曹麗 朱梓榕 夏梓源 金多 夏立秋

摘 要：聚酮化合物（PKs）作為一大類次級(jí)代謝產(chǎn)物，有著重要的生物活性和潛在的應(yīng)用價(jià)值。鏈霉菌具有合成多種聚酮化合物的潛力，但野生型菌株合成聚酮化合物的產(chǎn)量難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。貯藏脂質(zhì)的降解能為聚酮化合物生物合成提供大量的?；鵆oA前體，因此，控制好脂肪酸與聚酮化合物生物合成通量，有利于促進(jìn)目標(biāo)聚酮化合物的合成。本文綜述了強(qiáng)化脂肪酸β-氧化途徑提高聚酮化合物產(chǎn)量的研究進(jìn)展，為利用β-氧化途徑促進(jìn)聚酮化合物生物合成提供了新的研究策略。

關(guān)鍵詞：聚酮化合物；脂肪酸代謝；β-氧化；生物合成；鏈霉菌

中圖分類號(hào)：Q936? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.001

Research Progress in the Mechanism and Application of Fatty Acid Metabolism Pathway Affecting the Biosynthesis of Polyketides

CAO Li， ZHU Zirong， XIA Ziyuan， JIN Duo， XIA Liqiu*

（Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology， State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish， College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract： As a large class of secondary metabolites， PKs have important biological activity and economic value. Streptomyces has the potential to synthesize a variety of PKs， whereas the yield of PKs synthesized by wild-type strains is difficult to meet the needs of industrial production. The degradation of storage lipids can provide a large number of acyl-CoA precursors for the biosynthesis of PKs. Therefore， controlling the balance of the biosynthetic flux of fatty acids and PKs is conducive to improving the production of the target PKs. This paper briefly reviews on improving the production of PKs by strengthening the fatty acids β-oxidation pathway， and prospects prospective research ideas on improving the biosynthesis of PKs by engineering the β-oxidation pathway.

Key words： polyketides; fatty acid metabolism; β-oxidation; biosynthesis; Streptomyces

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 001-007）

聚酮化合物（polyketides，PKs）是一大類結(jié)構(gòu)復(fù)雜且生物活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物。細(xì)菌、放線菌、真菌和植物均是聚酮化合物的生產(chǎn)者，其中，放線菌科鏈霉菌屬（Streptomyces）更適合或兼容高GC含量的含聚酮合成酶（polyketide synthases，PKSs）的異源生物合成基因簇，且鏈霉菌胞內(nèi)代謝物及中間產(chǎn)物極其豐富，可為聚酮化合物的生物合成提供大量的前體，因此，鏈霉菌在聚酮化合物生產(chǎn)中極具優(yōu)勢(shì)［1-2］。聚酮化合物通過多功能聚酮合成酶催化合成，其合成過程與脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）催化的脂肪酸生物合成類似，均是通過?；o酶A（acyl-CoA）擴(kuò)展單元的脫羧縮合反應(yīng)進(jìn)行的生物合成［3］。根據(jù)聚酮合成酶的結(jié)構(gòu)及其合成機(jī)制，聚酮化合物可被分成3類。I型聚酮化合物，聚酮合成酶是以模塊形式存在的，每個(gè)模塊均含有非重復(fù)使用的催化結(jié)構(gòu)域［4］。I型聚酮化合物每個(gè)模塊均包含?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）和酮合成酶（ketosynthase，KS）結(jié)構(gòu)域。AT將特定的?；鵆oA構(gòu)建塊加載到ACP上，KS催化上游模塊的中間體與ACP之間的碳碳鍵形成，最后，由位于聚酮合成酶碳末端的硫酯酶（thioesterase，TE）結(jié)構(gòu)域完成水解或環(huán)化［5］。除此之外，Ⅰ型聚酮化合物還可能含有將β-酮基修飾為羥基、雙鍵或單鍵的酮還原酶（ketoreductase，KR）、脫水酶（dehydratase，DH）或烯醇還原酶（enoylreductase，ER）的結(jié)構(gòu)域［1］。II型聚酮化合物，聚酮合成酶只使用一套重復(fù)的蛋白質(zhì)催化聚酮碳鏈的縮合反應(yīng)，其主要由酮合成酶α（ketosynthase α，KSα）、酮合成酶β（ketosynthase β，KSβ）和?；d體蛋白3種蛋白質(zhì)組成，產(chǎn)生不同的芳香族代謝物［6］。Ⅲ型聚酮化合物，聚酮合成酶是一個(gè)同源二聚體，聚酮化合物生物合成的所有催化反應(yīng)均在一個(gè)活性位點(diǎn)完成［4］。Ⅲ型聚酮合成酶通常催化不同?；o酶A起始單元與丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）的迭代延伸形成查爾酮和二苯乙烯產(chǎn)物［7］。

