潘延樂

(宜賓市翠屏區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 宜賓 644000)

在養(yǎng)魚業(yè)中，傳染性造血器官壞死病(IHN)是發(fā)病率較高的疾病之一。隨著進(jìn)口虹鱒和養(yǎng)殖鱒魚行業(yè)的發(fā)展，可能會(huì)導(dǎo)致傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)的傳播。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)已將其納入《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》，在我國(guó)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》將其列二類動(dòng)物疫病，是一種必須要上報(bào)的動(dòng)物疫病。

一、背景

四川省雅安市龍倉(cāng)溝某養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)了一場(chǎng)疾病，病魚及瀕死魚體重0.3～1.12 克。在暴發(fā)期間，大約有7 萬尾魚死亡。收集典型的臨床癥狀，并加冰送至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚類疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，以確定病因。

二、實(shí)驗(yàn)室診斷

1.臨床癥狀 發(fā)病虹鱒表現(xiàn)出體色發(fā)黑、精神不振或無規(guī)則亂沖亂撞、肛門處拖著不透明或棕褐色的假管狀黏液糞便(圖1)。經(jīng)解剖觀察發(fā)現(xiàn)：病魚的肝、脾、腸等部位出現(xiàn)彌漫性充血(圖2)。

圖1 病魚體色發(fā)黑，肛門部位掛著一些不透明或者呈棕褐色的類管狀黏性排泄物

圖2 病魚的肝、脾、腸等部位出現(xiàn)彌漫性充血

IHN的臨床體征包括臟器內(nèi)有嚴(yán)重的瘀點(diǎn)和瘀斑出血，腹水中有血，肝和鰓呈蒼白色，癥狀是拖著一長(zhǎng)串糞便。IHNV 在32℃或更高的溫度下容易滅活，因此不會(huì)對(duì)鳥類和哺乳動(dòng)物構(gòu)成健康風(fēng)險(xiǎn)。

2.組織病理學(xué)診斷 取具典型癥狀的發(fā)病魚制作組織病理切片，H.E染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在頭腎實(shí)質(zhì)大面積變性、壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3A)，在發(fā)病魚的上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可形成嗜酸性包涵體(圖3B)。

圖3 發(fā)病魚的上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可形成嗜酸性包涵體

3.PCR檢測(cè) 參照williams K的方法合成核衣殼蛋白基因引物(Williams K,1999)，引物序列F:GTTCAACTTCAACGCCAACAGG， R:TGAAGTACCCCACCCCGAGCATCC，該引物由上海生物工程有限公司合成。對(duì)發(fā)病明顯的魚，無菌采集其肝臟、脾臟、腎臟和腸道組織，按照TRIzol 試劑盒操作說明快速提取RNA。然后使用PrimeScriptTMRT 試劑盒說明書完成總RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)流程。PCR 反應(yīng)體系為Mix-reaction buffer 12.5 微升，上下游引物各0.5 微升(10 微摩爾/升)，加入cDNA 2 微升(10 納克/微升) 作為模板，9.5 微升dd H 2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 分鐘；94℃變性1 分鐘，55℃退火1 分鐘，72℃延伸1 分鐘，共30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 分鐘。接著，從擴(kuò)增后的產(chǎn)物中取5微升，加入到事先制好的1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓為220伏，于凝膠成像系統(tǒng)觀察分析PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖4)。結(jié)果顯示在患病虹鱒的肝臟、脾臟、腎臟、腸道組織均擴(kuò)增出一條特異性條帶，大小為371 bp，這與筆者預(yù)期的片段大小一致，而陰性對(duì)照樣本的泳道上病未出現(xiàn)明顯條帶。之后應(yīng)用DNA 純化試劑盒對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化處理后，將純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中已知的核酸序列進(jìn)行了BLAST 比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示該序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中IHNV的核衣殼蛋白基因有98%的同源性。

圖4 RT-PCR檢測(cè)IHNV病毒

4.人工感染實(shí)驗(yàn) 從瀕臨死亡的虹鱒魚身上選取肝臟和腎臟組織，使用無菌的生理鹽水以1∶5(M/V)的配比，在冰上進(jìn)行均質(zhì)化，然后在4℃的低溫下，按照3 000、6 000和9 000轉(zhuǎn)/分遞增分度離心10 分鐘，再利用0.22 微米的濾膜過濾取得上清液。實(shí)驗(yàn)分健康組和實(shí)驗(yàn)組兩組，每組10 尾。實(shí)驗(yàn)組虹鱒每只注入0.2毫升的均質(zhì)液，而對(duì)照組虹鱒則注入0.2 毫升無菌生理鹽水。在實(shí)驗(yàn)過程中，將水溫維持在13～15℃，并連續(xù)記錄兩周的死亡率。實(shí)驗(yàn)組的虹鱒在注射后的第4 天開始死亡，至第6 天時(shí)，死亡率已達(dá)80%；其死亡時(shí)的癥狀呈現(xiàn)為急性，臨床癥狀與自然病死魚相似，對(duì)照組則全部存活(圖5)。

