黃靜 李琪睿 李禹澤 宋海迪 劉安琪 宋振祥 趙晉遠(yuǎn) 宣宇佳 白慧茹 霍志鑫 易新容 顧捷 王亞麗 陳麗琴

收稿日期：2023-06-06; 修回日期：2023-08-29。

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019MS08155）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210132063）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新“英才培育”項(xiàng)目（YCPY2023104）。

* 通信作者：陳麗琴，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事法醫(yī)遺傳學(xué)和法醫(yī)病理學(xué)研究，E-mail： lqchenyj@163.com；

王亞麗，實(shí)驗(yàn)師，主檢法醫(yī)師，從事法醫(yī)遺傳學(xué)和法醫(yī)病理學(xué)研究，E-mail： yali.shirley@foxmail.com。

摘 要：本研究以10例甲醛固定石蠟包埋組織（FFPET）作為疑難檢材，將其制成蠟?zāi)ぃ謩e以二甲苯-Chelex100法、脫蠟液-Chelex100法、脫蠟液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation試劑盒（簡稱FP試劑盒）、脫蠟液-北京天根石蠟包埋組織基因組提取試劑盒法（簡稱天根試劑盒）提取DNA，進(jìn)行紫外分光光度計(jì)測定（濃度、純度）及短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分型檢測（23個(gè)常染色體），通過比較分析FFPET在4種不同提取方法中的提取質(zhì)量、STR分型質(zhì)量和檢出率，從而尋求一種高效簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、方便快捷的甲醛固定石蠟包埋組織中DNA提取方法。結(jié)果表明：應(yīng)用4種方法提取的石蠟包埋組織蠟?zāi)NA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定后顯示，應(yīng)用2種Chelex100法提取的DNA濃度高于2款試劑盒，試劑盒提取的DNA的純度優(yōu)于另外2種方法，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FP試劑盒提取DNA的平均濃度和純度均優(yōu)于天根試劑盒，無顯著性差異（P>0.05）；STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之間的擴(kuò)增不均衡，呈現(xiàn)前高后低狀態(tài)；STR平均檢出率為FP試劑盒>天根試劑盒>Chelex100法，2種Chelex100法STR基因座檢出率比較無顯著差異（P>0.05），但分別和另外2種方法試劑盒方法相比有顯著差異（P<0.05），F(xiàn)P試劑盒和天根試劑盒法相比有顯著差異（P<0.05）。因此，在涉及甲醛固定石蠟包埋組織這類疑難檢材的法醫(yī)DNA鑒定案件時(shí)，脫蠟液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation試劑盒法優(yōu)于其余3種提取DNA方法。

關(guān)鍵詞：甲醛固定石蠟包埋組織；法醫(yī)檢材；疑難檢材；方法比較

中圖分類號：DF795.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.007

A Comparative Analysis of Four Different DNA Extraction Methods from Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue in Forensic Medicine

HUANG Jing1， LI Qirui1， LI Yuze1， SONG Haidi1， LIU Anqi1， SONG Zhenxiang2， ZHAO Jinyuan1，

XUAN Yujia1， BAI Huiru1， HUO Zhixin1， YI Xinrong1， GU Jie1， WANG Yali1*， CHEN Liqin1*

（1. Department of Forensic Medicine， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010030， China; 2. Department of Cardiovascular Surgery， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010030， China）