聚酮化合物由于具有抗腫瘤、免疫抑制劑、抗菌以及驅(qū)蟲殺蟲等活性，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。例如，紅霉素（erythromycin）具有抗細(xì)菌活性［8］，雷帕霉素（rapamycin）具有免疫抑制活性［9］，多殺菌素（spinosad）和阿維菌素（avermectin）具有驅(qū)蟲和殺蟲活性［10-11］。野生型鏈霉菌合成聚酮化合物的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的需求，增強(qiáng)鏈霉菌合成聚酮化合物的能力一直是研究的熱點(diǎn)。目前，代謝工程是提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量行之有效的方法之一，比如，在聚酮化合物生物合成過程中，采用重組限速酶的過表達(dá)、合成基因簇的異源表達(dá)和強(qiáng)化前體供應(yīng)技術(shù)等。

磷酸激酶（polyphosphate kinase，PPK）的基因ppk被阻斷，使鏈霉菌產(chǎn)抗生素的能力增強(qiáng)。研究表明，ppk基因被阻斷的突變株中發(fā)生的是貯藏脂質(zhì)的降解，而不是己糖分解代謝［12］。另外，通過對(duì)兩種具有相同的脂質(zhì)和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成途徑的模式鏈霉菌進(jìn)行分析，結(jié)果表明，天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）A3（2）是放線菌紫紅素（actinorhodin，Act）的高效生產(chǎn)者，其三酰甘油（triacylglycerols，TAGs）含量約為114 nmol/mg，比變鉛鏈霉菌（Streptomyces lividan）少50%左右。TAGs的降解產(chǎn)生脂肪酸和甘油，脂肪酸部分通過β-氧化降解，產(chǎn)生乙酰輔酶A（acetyl-CoA），增加Act生物合成所需前體的供給，促進(jìn)Act的生物合成。因此，TAGs的積累導(dǎo)致Act生物合成所需前體的減少，從而減少了Act的產(chǎn)量［13］。鏈霉菌中脂質(zhì)含量與抗生素活性之間的負(fù)相關(guān)是一般規(guī)則，而個(gè)別例外可能是由一些與乙酰輔酶A產(chǎn)生或消耗相關(guān)的各種途徑中的一些遺傳差異造成的［14］。鏈霉菌不僅能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特的聚酮化合物，還能夠在膜脂中產(chǎn)生高比例的支鏈脂肪酸（branched chain fatty acids，BCFA），通過工程策略將?；o酶A前體通量從PKs重新定向到BCFA，能夠獲得高產(chǎn)的BCFA生產(chǎn)菌株［15］。同理，通過強(qiáng)化脂肪酸β-氧化途徑，也能將更多的?；o酶A前體引流向聚酮化合物的生物合成［16］。這些研究結(jié)果表明，貯藏脂質(zhì)代謝和聚酮化合物生物合成之間具有一定的聯(lián)系，平衡好脂質(zhì)代謝與聚酮化合物生物合成通量有利于促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成。本文根據(jù)脂肪酸β-氧化途徑工程的研究進(jìn)展，綜述脂肪酸合成乙酰輔酶A代謝途徑與聚酮化合物生物合成之間的聯(lián)系，強(qiáng)化脂肪酸β-氧化途徑能改善聚酮化合物生物合成，為利用β-氧化途徑提高鏈霉菌產(chǎn)聚酮化合物能力的研究提供新的思路。

