王 鋒,姚欣澤,楊 躍,趙 玥,董文藝,4,5,6,王宏杰,4,5,6,于曉紅,趙子龍,5,6

(1.哈爾濱工業(yè)大學(深圳) 土木與環(huán)境工程學院,廣東 深圳 518055;2.哈爾濱工業(yè)大學(深圳) 經濟管理學院,廣東 深圳 518055;3.深圳能源環(huán)保股份有限公司,廣東 深圳 518048;4.城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室(哈爾濱工業(yè)大學),哈爾濱 150090;5.深圳市水資源利用與環(huán)境污染控制重點實驗室(哈爾濱工業(yè)大學(深圳)),廣東 深圳 518055;6.城市高濃度廢水處理與資源化實驗室(校企聯(lián)合),廣東 深圳 518055)

目前,城市河道外源污染問題已基本得到有效控制,但由河道底泥引發(fā)的“內源”污染依舊對水體造成一定的影響。研究表明,持久性有機物多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)廣泛存在于河道污染底泥中[1-3],由于其具有致畸、致癌、致突變的危害[4],一直都是河道“內源”污染治理的重難點。美國環(huán)境保護署(USEPA)將16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物,主要分為低分子質量PAHs(2～3環(huán)),包括萘、苊烯、苊、菲、蒽;中分子質量PAHs(4環(huán)),包括熒蒽、芘、苯并[a]蒽、芘;高分子質量PAHs(5～6環(huán)),包括苯并[b]蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]芘[5]。目前,針對底泥中以16種PAHs為代表的難降解有機物污染,主要采用強化生物共代謝技術進行處理[5-9]。生物共代謝通過向底泥中投加外源營養(yǎng)物質,如乙酸鈉、葡萄糖、鄰苯二甲酸、甲醇等[10]作為碳源,促進底泥土著微生物生長繁殖,進而代謝底泥中PAHs等難降解的污染物質[10-11]。因此,微生物菌群是決定共代謝體系降解目標污染物效果的核心[12-16]。

前期研究表明,微生物共代謝降解底泥PAHs中,溫度和pH是重要的影響因素。Zhong等[17]研究了溫度對共代謝降解PAHs的影響,表明溫度對PAHs降解速率影響較大,溫度越高,PAHs降解速率越快,但溫度對PAHs降解率無明顯影響。Tam等[18]研究了底泥pH對共代謝降解PAHs的影響,發(fā)現(xiàn)底泥pH對PAHs降解率影響較大,不同微生物對環(huán)境pH的要求存在一定差異,底泥堿性越強,PAHs降解率越高。但吳華財?shù)萚19-20]的研究表明,高鹽環(huán)境會改變反應介質的滲透壓而影響微生物活性,因此,鹽度對微生物共代謝降解底泥中污染物也具有一定的影響。感潮河段水質較常規(guī)河道具有高鹽度、高硫酸鹽的特性,且上覆水受潮汐反復沖刷的影響,鹽度不斷波動,對底泥中PAHs共代謝降解、底泥微生物群落變化及關鍵酶的活性、代謝速率等產生了不可預知的影響。

1 實 驗

1.1 底泥的采集

試驗底泥取自南方某市某河下游入海口感潮段,取樣點靠近珠江口(北緯22°75′5718″,東經113°79′1108″),潮汐特征為不規(guī)則半日潮,每天受兩次漲落潮影響,日平均潮差1.2 m,上覆水鹽度整體波動范圍為7‰～18‰。采用抓斗采樣器取樣,采樣深度為0～60 cm。采集的底泥及上覆水污染物本底值如表1所示。

