段珂屹 劉安 陳亮 武小芬 齊慧 張祺玲 王振 鄧明 王克勤 劉素純

收稿日期：2023-05-04；修回日期：2023-09-01。

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFE0111200-2）；湖南省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2022CX119）。

作者簡介：段珂屹，碩士研究生。

* 通信作者：劉素純，教授，主要從事微生物發(fā)酵及安全控制的研究，E-mail： liusuchun@.163.com；

王克勤，研究員，主要從事生物資源高效利用及生物煉制技術(shù)的研究，E-mail： wkq6412@.163.com。

摘 要：本試驗(yàn)利用電子束及γ射線兩種射線對漸狹蠟蚧菌（Lecanicillium attenuatum）3166進(jìn)行誘變處理，研究適于漸狹蠟蚧菌誘變選育的吸收劑量以及誘變菌株生物學(xué)特性。結(jié)果表明：電子束及γ射線誘變漸狹蠟蚧菌的最適劑量均為200 Gy，漸狹蠟蚧菌的電子束輻射敏感性D10值為191 Gy、γ射線D10值為366 Gy；以產(chǎn)孢速率為指標(biāo)篩選獲得突變菌株8株，其中5株的菌絲生長及產(chǎn)孢速率較出發(fā)菌株顯著提高，均為電子束誘變所得，產(chǎn)孢速率分別較出發(fā)菌株提高了30.45%、31.55%、23.66%、64.83%、68.77%；誘變菌株的胞外幾丁質(zhì)酶比活在培養(yǎng)5 d時(shí)達(dá)到峰值，誘變株Ⅱ111、Ⅱ164、Ⅱ181的幾丁質(zhì)酶比活分別較出發(fā)菌株顯著提高29.29%、54.45%、19.18%，其中Ⅱ164酶比活可達(dá)1 707.41 U/mg prot；胞外蛋白酶比活在培養(yǎng)7 d時(shí)達(dá)到峰值，Ⅱ111、Ⅱ164、Ⅱ181的蛋白酶比活分別較出發(fā)菌株顯著提高17.98%、13.17%、16.50%，其中Ⅱ111酶比活達(dá)到30.71 U/mg prot，且漸狹蠟蚧菌誘變株生長速率與胞外酶比活有強(qiáng)相關(guān)性。本研究為漸狹蠟蚧菌后續(xù)的害蟲防治及開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：漸狹蠟蚧菌；輻射誘變；突變菌株；生物學(xué)特性；胞外酶比活

中圖分類號(hào)：TL99；S476.1? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.006

Screening of Lecanicillium attenuatum with High Growth Rate by Radiation Mutation and Its Biological Characteristics

DUAN Keyi1， LIU An2， CHEN Liang2， WU Xiaofen2， QI Hui2， ZHANG Qiling2， WANG Zhen2，

DENG Ming2， WANG Keqin2*， LIU Suchun1*

（1. College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410125， China; 2. Engineering Technology Research Center of Agricultural Biological Irradiation， Hunan Institute of Nuclear Agricultural Science and Space Mutation Breeding， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）

Abstact： In this study， electron beam and γ-ray were used to mutagenize Lecanicillium attenuatum 3166， and the absorbed dose suitable for mutation breeding of Lecanicillium attenuatum and the biological characteristics of the mutagenized strain were studied. The results showed that the optimal dose for electron beam and γ-ray mutagenesis of Lecanicillium attenuatum was 200 Gy， the electron beam D10 value of Lecanicillium attenuatum was 191 Gy， and the γ-ray D10 value was 366 Gy; eight mutant strains were screened and obtained with spore production rate as the index. Among them， the hypha growth and spore production rate of five strains significantly increased compared with the parent strain， which were all obtained by electron beam mutagenesis. The spore production rate increased by 30.45%， 31.55%， 23.66%， 64.83% and 68.77% respectively compared with the parent strain. The extracellular chitinase activity of the mutant strain reached the peak after five days of culture， and the chitinase activities of mutant strains Ⅱ111， Ⅱ164 and Ⅱ181 increased by 29.29%， 54.45% and 19.18% respectively， compared with that of the parent strain. The chitinase activity of mutant strain Ⅱ164 reached 1 707.41 U/mg prot; the extracellular protease activity reached its peak after 7-day culture， and the protease activities of Ⅱ111， Ⅱ164 and Ⅱ181 were significantly increased by 17.98%， 13.17% and 16.50% respectively as compared with those of the parent strain， wherein the enzyme activity of Ⅱ111 could reach 30.71 U/mg prot， and the growth rate of the mutant strain had a strong correlation with the extracellular enzyme activity. This study provides a theoretical basis for the follow-up pest control， development and utilization of Lecanicillium attenuatum.

