)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值:無=0,有=1)、cTNM分期Ⅲ～Ⅳ期(賦值:Ⅰ～Ⅱ期=0,Ⅲ～Ⅳ期=1)為胃癌死亡的獨立危險因素(P<0.01),見表5。

表5 胃癌患者1年預(yù)后不良的死亡危險多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of mortality risk for gastric cancer patients with poor 1-year prognosis

2.5 SF3B4、miR-96表達(dá)與胃癌生存期關(guān)系 胃癌患者95例隨訪至終點時存活36例,死亡59例。SF3B4≥1.51且miR-96≥1.28胃癌患者中位生存期(23.7±5.4)個月低于SF3B4<1.51或miR-96<1.28患者(31.2±6.5)個月(Log-rank=11.457,P<0.001)。

3 討 論

mRNA前體的剪接及成熟對基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)具有決定作用,SF3B4為U2小核糖核蛋白復(fù)合物的核心組成部分,其功能異?？蓪?dǎo)致基因表達(dá)異常而導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[8]。SF3B4基因與SF3B145結(jié)合后可調(diào)控U2 snRNP與前體mRNA分支位點的結(jié)合,參與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程[9]。研究發(fā)現(xiàn)SF3B4對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移具有調(diào)控作用,在多種惡性腫瘤中可檢測到SF3B4表達(dá)異常,為潛在的病情及預(yù)后評估標(biāo)志物[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)SF3B4基因與胃癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān),多種基因通過調(diào)控SF3B4基因誘導(dǎo)的自噬信號通路參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[12-13]。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)SF3B4 通過促進(jìn) KLF 16 mRNA 從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)來促進(jìn) Twist1 表達(dá)和透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌進(jìn)展。Ge等[15]研究發(fā)現(xiàn)GPAA1通過與RNA結(jié)合蛋白SF3B4結(jié)合促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn)SF3B4可通過調(diào)控凋亡信號通路、自噬等通路參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃鏡活檢腫瘤組織SF3B4顯著高于癌旁組織及胃良性疾病患者病灶組織,證實SF3B4與胃癌發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

胃癌的發(fā)病機(jī)制包括miRNA及相關(guān)基因表達(dá)異常,miRNA為內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,主要是通過降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá),在細(xì)胞增殖、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[17]。越來越多的研究證實胃癌中存在多個miRNA表達(dá)異常,與惡性程度、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān),在胃癌病情及預(yù)后評估中具有重要價值[18-19]。miR-96具有調(diào)控糖脂代謝等功能,同時通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,在多種惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制、病情及預(yù)后評估中具有重要價值[20-21]。劉麗丹等[22]檢測胃癌組織miR-96表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-96在胃癌中顯著升高,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、TNM分期、分化程度相關(guān)。文俏程等[23]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA TP53TG1通過miR-96/TPM1軸調(diào)控胃癌細(xì)胞對氟尿嘧啶的耐藥性。王慶麗[24]采用RT-qPCR檢測胃癌細(xì)胞和腫瘤組織中miR-96表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-96呈高表達(dá)狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃鏡活檢腫瘤組織SF3B4顯著高于癌旁組織及胃良性疾病患者病灶組織,表明miR-96與胃癌發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

目前胃癌病情及預(yù)后評估常用的方法包括蛋白水平的腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢查及病理組織TNM分期等,其中腫瘤標(biāo)志物存在敏感度及特異度低等缺點,影像學(xué)檢查受檢查機(jī)器及閱片醫(yī)生經(jīng)驗水平的影響,TNM分期依賴于術(shù)后病理組織學(xué)而不適用于無法取得病理組織患者,故胃鏡活檢組織的基因水平標(biāo)志物可能更具有臨床價值[25-26]。目前胃癌病情及預(yù)后評估標(biāo)志物的檢測多為血清檢測及術(shù)后病理組織標(biāo)本,前者存在敏感度低缺點,而后者存在普適性差等缺點,無法在術(shù)前提供客觀證據(jù),胃鏡活檢組織檢測不依賴于術(shù)后病理組織學(xué)標(biāo)本,可在術(shù)前提供檢測標(biāo)本,普適性更廣及敏感度更高而更具有臨床價值[27]。本研究中胃癌患者SF3B4、miR-96表達(dá)顯著升高,與腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、cTNM分期及預(yù)后密切相關(guān),表明SF3B4、miR-96可作為胃癌病情及預(yù)后評估的標(biāo)志物。

目前胃癌病情及預(yù)后評估標(biāo)志物的檢測多采用血清或病理組織標(biāo)本檢測,單個蛋白水平和基因水平的檢測指標(biāo)因其缺乏組織特異性而導(dǎo)致其敏感度及特異度低,臨床上可通過多項指標(biāo)聯(lián)合檢測以提高敏感度及特異度[28-29]。本研究中,SF3B4、miR-96預(yù)測胃癌1年預(yù)后不良敏感度、特異度、AUC均高于腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、cTNM分期(P<0.05),SF3B4聯(lián)合miR-96預(yù)測胃癌1年預(yù)后不良敏感度、特異度、AUC均高于SF3B4、miR-96單獨預(yù)測(P<0.05),這些證據(jù)表明胃鏡活檢組織SF3B4、miR-96預(yù)測胃癌預(yù)后不良效能高于傳統(tǒng)的檢測指標(biāo),SF3B4聯(lián)合miR-96檢測可顯著提高敏感度及特異度,在胃癌的臨床診療過程中應(yīng)密切監(jiān)測SF3B4、miR-96以調(diào)整治療方案。

綜上所述,胃癌患者SF3B4及miR-96表達(dá)顯著升高,與腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、預(yù)后密切相關(guān),可作為胃癌病情及預(yù)后評估的標(biāo)志物,兩者聯(lián)合檢測時可提高預(yù)測胃癌預(yù)后不良的敏感度及特異度。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

董杰:實施研究過程;楊松:統(tǒng)計學(xué)分析,分析試驗數(shù)據(jù),論文修改;肖俊:資料搜集整理;李鵬程:課題設(shè)計,論文撰寫,論文審核