Abstract： The study used myocardial tissues of 10 forensic FFPET patients and the samples were prepared into films. The DNA was extracted using xylene-Chelex100 method， dewaxing solution-Chelex100 method， dewaxing solution-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation kit （abbreviated as FP kit） and dewaxing solution-Beijing Tiangen paraffin-embedded tissue genome extraction kit （abbreviated as Tiangen kit）， and determined by ultraviolet spectrophotometer for concentration and purity， and short tandem repeats （STR） typing test （23 autosomes）. The extraction quality， STR typing quality and detection rate of FFPET in four different extraction methods were compared and analyzed to find an efficient， simple， economical， practical， and convenient method. The results showed that for the quality of extrated DNA， the concentration of DNA extracted by two Chelex100 methods were higher than the two test kits， and the purity of DNA extracted by the kits were superior to that of the other two methods. The differences were statistically significant （P<0.05）. The average concentration and purity of DNA extracted by FP kit were superior to those by Tiangen kit without significant differences （P>0.05）. For the quality of STR typing and detection rate， STR typing generally shows the imbalance of amplification between different loci and different alleles of the same locus， with the former being higher and the later lower. The average detection rate of STR was in the order of： FP kit >Tiangen kit>Chelex100 method. There were no significant difference in the detection rates of STR loci between the two Chelex100 methods （P>0.05）， whereas there were significant differences between them and the other two methods （P<0.05）. There was a significant difference between the FP kit and Tiangen kit （P<0.05）. Therefore when dealing with difficult samples such as formaldehyde-fixed paraffin-embedded tissues in forensic DNA identification cases， the dewaxing solution-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation kit was superior to the other three DNA extraction methods.

Key words： formalin-fixed paraffin-embedded tissue; forensic examination materials; difficult inspection materials; method comparison

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（5）： 441-449）

甲醛固定石蠟包埋組織（formalin-fixed paraffin-embedded tissue，F(xiàn)FPET）是法醫(yī)鑒定中重要的存檔材料，可用于個(gè)人識別、親權(quán)鑒定、分子診斷以及一些案例的回顧性分析，在醫(yī)療糾紛及詐保案等案件鑒定中有時(shí)作為唯一的生物樣本。由于受到多種化學(xué)物理因素的影響，F(xiàn)FPET的DNA易斷裂、DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)［1-4］造成生物檢材的高度降解，從而導(dǎo)致DNA提取比較困難；此外，DNA蛋白的交聯(lián)作用會(huì)抑制DNA聚合酶活性從而影響PCR擴(kuò)增，同時(shí)石蠟會(huì)阻礙組織的消化和DNA的釋放，這些因素均會(huì)影響DNA的提取。1985年Goelz等［1］最先提出石蠟包埋組織提取技術(shù)，即為經(jīng)典的提取方法酚——氯仿抽提法；Howe等［5］提出氯化鈉鹽析法提取石蠟包埋組織，其方法操作簡單、速度快，造價(jià)低，而且不需要接觸酚、氯仿等有毒化學(xué)品。水煮法、微波法、單純消化法早年應(yīng)用較多，但各有優(yōu)缺點(diǎn)［6］。近年來，各類石蠟提取DNA的商品化試劑盒被開發(fā)出來，應(yīng)用較廣且提取效果較好的是Qiagen的QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒，但價(jià)格昂貴，其他的如北京天根提取試劑盒、湖南圣湘提取試劑盒等應(yīng)用也較多［7］?；贔FPET的高度降解、石蠟的影響因素，且考慮到二甲苯脫蠟的高效性和其自身具有的毒性［8-9］，我們選取了4種不同的提取甲醛固定石蠟包埋組織DNA方法進(jìn)行比較分析，尋求一種高效簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、方便快捷的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究樣本為收集于4例案件的10份不同部位的甲醛固定石蠟包埋心肌組織，均為內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心法醫(yī)病理鑒定室近半年存檔的標(biāo)本材料，且選取的樣本非腫瘤組織、無明顯自溶，具體信息見表1。將石蠟組織制作成厚度為10 μm每張的蠟?zāi)そM織，每5張為一組。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇（光華科技有限公司，廣東），二甲苯（科密歐化學(xué)試劑有限公司，天津），格林GS脫蠟液（格林標(biāo)本技術(shù)開發(fā)有限公司，哈爾濱），Chelex100（Bio-RAD公司，美國），蛋白酶K（10 mg/μL）（Promega公司，美國），二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）（百奧萊博科技有限公司，北京），Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation試劑盒（Vazyme公司，南京），北京天根石蠟包埋組織基因組提取試劑盒（天根生化科技公司，北京），Verifiler Plus Early Access試劑盒（Thermo Fisher公司，美國），Hi-Di formamide（Thermo Fisher公司，美國）。