表1 供試底泥及上覆水本底值Tab.1 Background value of tested sediment and overlying water

1.2 試驗裝置

本試驗系統(tǒng)由模擬河道、進水海水箱、進水淡水箱和退水水箱組成(圖1),泥水體積比為1∶4,水力停留時間為12 h。共5組實驗,每組進水水箱中配水鹽度不同,配水鹽度及反應器主要參數(shù)如表2所示。根據河道底泥及上覆水的實際情況,試驗系統(tǒng)溫度控制在(25±5)℃?？紤]試驗所用底泥的取樣潮汐河段為不規(guī)則半日潮,每天高低潮各兩個,一個半日潮之間間隔約12 h,故每日早8:00用蠕動泵定時從鹽水箱泵入人工海水以模擬海水漲潮,從淡水箱泵入等體積的自來水以模擬上游徑流,從最低水位到最高水位之間時間間隔設置為1 h。每日晚20:00定時打開排水管出水以模擬退潮,保留一定體積的出水進入海水水箱,第二天作為漲潮海水重新進入反應器,以模擬近海河道受潮汐影響時往復流的特點,試驗周期90 d。

底泥中投加的共代謝藥劑為乙酸鈉耦合鄰苯二甲酸的復配藥劑,乙酸鈉作為共代謝反應的主要碳源,鄰苯二甲酸作為底泥微生物好氧共代謝反應的促進劑,單位干泥投加量依據前期預實驗[22]最終確定為乙酸鈉40 mg/g,鄰苯二甲酸0.02 mg/g。

1.3 樣品處理、分析和質量控制

樣品處理:準確稱取15.0 g底泥樣品置離心管(250 mL)中,加入30 mL體積比為1∶1的二氯甲烷-丙酮溶液靜置2 h,勻漿提取1 min后,微波振蕩提取15 min,10 000 r/min轉速下離心分離5 min,提取過程重復2次,取上層有機相清液5 mL,用濃縮儀40 ℃濃縮干,正己烷定容至2.5 mL,漩渦15 s后過0.22 μm濾膜至進樣瓶,等待上機。

樣品分析:用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS,Agilent 6890 Plus GC-5973MSD,美國)對底泥中16種PAHs進行分析,采用兩種升溫分析程序。儀器分析條件及升溫分離程序如下:選擇性離子掃描模式(SIM)定量,HP-5MS細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),以He作載氣,流速mL/min;無分流進樣(進樣體1 μL),進樣口溫度280 ℃,PAHs測定初始爐溫60 ℃;程序升溫到300 ℃(5 ℃/min),整個程序運行時間68 min。MS條件: EI電離源70 eV,離子源溫度230 ℃,掃描范圍50～550 u。

質量控制:實驗過程進行嚴格的質量控制,根據特征分子離子峰、保留時間以及質譜圖的質譜數(shù)據庫(NIST2002)匹配分析對樣品中的組分進行定性分析,用指示物的回收率監(jiān)測和評價實驗質量。為了保證數(shù)據質量,采用了方法空白和樣品平行樣等質控手段,控制實驗流程中的人為因素污染以及操作過程的準確性。16種PAHs的標準曲線相關系數(shù)均大于99.9%,底泥樣品中一批測13個樣,包括1個空白、1個平行、1個加標回收率,有效數(shù)據10個,PAHs的空白加標回收率為75.5%～100%。

1.4 檢測方法

1.4.1 常規(guī)指標檢測方法

1.4.2 微生物群落結構測定

底泥細菌總DNA提取、PCR操作和16S rRNA測序由上海美吉生物醫(yī)藥公司完成。首先,采用Power Soil DNA提取試劑盒(MO Biomedical,U. S.)對樣本中的DNA進行提取;然后,選取細菌基因的V3～V4區(qū)進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增,引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′),806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應體系(20 μL):5×FastPfu Buffer 4 μL,dNTPs 2 μL,引物各0.8 μL,FastPfu聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng,加無菌水至20 μL。PCR條件:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。2%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,PCR采用ABI GeneAmp 9700型PCR儀。在使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物后,用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量,之后,根據每個樣本的不同測序量要求進行相應比例混合。最后,按照Illumina MiSeq平臺的測序要求進行測序。

1.4.3 數(shù)據處理與分析

采用Excel 2021和Origin 2018進行數(shù)據處理和作圖,運用SPSS 20.0進行單因素方差(ANOVA)分析,采用最小顯著差異法(LSD)比較數(shù)據組間的差異(P<0.05)。采用Mothur軟件計算土中細菌的ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),采用R語言的“gtern”包對不同樣本的物種組成進行比較分析。

