余水法，周小衛(wèi)，張國娣

(1.溧陽市農業(yè)綜合技術推廣中心，江蘇 溧陽 213300；2.溧陽市昆侖街道辦事處農業(yè)農村工作辦公室，江蘇 溧陽 213300)

目前，針對越冬綜合征的誘發(fā)因素主要從養(yǎng)殖管理等方面進行分析，如養(yǎng)殖密度太大、餌料質量有問題、秋冬水質管理不佳等，而病原學的研究尚沒有統(tǒng)一的結論。2023年4月，溧陽市某漁場異育銀鯽養(yǎng)殖暴發(fā)越冬綜合征，死亡率較高。本研究對發(fā)病塘口進行采樣，開展細菌性病原的研究，為做好江蘇省越冬綜合征的防控奠定基礎。根據研究結果采取了系列防治措施，最終使病情得到有效控制。

一、材料與方法

1.樣品采集和細菌分離

2023年4月，溧陽市某漁場異育銀鯽發(fā)病，病魚體表出血嚴重、大面積鱗片脫落，眼球突出明顯，吃食率下降，每天病魚死亡20～30 尾，持續(xù)1周左右，初步診斷為越冬綜合征。

無菌采取魚的病灶和臟器，劃線接種于LB 固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 小時；挑取單個菌落，再次劃線接種于LB 固體培養(yǎng)基進一步純化。經兩次分離純化后的菌落，進行基因擴增。

2.氣單胞菌管家基因擴增測序

按照試劑盒說明書提取細菌基因組，基于氣單胞菌管家基因DNA 促旋酶B亞單位(gyrB)進行PCR檢測。gyrB上下游引物與擴增片段大小如表1 所示。PCR 反應總體積為30 微升，其中含有2 微升基因組模板、1.3 微升上游引物和1.3 微升下游引物、15 微升PCR Mix 液以及10.4微升超純水。取7微升PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，當出現(xiàn)預期條帶后回收PCR 產物，PCR 產物回收后進行測序。結果通過BLAST 分析，與NCBI 數(shù)據庫中現(xiàn)有的核酸序列進行同源性比對，確定菌株種屬。

表1 PCR引物信息

3.氣單胞菌特性分析

(1)斑馬魚致病性試驗。挑取氣單胞菌單菌落接種于BHI 培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)24 小時。接下來用無菌PBS 進行10 倍比例稀釋，把濃度分別調整至5.0×102～5.0×109CFU/毫升。然后以0.02 毫升/尾的劑量對每組斑馬魚進行腹腔注射，確保每組的細菌量分別為10～108CFU。陰性對照組斑馬魚僅注射0.02毫升PBS。每天定時觀察記錄斑馬魚的存活情況，持續(xù)一周，并使用Bliss算法計算斑馬魚半數(shù)致死量(LD50)。

(2)細菌胞外產物活性測定。細菌溶血性測定：蘸取試驗菌株，分別劃線接種于5%綿羊血營養(yǎng)平板上，28℃培養(yǎng)24小時，觀察有無溶血活性。

(3)細菌最小抑菌濃度(MIC)的測定。先將試驗菌株接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)18 小時，并校正菌液濃度為1.5×108CFU/毫升，然后以1∶1000濃度的生理鹽水將其稀釋。將藥物以表2濃度梯度稀釋，并依次加樣加入96孔板中。將氣單胞菌菌液稀釋液加入96 孔板的各個孔中，加樣完畢后將微孔板密封膜貼于孔板上，在37℃條件下孵育18～24 小時。通過觀察，確定無細菌生長的孔位位置，該位置對應的梯度稀釋濃度即為該抗生素的最小有效抑制濃度。

表2 藥物敏感試驗各供試藥物濃度 微克/毫升

二、結果與分析

1.細菌鑒定

從發(fā)病鯽魚的眼球、體表和肝臟中均分離到一株優(yōu)勢菌，菌落形狀大小均如圖1 所示，為圓形、隆起型、乳白色菌落，與氣單胞菌菌落特點相似。gyrB 管家基因的PCR 擴增檢測結果與NCBI基因庫中現(xiàn)有的核酸序列進行BLAST分析和同源性比對，鑒定結果為溫和氣單胞菌，命名為LY2023001。

2.LD50測定

斑馬魚致病性試驗結果如表3所示，計算株菌的LD50值。根據濮俊逸等對細菌致病力的分類，LY2023001 的LD50值為1.64×104CFU/尾，判定為強致病力菌株。

表3 動物回歸感染試驗及LD50值計算結果

3.細菌胞外產物活性測定

通過劃線血平板，發(fā)現(xiàn)LY2023001具有溶血性(表4)。進一步的溶血活性試驗結果顯示，LY2023001的溶血性強于標準菌株ATCC7966，溶血價為1∶8。

表4 胞外產物活性測定結果

蛋白酶活性試驗結果顯示LY2023001具有較強的胞外蛋白酶活性，其胞外蛋白酶活性為0.334，遠高于對照菌株ATCC7966的0.177。

4.藥物敏感試驗結果

由表5 可知，LY2023001 對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟甲喹和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶敏感，而對其他4 種抗菌素耐藥，其中對恩諾沙星最敏感，MIC 僅為0.125 微克/毫升，可以考慮作為首選藥物。

表5 氣單胞菌對不同抗菌藥物的MIC值 微克/毫升

三、討論

自從越冬綜合征發(fā)病以來，全國水產技術推廣總站多次組織專家學者對發(fā)病塘口進行采樣，開展病原學研究。對來自多個養(yǎng)殖場病魚內臟進行不同培養(yǎng)基的細菌分離，也未見大量細菌生長，分離獲得的細菌主要為維氏氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌。珠江水產研究所團隊認為柱狀黃桿菌是越冬綜合征的主要病原；長江水產研究所團隊認為當前黃顙魚所患疾病以鮰愛德華氏菌感染引起的腸道敗血癥為主；浙江淡水水產研究所團隊從患病黃顙魚中分離到新的小RNA病毒。本研究中從發(fā)病的異育銀鯽病灶處分離到一株優(yōu)勢菌，鑒定為溫和氣單胞菌，命名為LY2023001。

近年來由溫和氣單胞菌引起的草魚、美洲鰣、黃顙魚等魚發(fā)病的情況也時有發(fā)生，具有一定的致病性。本研究中分離的LY2023001是一株強致病力菌株，LD50為1.64×104CFU/尾，具有較高的溶血活性和胞外蛋白酶活性。藥敏試驗結果顯示，該菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟甲喹和磺胺甲噁唑、甲氧芐啶敏感，可以選用恩諾沙星作為治療此次越冬綜合征的首選藥物。

根據藥敏結果制定治療方案。外用選擇優(yōu)質碘制劑潑灑2～3 次，施藥間隔1 天。內服可以在飼料中添加恩諾沙星進行治療，疾病治愈后停掉抗生素，改為保肝藥、維生素及乳酸菌繼續(xù)投喂7～10 日天。治療1 周后，病魚出現(xiàn)充血、表皮潰爛的數(shù)量減少，死亡數(shù)明顯減少。兩周后魚群基本恢復健康，采食量恢復至正常水平，魚群未出現(xiàn)疑似越冬綜合征的癥狀。