Key words： Lecanicillium attenuatum; radiation mutagenesis; mutagenized strain; biological property; extracellular enzyme specific activity

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（5）： 431-440）

漸狹蠟蚧菌（Lecanicillium attenuatum）屬于子囊菌綱，肉座菌目，蠟蚧菌屬［1］，是一類重要的蟲生真菌，對蚜蟲［2-4］、粉虱［4-8］、蚧蟲［9-10］、薊馬［11］和線蟲［12］等都有致病作用，在生物防治上具有極大的潛力。對比其他生防真菌如綠僵菌、白僵菌，蠟蚧菌在制劑開發(fā)及商品利用方面研究較少，可能的原因之一是蠟蚧菌的生長較慢、大規(guī)模產(chǎn)孢力較弱。目前對蠟蚧菌的研究主要集中于分生孢子、產(chǎn)孢能力等生物學(xué)特性以及野生型蠟蚧菌防治害蟲的方面，通過輻射誘變育種技術(shù)選育蠟蚧菌優(yōu)良菌株的研究較少。

輻射誘變具有較高的微生物變異率、突變方向多樣、效率高等優(yōu)點(diǎn)，是微生物菌種選育的一個(gè)重要技術(shù)途徑［13］。王楠等［14］利用60Co-γ射線輻照誘變猴頭菌尖端菌絲，獲得一株生物量和菌絲多糖產(chǎn)量明顯提高且性狀穩(wěn)定遺傳的突變菌株。韓晶晶等［15］利用電子束輻照誘變，篩選出一株高產(chǎn)酒精酵母YF1。付玉潔等［16］采用電子束輻照誘變丙酮丁醇梭菌，并輔以脅迫試驗(yàn)，經(jīng)篩選最終獲得了一株突變菌株S10，其丁醇產(chǎn)量較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了10%。由此可見，通過60Co-γ射線和電子束輻照改變微生物的遺傳結(jié)果和功能，篩選出具有特定性狀的優(yōu)良突變型微生物是選育微生物的重要手段。

本研究通過電子束和60Co-γ射線兩種射線輻射誘變漸狹蠟蚧菌，以產(chǎn)孢速率為指標(biāo)初步篩選獲得誘變菌株，從菌株生物學(xué)特性對比兩種射線對菌株產(chǎn)生的影響，篩選出高產(chǎn)孢速率的誘變漸狹蠟蚧菌，為蠟蚧菌誘變育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（高葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基）：葡萄糖5.0%、馬鈴薯浸粉0.5%、瓊脂1.5%。

篩選培養(yǎng)基（高葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基）：葡萄糖5.0%、馬鈴薯浸粉0.5%。

幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：0.200%膠體幾丁質(zhì)、0.100% KH2PO4、0.200% Na2HPO4、0.030%NaCl、0.300%KNO3、0.030% MgSO4 ·7H2O、0.001% FeSO4和0.300%胰蛋白胨（tryptone）。

蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1.0%麥芽糖、0.5%蛋白胨、0.004 8% MgSO4、1.1% Na2HPO4·12H2O、 1.2% NaH2PO4·2H2O。

1.2 漸狹蠟蚧菌菌株誘變前處理

選取培養(yǎng)適宜天數(shù)的蠟蚧菌平板，無菌生理鹽水沖洗菌平板，收集洗下的粗孢液，通過過濾裝置濾去菌絲，得到單孢子懸液并計(jì)數(shù)。調(diào)整濃度至106 CFU/mL，分裝為10 mL每離心管。于室溫條件下分別用10 MeV電子加速器及60Co-γ射線（輻射源活度為2.96×1016 Bq）輻照處理，輻照設(shè)計(jì)劑量分別為0（對照）、50（僅電子束）、100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 500、2 000 Gy。每個(gè)劑量輻照2管。