RM2255切片機(jī)（徠卡公司，德國），H203-H型恒溫金屬浴（卡尤迪生物科技有限公司，北京），NanoDropND-2000c型紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司，美國），9700型PCR擴(kuò)增儀（Thermo Fisher公司，美國），3130型遺傳分析儀（Thermo Fisher公司，美國）。

1.3 DNA提取及定量

1.3.1 DNA提取

脫蠟液-Chelex100法：向1.5 mL裝有5張10 μm厚蠟?zāi)さ腅P管中加入1 mL脫蠟液溶液，37℃金屬浴10 min，13 000 r/min離心15 min，小心吸去棄掉脫蠟液；加入1 mL無水乙醇洗滌，上下顛倒3 min， 13 000 r/min離心15 min，棄去無水乙醇（重復(fù)該步驟2～3次）；室溫開蓋放置直至殘留乙醇揮發(fā)完全；加入200 μL的5% Chelex100、10 μL的20 mg/mL的蛋白酶K和10 μL的1 mol/L的DTT，56℃孵育過夜；98℃煮沸8 min，13 000 r/min離心3 min，上清液即為提取的DNA。

二甲苯-Chelex100法：向1.5 mL裝有5張10 μm厚蠟?zāi)さ腅P管中加入1 mL二甲苯溶液，后續(xù)操作步驟同脫蠟液-Chelex100法。

天根試劑盒法：根據(jù)天根試劑盒說明書操作。1）將5張10 μm厚蠟?zāi)ぱb于1.5 mL無菌離心管中，加入500 μL裂解液GL，再加入50 μL緩沖液GP，劇烈渦旋10 s。2）98℃孵育30 min，期間顛倒混勻3次，直至樣品完全溶解，12 000 r/min離心5 min。3）使用200 μL槍頭沿管壁小心吸取中間層的水相清液于新的離心管中。4）加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，靜置3 min。5）將上一步所得的混合液加入一個(gè)吸附柱CR2中，8 000 r/min室溫離心2 min，倒掉收集管中的廢液，重新將吸附柱放回收集管中。6）向吸附柱CR2中加入500 μL緩沖液GD，8 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。7）向吸附柱CR2中加入600 μL漂洗液PW，8 000 r/min室溫離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。8）重復(fù)第7步。9）將吸附柱CR2放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。10）將吸附柱開蓋置于室溫放置2～5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。11）將吸附柱CR2轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加65℃預(yù)熱的30～100 μL洗脫緩沖液TE洗脫，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將收集有DNA的離心管-20℃保存。

FP試劑盒法：根據(jù)FP試劑盒說明書操作。

1）加入0.6 mL Deparaffinization Solution至樣品中，劇烈渦旋5 s，短暫離心讓樣品浸泡到脫蠟液中，56℃水浴6 min，劇烈渦旋20 s。2）14 000 r/min離心2 min，棄上清。3）加入200 μL Buffer FTL和20 μL Proteinase K工作液至樣品中，渦旋混勻，56℃水浴1 h至樣品完全消化，其間需顛倒混勻數(shù)次。4）90℃水浴1 h。5）加入200 μL Buffer FL和200 μL無水乙醇至上述處理液中，渦旋混勻15 s。6）將FFPE DNA吸附柱置于收集管中，轉(zhuǎn)移混合液至吸附柱中，10 000 r/min離心60 s。7）棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入500 μL Buffer FW1（已加入乙醇）至吸附柱，10 000 r/min離心60 s。8）棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入650 μL Buffer FW2（已加入乙醇）至吸附柱，10 000 r/min離心60 s。9）棄濾液，將吸附柱置于收集管中，10 000 r/min離心空柱3 min。10）將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，開蓋3 min（揮發(fā)乙醇），加入15～50 μL Elution Buffer至吸附柱膜中央，室溫靜置1 min，10 000 r/min離心1 min。11）丟棄吸附柱，將DNA保存于-20℃。

1.3.2 DNA定量

通過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA定量，測定其質(zhì)量濃度和純度，其純度用OD260 nm/OD280 nm來表示。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳分型