2 結果與討論

2.1 多環(huán)芳烴的降解效果

上覆水不同鹽度波動條件下(0～50‰),90 d內底泥微生物共代謝降解PAHs質量分數(shù)變化如圖2所示。隨著上覆水鹽度波動,底泥中16種PAHs的降解率經歷了兩次大幅下降。當鹽度波動從0～20‰升高到>20‰～40‰時,PAHs的降解率從42.0%下降至29.0%;當鹽度波動從>20‰～40‰升高到>40‰～50‰時,PAHs的降解率從29.2%下降至12.9%。低鹽環(huán)境(0～20‰)下底泥PAHs的降解率是高鹽環(huán)境(>20‰～50‰)的1.5～3.3倍。在反應第90 天時,0～10‰、>10‰～20‰、>20‰～30‰、>30‰～40‰和>40‰～50‰鹽度條件下底泥PAHs的質量分數(shù)分別為3 073、3 117、3 821、3 809和4 683 μg/kg。這些結果表明鹽度的升高對共代謝降解底泥PAHs具有顯著影響(P<0.05),這是因為高鹽環(huán)境會抑制傳統(tǒng)微生物的生長和降解能力,破壞正常的代謝功能,抑制PDO、C12O、C23O等關鍵的PAHs降解酶活性[23]。彭子淇等[24]也證明,高鹽度環(huán)境會迫使PAHs降解菌發(fā)生脫水和PDO、C12O酶失活,致使PAHs降解率較低。Thomas和Vijendra等[25-26]的研究表明,共代謝降解過程主要通過促進PAHs降解菌的生長富集來加強PAHs的降解。本研究在相同菌群特征的5組供試底泥中,給予同等的碳源水平,乙酸鈉為底泥土著微生物的生長提供了優(yōu)質的碳源,鄰苯二甲酸作為酶促反應的中間產物,有效促進了厭氧降解反應的正向進行[27]。隨著不同反應體系中鹽度的升高,PAHs的去除率逐漸降低,可見過高鹽度會抑制底泥微生物共代謝降解PAHs。

圖2 上覆水鹽度波動對PAHs降解效果的影響Fig.2 Effect of salinity fluctuation of overlying water on PAHs degradation

2.2 總有機碳質量分數(shù)變化

不同鹽度波動條件下,底泥微生物共代謝降解周期90 d內TOC質量分數(shù)的變化如圖3所示。共代謝全周期內不同上覆水鹽度條件下,TOC質量分數(shù)均呈現(xiàn)先上升,然后緩慢下降并逐漸穩(wěn)定的趨勢。不同鹽度下底泥TOC的質量分數(shù)在前10 d內均有提高,這是因為共代謝中添加的乙酸鈉和鄰苯二甲酸為外加碳源,使得底泥中TOC質量分數(shù)迅速升高。反應前期(第0～60天),上覆水鹽度在低鹽(>10‰～30‰)條件下TOC降解率高于上覆水過低鹽度(0～10‰)和高鹽度(>30‰～50‰)情形。共代謝反應后期(第60～90天),不同上覆水鹽度波動條件下,TOC降解率相近。5組實驗組反應60 d時,底泥TOC的質量分數(shù)分別為2.38%、1.99%、2.08%、2.34%和2.56%,反應90 d時,各組底泥TOC的質量分數(shù)分別為1.91%、2.10%、2.31%、1.99%和2.04%,上覆水鹽度不再是共代謝降解TOC的限制因素。共代謝前期低鹽環(huán)境(>10‰～30‰)底泥TOC降解率是過低鹽環(huán)境(0～10‰)的1.1～1.2倍,高鹽環(huán)境(>30‰～50‰)的1.1～1.3倍(P<0.05)。前期過低鹽度上覆水(0～10‰)TOC降解效果相對較低,原因可能是過低鹽環(huán)境下降解TOC的相關微生物為非優(yōu)勢菌屬[28];前期高鹽環(huán)境(>30‰～50‰)下,TOC降解效果同樣受到限制,這是因為高鹽環(huán)境會抑制土著微生物的代謝,致使共代謝速率下降,導致底泥TOC殘留量較高[29];而后期鹽度對TOC降解率的影響降低,這可能與后期鹽度達到泥-水平衡有關[30]。因此,適宜的上覆水鹽度對底泥TOC的降解效果具重要意義。