1.3? 漸狹蠟蚧菌輻射敏感性（D10）測定及致死率計(jì)算

將輻照后的孢懸液參考GB 4789.15 — 2016［17］中的方法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算不同輻照吸收劑量處理孢懸液的活孢數(shù)，并以0 Gy（未輻照）孢懸液為空白對照。以輻照吸收劑量為橫坐標(biāo)（x），活孢濃度的lg值為縱坐標(biāo)（y）作圖，計(jì)算漸狹蠟蚧菌在60Co-γ射線和電子束輻射下的D10值。同時(shí)計(jì)算致死率，公式如式（1）。

（1）

1.4 漸狹蠟蚧菌輻照后菌株初篩與復(fù)篩

挑取致死率在80%～90%計(jì)數(shù)平板中的單菌落于基礎(chǔ)培養(yǎng)基斜面純培養(yǎng)，記為0代，并對其編號(hào)。培養(yǎng)后刮取孢子接種1代菌平板，按照1.2中方法制備濃度為103 CFU/mL孢懸液，吸取1 mL孢懸液接種于篩選培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min培養(yǎng)96 h，每株菌2個(gè)平行。計(jì)算菌株0～96 h的產(chǎn)孢速率，作為篩選指標(biāo)，選取產(chǎn)孢速率顯著提高的菌株，得到初篩的高產(chǎn)孢速率誘變株；再以同樣的方法復(fù)篩出產(chǎn)孢速率較高的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 漸狹蠟蚧菌菌絲生長特性的測定

使用6 mm打孔器于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中央半打孔，留出溝壑。調(diào)整孢懸液濃度為107 CFU/mL，吸取10 μL孢懸液接種于培養(yǎng)基中央圓餅位置，靜置片刻，于（28±0.5）℃下培養(yǎng)，第3天開始采用十字交叉法每天測量菌落直徑，測量至第8天，每株菌3個(gè)重復(fù)。

1.6 漸狹蠟蚧菌誘變菌株遺傳穩(wěn)定性的測定

以誘變后挑選出來的初次接種的菌落為突變菌株0代，轉(zhuǎn)接至斜面純培養(yǎng)的突變菌株為1代，用于后續(xù)試驗(yàn)的菌株均為突變菌株2代。制備濃度為107 CFU/mL的誘變菌株2代孢懸液，取1 mL孢懸液接種至液體培養(yǎng)基中28℃、220 r/min培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)后的孢液過濾去菌絲，調(diào)整濃度為107 CFU/mL，取1 mL接種至新培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同上一代，重復(fù)至傳代6次，獲得誘變菌株的第8代。對比菌株第2代和第8代的產(chǎn)孢速率，評(píng)估誘變菌株產(chǎn)孢的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 漸狹蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶比活的測定

幾丁質(zhì)粉10 g加入100 mL 85%的磷酸，充分溶解，放入4℃冰箱中溶脹24 h后將混合液倒入大燒杯，加入蒸餾水?dāng)噭蚝? 000 r/min離心10 min，棄上清液，水洗沉淀，反復(fù)離心、水洗至pH 5.5，蒸餾水定容至1 000 mL，得到終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的膠體幾丁質(zhì)。配制幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)pH至5.5，0.15 MPa、121℃滅菌30 min后冷卻備用。

按照1.2的方法制備蠟蚧菌孢懸液，調(diào)整孢懸液濃度為106 CFU/mL，將1 mL孢懸液接種于幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于搖床28℃、220 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)后取1 mL發(fā)酵液5 000 r/min 離心15 min，取上清液-80℃冷凍保藏待用。

幾丁質(zhì)酶活的測定采用Solarbio幾丁質(zhì)酶活性檢測試劑盒，蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（微量法）。根據(jù)N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。酶比活力按照總蛋白濃度計(jì)算，定義為37℃下，每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶比活性單位。

1.8 漸狹蠟蚧菌蛋白酶比活測定

配制106 CFU/mL孢子懸液，取1 mL接入蛋白酶液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min條件下培養(yǎng)，6 000 r/min離心10 min，取上清液，-80℃冷凍待用。