PCR擴(kuò)增：采用10.0 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，Verifiler Plus Early Access試劑盒體系組成包括5×PCR Master Mix 2.5 μL，10×Primer Set 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，去離子水5.5 μL。采用標(biāo)準(zhǔn)品007作為陽性對照，去離子水作為陰性對照。

PCR條件：95℃預(yù)變性1 min；96℃變性10 s，62℃退火90 s，2個(gè)循環(huán)；96℃變性10 s，59℃退火90 s，27個(gè)循環(huán)；68℃終延伸5 min；4℃保溫。

電泳分型：擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物變性后在3130型遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，體系為9.8 ?L甲酰胺，0.2 ?L分子量內(nèi)標(biāo)LIZ600，1.0 ?L的PCR產(chǎn)物；用Gene Mapper ID-X軟件對23個(gè)常染色體STR基因座進(jìn)行分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對各組樣本DNA質(zhì)量和STR基因座檢出情況應(yīng)用SPSS25.0軟件進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA質(zhì)量

應(yīng)用4種DNA提取法得到的DNA質(zhì)量濃度均大于10 ng/μL，其中二甲苯-Chelex100法提取的DNA平均質(zhì)量濃度最高，天根試劑盒法提取的DNA平均質(zhì)量濃度最低，脫蠟液-Chelex100法提取的DNA平均質(zhì)量濃度高于FP試劑盒法。應(yīng)用4種DNA提取法得到的DNA平均純度均大于0.60，其中2款試劑盒法由于對DNA進(jìn)行純化，因此DNA平均純度大于1.40，高于2種Chelex100法提取的DNA純度。脫蠟液-Chelex100法提取的DNA平均純度最低，為0.74±0.09；FP試劑盒法提取的DNA平均純度最高，為1.83±0.08，具體信息見表2。應(yīng)用2種Chelex100法提取的DNA平均質(zhì)量濃度高于2款試劑盒，試劑盒提取的DNA的平均純度優(yōu)于另外2種方法，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。FP試劑盒提取DNA平均質(zhì)量濃度和純度均優(yōu)于天根試劑盒，此結(jié)果無顯著性差異（P<0.05）

2.2 STR基因座分型質(zhì)量和檢出率

2.2.1 STR基因座分型質(zhì)量

STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之間的擴(kuò)增不均衡，均符合降解檢材典型圖譜：小片段分型的峰高較高，大片段峰高較低，呈現(xiàn)前高后低的趨勢。圖1為經(jīng)二甲苯-Chelex100提取法后得到的STR分型圖譜（8-GE-L-CE），符合降解檢材的圖譜。

2.2.2 STR基因座檢出率

10份甲醛固定石蠟包埋組織蠟?zāi)そ?jīng)Verifiler Plus Early Access試劑盒檢測，STR基因座檢出率最大為100%（23/23），最小為39.13%（9/23），具體信息見圖2。其中，分型完整的圖譜包括應(yīng)用脫蠟液-Chelex100提取法為1例，F(xiàn)P試劑盒法為4例。圖3為應(yīng)用FP試劑盒提取DNA得到的STR分型完整圖譜（10-G-L-FP）。圖4為應(yīng)用脫蠟液-Chelex100法提取DNA得到STR檢出率最低的樣本（8-Z-L-T）。圖5為應(yīng)用天根試劑盒法提取DNA得到的STR圖譜（tg-8-L-Y）。STR基因座平均檢出率：FP試劑盒>天根試劑盒>二甲苯-Chelex100法>脫蠟液-Chelex100法。2種Chelex100法STR基因座檢出率比較無顯著差異（P>0.05），但分別和另外2種試劑盒法相比有顯著差異（P<0.05）；FP試劑盒和天根試劑盒法相比有顯著差異（P<0.05）。