圖3 上覆水鹽度波動對TOC降解效果的影響Fig.3 Effect of salinity fluctuation of overlying water on TOC degradation

2.3 底泥理化性質變化

2.3.1 pH

圖4 上覆水鹽度波動對底泥pH和ORP變化的影響Fig.4 Effect of salinity fluctuation of overlying water on the changes of sediment pH and ORP

2.3.2 ORP

上覆水不同鹽度波動條件下,底泥微生物共代謝90 d內ORP的變化如圖4(b)所示。

在整個代謝周期內,隨著共代謝反應的進行,底泥ORP整體呈下降趨勢。當上覆水鹽度較低(0～20‰)時,底泥ORP下降顯著,反應90 d時,0～10‰、>10‰～20‰鹽度條件下底泥ORP分別為-369、-333 mV;當上覆水鹽度較高(>20‰～50‰)時,底泥ORP下降相比低鹽環(huán)境受到一定程度抑制,反應90 d時,>20‰～30‰、>30‰～40‰、>40‰～50‰鹽度條件下底泥ORP分別為-287、-269、-284 mV。由此可知,過高的鹽度會對底泥中的微生物厭氧代謝過程造成一定的抑制,減緩ORP的下降。這主要是由于高鹽環(huán)境產生的高滲透壓會使底泥中多數(shù)厭氧微生物脫水而失去活性,抑制了底泥中厭氧代謝反應,改變微生物群落結構[19-20],使得微生物共代謝反應和速率下降。

2.4 底泥硫形態(tài)的轉化

2.4.1 AVS質量分數(shù)

2.5 底泥微生物群落響應

2.5.1 微生物群落的豐富度和多樣性

對不同上覆水鹽度波動條件下底泥微生物群落的豐富度和多樣性進行分析,每個樣本獲得超過76 000個序列(表3)。低鹽度環(huán)境(0～10‰)下底泥中的OTUs總數(shù)較高(774),當鹽度上升到>40‰～50‰時,OTUs總數(shù)下降為616。不同上覆水鹽度波動條件下,底泥樣本微生物多樣性指標Shannon指數(shù)在5.663～6.369變化,Simpson指數(shù)在0.006～0.032變化。其中,Shannon指數(shù)與上覆水鹽度呈正相關,上覆水鹽度越高,Shannon指數(shù)越高;Simpson指數(shù)與上覆水鹽度呈負相關,上覆水鹽度越高,Simpson指數(shù)越低。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別反映了微生物群落的異質性和多樣性[38-39],可見上覆水鹽度越高時樣品中微生物群落均勻性越差;上覆水鹽度越低時樣品中微生物個體分配越均勻。

表3 不同上覆水鹽度波動條件下底泥細菌多樣性指數(shù)Tab.3 Bacterial diversity index of sediment under different overlying water salinity fluctuation conditions

表3中的覆蓋率指數(shù)為0.977～0.981,表明本研究構建的序列庫涵蓋了微生物群落的多樣性,5組樣品中上覆水鹽度越低的組別覆蓋率指數(shù)越高。Chaol指數(shù)為3 160～3 748,ACE指數(shù)變化范圍為3 201～3 848。其中,低鹽度環(huán)境(0～10‰)下底泥樣品中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)都是5組中最高,表明在低鹽環(huán)境下底泥樣品中微生物物種數(shù)最多。高鹽度環(huán)境(>40‰～50‰)下底泥樣品中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)都是5組中最低,表明厭氧微生物對鹽度脅迫環(huán)境的適應性,在上覆水鹽度較高的環(huán)境條件下,底泥微生物種類數(shù)量減少但生物多樣性得以保持穩(wěn)定。