蛋白酶活的測定參照相關(guān)文獻(xiàn)［18-20］方法，在275 nm波長下測定反應(yīng)液的吸光值，根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白酶活性，每組3個(gè)平行；蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（微量法）；酶比活力按照總蛋白濃度計(jì)算，定義為37℃下，每毫克蛋白每分鐘分解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的酶量為一個(gè)酶比活性單位。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素ANOVA檢驗(yàn)（顯著水平P<0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）和成對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。作圖采用Origin2022等軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1 電子束及60Co-γ射線輻照對漸狹蠟蚧菌輻照敏感度的影響及輻照誘變劑量的確定

如圖1a所示，電子束輻照吸收劑量與漸狹蠟蚧菌存活率的lg值關(guān)系曲線為y=-0.005 4x+6.132 7，R2=0.982 7；60Co-γ射線輻照吸收劑量與漸狹蠟蚧菌存活率的lg值關(guān)系曲線為：y=-0.001 8x+4.959 6，R2=0.857 7；依據(jù)公式算出電子束輻照吸收劑量的D10值為191 Gy， 60Co-γ射線輻照吸收劑量的D10值為366 Gy，說明本研究中的漸狹蠟蚧菌對電子束輻射更敏感。由圖1b可知，兩種射線在輻照吸收劑量達(dá)到400～600 Gy時(shí)對漸狹蠟蚧菌的影響開始保持同步，致死率均達(dá)到90%～100%，與徐巖［21］和張變英［22］的研究結(jié)果一致。前人研究認(rèn)為，選擇致死率為80%～90%的誘變菌株純化分離，獲得正突變菌株的概率更高，因此，本試驗(yàn)中電子束及60Co-γ射線輻照漸狹蠟蚧菌的適宜誘變劑量為200 Gy［23-24］。

2.2 誘變菌株產(chǎn)孢速率的初篩及復(fù)篩

將輻照后的孢子懸液分別稀釋104、105、106倍，涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中，28℃恒溫培養(yǎng)4 d，挑出生長良好的菌落于基礎(chǔ)培養(yǎng)基斜面中純培養(yǎng)，共分離電子束誘變單菌株200株，60Co-γ射線誘變單菌株110株。根據(jù)1.4的方法，初篩得到29株產(chǎn)孢速率較高的電子束誘變株，12株產(chǎn)孢速率較高的60Co-γ射線誘變株。然后對41株初篩菌株用同樣的篩選方法進(jìn)行復(fù)篩，得到6株產(chǎn)孢速率較高的電子束誘變株，產(chǎn)孢速率分別較出發(fā)菌株CK提高了30.45%、31.55%、7.89%、23.66%、64.83%、68.77%。另外，得到了2株60Co-γ射線誘變株，但復(fù)篩時(shí)產(chǎn)孢速率較低；其中菌株Ⅱ164和Ⅱ181 的產(chǎn)孢速率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于其他菌株（P<0.01），結(jié)果見圖2。

2.3 電子束及60Co-γ射線輻照誘變對漸狹蠟蚧菌生長特性的影響

2.3.1 電子束及60Co-γ射線輻照對漸狹蠟蚧菌菌落生長速度的影響

由圖3可知，8株誘變菌株生長趨勢與CK一致，其中Ⅱ164、Ⅱ111號(hào)菌株培養(yǎng)6～8 d時(shí)的菌落直徑均顯著高于CK。培養(yǎng)5 d時(shí)，誘變菌落直徑最高達(dá)到1.83 cm，與劉明科等［25］的研究相近。9株菌在3～8 d的菌落生長速率如圖3d所示，其中Ⅱ164和Ⅱ111的生長速率都為0.28 cm/d，較CK有顯著性差異（P<0.05），這與于士將等［26］研究中最快的菌株生長速率為2.86 mm/d的結(jié)果一致。由此推斷，電子束輻照對漸狹蠟蚧菌3166的菌落生長正突變效應(yīng)較強(qiáng)，60Co-γ射線輻照效果較弱。