2.3 耗時(shí)、成本、環(huán)保對比分析

從耗時(shí)上分析，Chelex100法提取DNA涉及到孵育過夜，用時(shí)最長；天根試劑盒用時(shí)最短，為90 min。從成本上分析，Chelex100法成本最低，F(xiàn)P試劑盒成本約為天根試劑盒的1.5倍以上，成本較高。從環(huán)保角度分析，脫蠟液比二甲苯脫蠟液脫蠟更環(huán)保；FP和天根試劑盒法用于脫蠟的試劑未涉及到二甲苯，此法較二甲苯脫蠟更環(huán)保。具體信息見表3。

3 討論

FFPET是法醫(yī)鑒定中重要的存檔材料，中性甲醛是福爾馬林固定液中的主要成分，能夠保持人體死后組織細(xì)胞的完整性， 固定組織的同時(shí)對 DNA分子產(chǎn)生不利，DNA分子呈可逆性羥甲基化，并與蛋白質(zhì)交聯(lián)后形成穩(wěn)固的復(fù)合物，不利于DNA的提?。?0-12］；甲醛在空氣中易氧化成甲酸，甲酸對DNA有較強(qiáng)的降解作用；此外，石蠟組織經(jīng)過多種理化因素作用后，組織細(xì)胞內(nèi)的DNA脆性增加，使其在提取過程中更容易斷裂，導(dǎo)致DNA提取比較困難［13］。因此，探索該類型組織樣本適宜的DNA提取方法很有意義。

有研究表明，切片太薄容易將DNA片段切斷，不利于大片段DNA的提取，太厚會(huì)增加PCR反應(yīng)的抑制物，不利于后續(xù)PCR擴(kuò)增，切片厚度為10 μm時(shí)提取的DNA質(zhì)量更高［11-13］。因此，本研究用到的石蠟切片的厚度為每張10 ?m的蠟?zāi)そM織，每5張為一組，有利于提取出質(zhì)量較高的DNA。FFPET DNA提取包括脫蠟、消化和純化這3個(gè)過程。有機(jī)溶劑二甲苯對試驗(yàn)者身體有危害，同時(shí)對環(huán)境有污染［15，17］，因此本研究中4種DNA提取法用到非二甲苯和二甲苯脫蠟法。通過比較發(fā)現(xiàn)，同樣應(yīng)用Chelex100法進(jìn)行提取DNA，二甲苯和非二甲苯環(huán)保型脫蠟液的脫蠟效果相當(dāng)，因此，在脫蠟環(huán)節(jié)上，可使用環(huán)保脫蠟液代替二甲苯脫蠟。

Chelex100是一種金屬離子螯合劑，能與鎂、鈣等核酸反應(yīng)生成必需的二價(jià)金屬陽離子螯合，從而保護(hù)DNA，并減少由降解的DNA片段形成的雜帶，從而提高PCR反應(yīng)陽性率及重復(fù)率［13，15］。Chelex100法是法醫(yī)物證生物檢材DNA提取最常用的方法之一，其提取FFPET價(jià)格低廉、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡便，在同一個(gè)EP管中進(jìn)行，減少了污染風(fēng)險(xiǎn)，但其提取的DNA雜質(zhì)較多，因此適用于大批量檢材進(jìn)行DNA粗略提?。?6，19］。商品化的試劑盒提取法FFPET主要是通過應(yīng)用特殊的裂解條件釋放FFPET中的DNA，在高鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜，經(jīng)過一系列快速的漂洗和離心，將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，再用低鹽的緩沖液將DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫［20-22］。2款商品化試劑盒各有優(yōu)點(diǎn)、各有不足：在涉及FFPET檢材樣本量有限的情況下進(jìn)行DNA提取時(shí)，F(xiàn)P試劑盒法的DNA檢出質(zhì)量以及STR分型更為理想，便于進(jìn)行后續(xù)的鑒定與分析；在進(jìn)行快速DNA提取時(shí)，天根試劑盒耗時(shí)最短，且DNA提取質(zhì)量較好，可應(yīng)用于需要快速DNA提取的案件之中。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ GOELZ S E， HAMILTON S R， VOGELSTEIN B. Purification of DNA from formaldeyde fixed and paraffin-embedded tissues［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1985， 130（1）： 118-126.