2.5.2 微生物群落結構的變化

通過高通量測序技術分析底泥樣品中細菌群落特性,解析上覆水鹽度波動變化對微生物群落結構的影響。所有底泥樣本的OTUs均在97%鑒別閾值控制內。門水平和屬水平上底泥微生物群落的變化如圖6所示。

圖6 不同上覆水鹽度波動下底泥微生物門水平群落組成圖和屬水平群落豐度熱圖Fig.6 Horizontal community composition diagram and genus level community abundance heat map of sediment microbial phylum under different overlying water salinity fluctuations

圖6(a)顯示,低鹽度環(huán)境下(0‰～10‰)底泥樣品中微生物群落主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)3個優(yōu)勢菌門組成,分別占比52%、16%和7%。隨著鹽度增加,Proteobacteria和Firmicutes種群豐度逐漸降低;相反,脫硫桿菌門(Desulfobacter)和綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度顯著增加。低鹽度環(huán)境(0～10‰)中,Desulfobacter和Chloroflexi種群豐度占比分別為2%和5%,當上覆水鹽度逐步增加至高鹽(>40‰～50‰)狀態(tài)時,Desulfobacter和Chloroflexi種群豐度占比達到21%和10%。已有報導表明,Proteobacteria和Firmicutes是典型的芳烴類污染物高效降解菌[40]。Firmicutes可以誘導底泥中大分子有機物快速向代謝中間產物有機酸轉化,進而加快共代謝降解PAHs的速率[41]。由此可推測,上覆水鹽度是通過抑制Proteobacteria和Firmicutes這兩類污染物降解菌群的豐度,進而導致共代謝降解PAHs的能力下降。Desulfobacter是一種化能自養(yǎng)型細菌[42],在氧化硫化物的過程中獲得能量,當上覆水鹽度升高時,硫酸鹽質量濃度也相應增加,在微生物共代謝過程中轉化成的硫化物隨反應時間延長逐漸增多,進而誘導了Desulfobacter種群豐度的大幅增長。

圖6(b)顯示了隨上覆水鹽度的增加,底泥微生物屬水平上群落結構的變化,不同上覆水鹽度波動條件下底泥樣品中微生物種群豐度和組成相差較大。在低鹽度環(huán)境下(0～10‰),海細菌屬(Marinobacterium)和海桿菌屬(Marinobacter)為優(yōu)勢屬(相對豐度高于2%),Marinobacterium和Marinobacter相對豐度分別為2.94%和2.88%。Marinobacter屬于α-變形菌(α-Proteobacteria)的優(yōu)勢菌屬,參與芳香烴的共代謝降解[43]。當上覆水鹽度升高(超過10‰),底泥中廣泛存在的Arcobacteraceae、Denitrovibrio、Oceanicaulis和Thalassospira的種群豐度顯著降低,可見高鹽環(huán)境對河道底泥土著菌群的脅迫影響。隨上覆水鹽度的升高,livecontrolB21、Sulfurovum、SBR1031和VadinHA17的種群豐度顯著升高,說明此4類菌屬與Arcobacteraceae等受高鹽脅迫的菌屬具有不同的環(huán)境適應機制,高鹽環(huán)境誘導了其種群豐度的增長。

3 結 論

1)低鹽環(huán)境更利于微生物共代謝降解底泥PAHs。上覆水鹽度過高對乙酸鈉聯(lián)合鄰苯二甲酸的共代謝降解體系存在抑制作用,底泥PAHs降解率受限。同樣,對底泥TOC的降解也表現(xiàn)出類似的影響。

3)高鹽環(huán)境對河道底泥土著微生物菌群具有脅迫效應。低鹽環(huán)境下Marinobacterium和Marinobacter為共代謝降解PAHs的優(yōu)勢菌屬,而在高鹽脅迫下這兩類優(yōu)勢菌群的活性受到抑制,耐鹽菌SBR1031和Sulfurovum逐漸成為新的優(yōu)勢菌屬。

4)在實際工程應用中,上覆水為低鹽環(huán)境(0～20‰)下,更適合采用微生物共代謝技術降解污染河道底泥PAHs。