2.3.2 電子束及60Co-γ射線輻照對漸狹蠟蚧菌產(chǎn)孢生長速率的影響

如圖4所示：漸狹蠟蚧菌在0～48 h內(nèi)主要生命活動(dòng)為孢子萌發(fā)和菌絲生長，產(chǎn)孢量極少，產(chǎn)孢速率僅為102～103 （CFU·mL-1·h-1）；48～72 h開始大量產(chǎn)孢，產(chǎn)孢速率急速上升至105～106 （CFU·mL-1·h-1）；72～96 h時(shí)菌株最高產(chǎn)孢速率可達(dá)107 （CFU·mL-1·h-1）。以上結(jié)果表明，48～96 h是漸狹蠟蚧菌大量產(chǎn)孢的時(shí)期。殷華等［27］和謝明［28］研究了蠟蚧菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)蠟蚧菌的產(chǎn)孢速率在培養(yǎng)24 h內(nèi)即可達(dá)到106～107 （CFU·mL-1·h-1），培養(yǎng)時(shí)間相差較大是由于謝明研究中的孢懸液接種量較大為108 （CFU·mL-1·h-1），但其生長趨勢與本研究中48～96 h內(nèi)的產(chǎn)孢速率一致。

研究發(fā)現(xiàn)：0～72 h內(nèi)Ⅱ183、Ⅱ111、Ⅱ113號(hào)菌株的產(chǎn)孢速率較CK顯著提高（P<0.05）；72～96 h內(nèi)Ⅱ164、Ⅱ181號(hào)菌株產(chǎn)孢速率較CK顯著提高（P<0.05）。結(jié)果表明，電子束輻照對漸狹蠟蚧菌3166的產(chǎn)孢能力有正向突變作用，60 Co-γ射線輻照對漸狹蠟蚧菌3166產(chǎn)孢能力未見有顯著性突變作用。

2.4 輻照誘變漸狹蠟蚧菌產(chǎn)孢速率遺傳穩(wěn)定性

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，選取了5株較出發(fā)菌株的產(chǎn)孢速率有顯著性變化的誘變菌株，繼代培養(yǎng)6次，測定第2代及第8代菌株在0～96 h內(nèi)的產(chǎn)孢速率，評(píng)估產(chǎn)孢速率的遺傳穩(wěn)定性。由圖5可知，5株誘變菌株經(jīng)6次傳代后，6代內(nèi)產(chǎn)孢速率無顯著變化（P>0.05），表明這5株誘變菌株均具有良好的產(chǎn)孢遺傳穩(wěn)定性。

2.5 漸狹蠟蚧菌菌株胞外酶的研究

2.5.1 誘變漸狹蠟蚧菌胞外酶比活隨時(shí)間變化規(guī)律

繪制N -乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，x軸為幾丁質(zhì)酶比活，y軸為吸光度值，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.005 7x – 0.009 2，R2=0.999 2。測定突變菌株Ⅱ164號(hào)1～7 d的胞外幾丁質(zhì)酶比活力，如圖6a所示，其幾丁質(zhì)酶比活力表現(xiàn)出隨時(shí)間延長呈先升高后降低的趨勢，這同董晶等［29］的研究一致。幾丁質(zhì)酶比活從第2天開始急劇升高，在第5天達(dá)到最高，每小時(shí)酶比活達(dá)到了1 707.41 U/mg prot。因此選擇培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液測定漸狹蠟蚧菌的幾丁質(zhì)酶比活。

繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，x軸為蛋白酶比活，y軸為吸光度值，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.007 7x + 0.014 3，R2=0.998 3。測定突變菌株Ⅱ164號(hào)1～7 d的胞外蛋白酶比活力，如圖6 b所示，其蛋白酶比活力表現(xiàn)出隨時(shí)間增加而增加的趨勢，同彭國良等［30］的研究相似。蛋白酶比活力在7 d內(nèi)屬第7天為最高，每分鐘酶比活力達(dá)到29.45 U/mg prot，且第4、5、6、7天的蛋白酶比活力之間存在顯著差異，后續(xù)選擇培養(yǎng)7 d的漸狹蠟蚧菌發(fā)酵液測定蛋白酶比活。

2.5.2 電子束輻照對漸狹蠟蚧菌胞外酶的影響

根據(jù)2.5.1的研究結(jié)果，制備漸狹蠟蚧菌培養(yǎng)5 d的胞外幾丁質(zhì)酶液和培養(yǎng)7 d的胞外蛋白酶液，分別測定幾丁質(zhì)酶比活和蛋白酶比活，結(jié)果如圖7所示。突變菌株Ⅱ111、Ⅱ164、Ⅱ181的幾丁質(zhì)酶比活顯著高于出發(fā)菌株CK（P<0.05），分別提高29.29%、54.45%、19.18%；Ⅱ111、Ⅱ164、Ⅱ181的蛋白酶比活顯著高于出發(fā)菌株CK（P<0.05），分別提高17.98%、13.17%、16.50%。