［2］ SATO Y， SUGIE R， TSUCHYA B， et al. Comparison of the DNA extraction methods for polymerase chain reation amplification from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues［J］. Diagnostic Molecular Pathology， 2001， 10（4）： 256-271.

［3］ LEGRAND B， MAZANCOURT P， DURIGON M， et al. DNA genotyping of unbuffered formalin fixed paraffin embedded tissues［J］. Forensic Science International： Genetics， 2001， 125（2）： 205-211.

［4］ 柳燕， 李莉， 趙珍敏， 等. 甲醛固定石蠟包埋組織STR分型檢測［J］. 法醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 25（5）： 337-340， 344.

LIU Yan， LI Li， ZHAO Zhenmin， et al. STR genotyping in unbuffered formalin fixed paraffin embedded tissue［J］. Journal of Forensic Medicine， 2009， 25（5）： 337-340， 344.

［5］ HOWE J R， KLIMSTRA D S， CORDON-CARDO C. DNA extraction from paraffin-embedded tissues using a salting-out procedure： a reliabie method for amplification of archival material［J］. Histol Histopathol， 1997， 12（3）： 595-601.

［6］ 黃幼生， 宋偉偉， 鄧曉佳， 等. 四種微量石蠟組織DNA提取方法的比較［J］. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010， 16（9）： 1120-1123.

HUANG Yousheng， SONG Weiwei， DENG Xiaojia， et al. Comparison of four DNA extraction methods from paraffin tissue ［J］. Journal of Hainan Medical College， 2010，16（9）： 1120-1123.

［7］ 管力， 白麗燕， 王瑞曉， 等. 不同處理方式及試劑盒對石蠟包埋組織提取DNA影響［J］. 生物技術(shù)世界， 2015（5）： 12-15.

GUAN Li， BAI Liyan， WANG Ruixiao， et al. Effects of different treatment methods and kits on DNA extraction from paraffin-embedded tissues ［J］. Biotechnology World， 2015（5）： 12-15.

［8］ 時(shí)姍姍， 余波， 馬恒輝， 等. 在分子病理檢測中環(huán)保透明脫蠟液與二甲苯應(yīng)用的比較［J］. 診斷病理學(xué)雜志， 2013， 20（12）： 794-795.

SHI Shanshan， YU Bo， MA Henghui， et al. Comparison of the application of environmentally friendly transparent dewaxing solution and xylene in molecular pathological detection ［J］. Journal of Diagnostic Pathology， 2013， 20（12）： 794-795.

［9］ 李一平， 周磊， 曹佳實(shí)， 等. 石蠟標(biāo)本DNA提取優(yōu)化方案［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版）， 2015， 12（3）： 6-9.

LI Yiping， ZHOU Lei， CAO Jiashi， et al. Optimization plan for DNA extraction from paraffin specimens ［J］. Journal of Hunan Normal University （Medical Edition）， 2015， 12（3）： 6-9.

［10］ 譚卓毅， 丁梅， 王保捷. 甲醛固定石蠟包埋組織中DNA提?。跩］．法醫(yī)學(xué)雜志， 2006， 22（6）： 455-458．

TAN Zhuoyi， DING Mei， WANG Baojie. DNA extraction from formalin fixed paraffin embedded tissues ［J］. Journal of Forensic Medicine， 2006， 22（6）： 455-458.

［11］ 郭麗， 祁榮， 臧旭， 等. 甲醛固定石蠟包埋胃癌組織中三種DNA提取方法的比較［J］. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志， 2016， 32（12）： 1412-1413.

GUO Li， QI Rong， ZANG Xu， et al. Comparison of three DNA extraction methods in formalin fixed paraffin embedded gastric cancer tissue ［J］. Journal of Clinical and Experimental Pathology， 2016， 32（12）： 1412-1413.

［12］ 張曉萍， 劉輝， 袁健， 等. 兩種石蠟包埋組織DNA提取方法的比較［J］. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版）， 2009， 35（1）： 35-37.