圖5 病毒混懸液人工感染試驗(yàn)結(jié)果

三、結(jié)論

經(jīng)過對(duì)發(fā)病虹鱒組織H.E 染色、PCR 檢測(cè)和回歸感染試驗(yàn)，確診該群虹鱒因傳染性造血器官壞死病毒感染發(fā)病。

四、討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)生在四川雅安市龍倉(cāng)溝某養(yǎng)殖場(chǎng)部分虹鱒進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)診斷。該養(yǎng)殖場(chǎng)所養(yǎng)殖的虹鱒有身體顏色加黑、無精打采或亂沖亂撞、肛門處排泄出不清晰或泥黃色的管狀黏性便等異常表現(xiàn)。為了確認(rèn)虹鱒患何種疾病，筆者從表現(xiàn)出異常的虹鱒身上采取了肝臟、脾臟、腎臟和腸等組織，進(jìn)行虹鱒病毒疾病檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，患病魚的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有能形成嗜酸包涵體的上皮細(xì)胞。通過PCR法的檢測(cè)，成功從肝臟、脾臟、腎臟和腸道組織中擴(kuò)增出了具有傳染性造血器官壞死病毒核外殼蛋白基因。通過人工感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)病魚的組織液能夠引發(fā)健康魚感染傳染性造血器官壞死病。因此，結(jié)合該場(chǎng)的流行病學(xué)、臨床癥狀，確診該場(chǎng)的虹鱒死亡系傳染性造血器官壞死病毒感染所致。

五、預(yù)防與控制措施

一是加大對(duì)種苗和主要疾病的監(jiān)測(cè)力度。我國(guó)虹鱒養(yǎng)殖業(yè)面臨著養(yǎng)殖規(guī)模較大、種類繁多、種苗來源復(fù)雜的情況。疾病的傳播途徑亦很復(fù)雜，產(chǎn)地的檢疫體系有待完善。必須加強(qiáng)對(duì)種苗和主要疾病的監(jiān)測(cè)，對(duì)進(jìn)口和國(guó)內(nèi)銷售的種苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，避免帶病毒種苗和染疫卵進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)節(jié)。同時(shí)，需要及時(shí)了解疾病的動(dòng)態(tài)，為漁民和虹鱒養(yǎng)殖業(yè)者提供技術(shù)支持和預(yù)警。

二是實(shí)施疾病預(yù)防性措施，因?yàn)槟壳吧袩o針對(duì)虹鱒病毒病的高效治療手段，主要依賴的是預(yù)防策略。比如，購(gòu)買魚苗時(shí)必須要求商家提供檢疫合格證書；在魚卵運(yùn)到后，需要使用有機(jī)碘進(jìn)行15 分鐘的消毒處理；合理調(diào)節(jié)水溫，將水溫維持在16～20℃；定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)所和使用的工具進(jìn)行消毒；喂養(yǎng)過程中，給魚喂食能夠增強(qiáng)免疫力的中草藥及生物制劑等。

三是優(yōu)化防疫應(yīng)對(duì)措施。漁業(yè)推廣技術(shù)部門需增強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖和防控疫病技術(shù)的指導(dǎo)力度，對(duì)感染病癥的魚塘進(jìn)行實(shí)時(shí)的隔離，對(duì)死去的魚及時(shí)進(jìn)行無害化管理，養(yǎng)殖工具須一池一用，防止交叉感染，養(yǎng)殖排水處理消毒后才可排放。

四是加快打造水產(chǎn)生物無特定疫病的疫苗繁育場(chǎng)所，該建設(shè)可以從源頭上遏制疾病的擴(kuò)散。考慮我國(guó)彩虹鱒養(yǎng)殖的具體情況，要設(shè)立一系列非IHNV 的疫苗繁育場(chǎng)所，有力地管理受精卵、飼料、苗種、助養(yǎng)物等相關(guān)環(huán)節(jié)，盡最大限度地阻止疾病的傳播，有效抑制疾病的發(fā)生和蔓延。