2.6 誘變漸狹蠟蚧菌生長特性與胞外酶比活性的相關(guān)性分析

根據(jù)2.3.2的結(jié)果可知，漸狹蠟蚧菌在液體培養(yǎng)48～96 h內(nèi)大量產(chǎn)孢，在此期間，幾丁質(zhì)酶比活也急劇上升，且由表1可知，蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶比活和產(chǎn)孢濃度之間相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。幾丁質(zhì)酶比活與菌落生長之間的相關(guān)系數(shù)為0.897，達(dá)到極顯著水平（P<0.01），相比幾丁質(zhì)酶比活和產(chǎn)孢濃度之間相關(guān)性較低的原因是菌落的生長主要代表菌絲的生長狀況，屬于勻速生長。蛋白酶比活與菌落生長之間相關(guān)性達(dá)到顯著水平（P<0.05），但與產(chǎn)孢濃度極顯著相關(guān)（P<0.01）。由此可見，漸狹蠟蚧菌胞外酶比活與產(chǎn)孢量的相關(guān)性更強(qiáng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，蠟蚧菌等蟲生真菌胞外蛋白酶比活及幾丁質(zhì)酶比活與殺蟲毒力存在相關(guān)性［29-33］，且菌株生長速率、產(chǎn)孢量也與殺蟲毒力存在極顯著相關(guān)性［34-36］，這與本研究中菌株生長特性與胞外酶比活之間的相關(guān)性的結(jié)論一致。

3 討論

漸狹蠟蚧菌的殺蟲機(jī)制是利用分生孢子附著在昆蟲表皮后，分生孢子萌發(fā)并侵染蟲體，并產(chǎn)生多種蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等物質(zhì)降解蟲體角質(zhì)層，使真菌順利進(jìn)入昆蟲血腔，菌絲在昆蟲體內(nèi)生長，分泌內(nèi)毒素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)利用昆蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖，最終入侵昆蟲全器官，致昆蟲死亡，達(dá)到防治蟲害的作用［37-38］。可見分生孢子侵染和活性酶的產(chǎn)生是漸狹蠟蚧菌殺蟲的兩個(gè)重要過程，但由于漸狹蠟蚧菌產(chǎn)孢速度較慢，限制了其在田間的大規(guī)模應(yīng)用。

為改善漸狹蠟蚧菌的應(yīng)用現(xiàn)狀，本研究采用電子束射線和60Co-γ射線輻射誘變生防真菌漸狹蠟蚧菌。誘變育種是擴(kuò)大微生物應(yīng)用空間的一大手段，其中輻射誘變更是選育微生物的重要手段，輻射能量使生物體各分子發(fā)生電離和激發(fā)，通過一系列反應(yīng)產(chǎn)生活潑自由基，與大分子物質(zhì)如核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，引起分子結(jié)構(gòu)的變化，致使生物體發(fā)生染色體畸變和基因突變等變化［39-40］，再對突變后的菌株擇優(yōu)篩選，從而得到具有優(yōu)良遺傳性狀的突變菌株。

本試驗(yàn)通過研究不同射線源誘變菌株的菌落特征和生長速率等方面，發(fā)現(xiàn)電子束對漸狹蠟蚧菌的誘變效果較60Co-γ射線明顯，電子束誘變可顯著提高漸狹蠟蚧菌與殺蟲相關(guān)的胞外酶比活性，且漸狹蠟蚧菌的產(chǎn)孢量與胞外酶比活呈顯著相關(guān)性，這與已有研究中生防真菌綠僵菌的產(chǎn)孢量下降后，酶活與昆蟲致病力也隨之降低［41-42］以及白僵菌的胞外酶酶活越高對昆蟲的致死率越大［43-46］的結(jié)果一致。本研究可為輻照誘變技術(shù)提高蠟蚧菌菌株的害蟲防治效果提供理論依據(jù)，也為蠟蚧菌后續(xù)的生防產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

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