ZHANG Xiaoping， LIU Hui， YUAN Jian， et al. Comparison of two methods for extracting DNA from paraffin embedded tissues ［J］. Journal of Lanzhou University （Medical Edition）， 2009， 35 （1）： 35-37.

［13］ 張旭垠， 易曉芳， 丁景新， 等. 石蠟包埋組織中4種DNA提取方法的比較研究［J］. 中國婦幼健康研究， 2007（4）： 291-293.

ZhANG Xuyin， YI Xiaofang， DING Jingxin， et al. Comparative study of four DNA extraction methods in paraffin embedded tissues ［J］. China Maternal and Child Health Research， 2007（4）： 291-293.

［14］ 潘曉蔚， 顏紅軍. 從石蠟包埋組織中提取DNA的方法探討［J］. 中國醫(yī)藥指南， 2011， 9（30）： 263-264.

PAN Xiaowei， YAN Hongjun. Discussion on the method of extracting DNA from paraffin embedded tissue ［J］. Chinese Medical Guidelines， 2011， 9（30）： 263-264.

［15］ 武貴臻， 夏米西努爾·伊力克， 楊曦， 等. 不同方法提取石蠟包埋組織DNA的比較分析［J］. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 32（2）： 128-130.

WU Guizhen， Xiamixinuer·Yilike， YANG Xi， et al. Comparative analysis of DNA extraction from paraffin embedded tissues using different methods［J］. Journal of Xinjiang Medical University， 2009， 32 （2）： 128-130.

［16］ 陳啟龍， 聶劉旺， 王洋， 等. 石蠟包埋肺癌組織DNA提取方法的改進(jìn)［J］. 腫瘤防治雜志， 2004（4）： 355-357.

CHEN Qilong， NIE Liuwang， WANG Yang， et al. Improvement of DNA extraction method for paraffin embedded lung cancer tissue ［J］. Journal of Cancer Prevention and Treatment， 2004（4）： 355-357.

［17］ 徐培， 何小艷， 李慧， 等. 石蠟包埋組織DNA快速提取法在分子病理檢測中的應(yīng)用［J］.診斷病理學(xué)雜志， 2015， 22（12）： 804-805.

XU Pei， HE Xiaoyan， LI Hui， et al. The application of paraffin embedded tissue DNA rapid extraction method in molecular pathological detection ［J］. Journal of Diagnostic Pathology， 2015， 22（12）： 804-805.

［18］ 呂晉， 王慧君， 劉超， 等. 福爾馬林固定石蠟包埋組織3種DNA提取方法比較［J］. 中國法醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 28（3）： 239-241.

LYU Jin， WANG Huijun， LIU Chao， et al. Comparison of three DNA extraction methods for formalin fixed paraffin embedded tissues ［J］. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2013， 28（3）： 239-241.

［19］ WANG X Y， YU C X. Research advances on DNA extraction methods from peripheral blood mononuclear cells［J］. Chinese Journal of Experimental Hematology， 2014， 22（5）： 1495-1498．

［20］ 劉淑芳， 呂曉革， 王英元. 高度腐敗組織不同DNA提取方法的比較［J］. 中國法醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 24（6）： 408-409.

LIU Shufang， LYU Xiaoge， WANG Yingyuan. Comparison of different DNA extraction methods for highly corrupt tissues ［J］. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2009， 24（6）： 408-409.

［21］ 潘濤， 雙衛(wèi)兵， 唐彥. 四種DNA提取試劑盒提取效果的比較［J］. 實(shí)用醫(yī)技雜志， 2013（4）： 408-409．

PAN Tao， SHUANG Weibing， TANG Yan. Comparison of the extraction effects of four DNA extraction kits ［J］. Journal of Practical Medical Technology， 2013（4）： 408-409.

［22］ 黃玉梅， 趙瑾， 劉波， 等. 探討兩種石蠟包埋組織DNA提取方法［J］. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志， 2016， 32（5）： 583-584.

HUANG Yumei， ZHAO Jin， LIU Bo， et al. Exploring two methods for extracting DNA from paraffin embedded tissues［J］. Journal of Clinical and Experimental Pathology， 2016， 32（5）： 583-584.