1 脂肪酸代謝與聚酮化合物合成

聚酮化合物的生物合成過程與脂肪酸的生物合成過程類似，即通過?；o酶A活化的底物之間的重復(fù)脫羧縮合而合成［3］。聚酮化合物則是一大類結(jié)構(gòu)多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其生物合成較復(fù)雜，由聚酮合成酶以“流水線”方式組裝生產(chǎn)，每個(gè)延伸步驟均需要多個(gè)酶結(jié)構(gòu)域催化，由此增加兩個(gè)碳單元［17-18］。在聚酮化合物的生物合成過程中，起始單元主要是單酰輔酶A，如乙酰輔酶A、丙酰輔酶A（propionyl-CoA）。延伸單元主要是雙酰輔酶A，如丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A（methylmalonyl-CoA）。如圖1所示，乙酰輔酶A主要來源于脂肪酸的β-氧化、糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸氧化脫羧、支鏈氨基酸的分解代謝。乙酰輔酶A的流向除了進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）為微生物的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還能在乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）催化下生成丙二酰輔酶A，作為前體物質(zhì)進(jìn)入脂肪酸的生物合成過程［19-20］。乙酰輔酶A作為脂肪酸和聚酮化合物生物合成過程中的共同前體，兩者存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，它不僅是中心碳代謝的一種中間產(chǎn)物，同時(shí)，在決定細(xì)胞分解代謝和合成代謝之間的平衡上至關(guān)重要［21］。

乙酰輔酶A作為大多數(shù)聚酮化合物生物合成的前體，可以通過β-氧化途徑使脂肪酸降解來增加細(xì)胞內(nèi)濃度。脂肪酸首先是在脂酰輔酶A合成酶（fatty acyl-CoA synthetase，ACS）的催化下，生成脂肪酰輔酶A。此后，脂肪酰輔酶A進(jìn)入β-氧化途徑，在一系列酶的作用下，在α碳原子和β碳原子之間斷裂，β碳原子被氧化成羧基，生成含有2個(gè)碳原子的乙酰輔酶A和較原來少2個(gè)碳原子的脂肪酸［22］。因此，脂肪酸的多周期循環(huán)的β-氧化途徑產(chǎn)生的乙酰輔酶A可能是聚酮化合物生物合成的重要組成部分。催化脂肪酸β-氧化途徑第一步的極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶（very long-chain acyl-CoA dehydrogenase，vLCAD）的氧化還原敏感調(diào)節(jié)蛋白PirA的失活，使β-氧化途徑遭到破壞，導(dǎo)致聚酮化合物生物合成前體單體供應(yīng)不平衡，從而抑制聚酮化合物的合成［23］。因此，控制好脂肪酸代謝通量與聚酮化合物生物合成通量之間的平衡，有利于提高目標(biāo)聚酮化合物的產(chǎn)量。在外源脂肪酸的存在下，細(xì)菌會(huì)對(duì)自身脂肪酸生物合成途徑做出下調(diào)反應(yīng)［24］，減少脂肪酸生物合成與聚酮化合物生物合成競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的前體物質(zhì)，有利于聚酮化合物產(chǎn)量提高。

培養(yǎng)基中加入植物油的優(yōu)化策略能夠提高聚酮化合物的產(chǎn)量，但植物油的添加會(huì)影響脂肪酸的代謝和前體供應(yīng)［25］。在阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆油，強(qiáng)化脂肪酸的代謝途徑，不僅可以減緩細(xì)胞內(nèi)脂肪酸生物合成與阿維菌素生物合成競(jìng)爭(zhēng)共同的前體，而且可使更多的脂肪酸進(jìn)入β-氧化途徑生成乙酰輔酶A，提供更多阿維菌素合成前體［26］。在刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）多殺菌素生物合成過程中，當(dāng)外源脂肪酸存在時(shí)，脂肪酸生物合成基因轉(zhuǎn)錄水平下降，而多殺菌素生物合成和β-氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，且利用長(zhǎng)鏈?；o酶A合成細(xì)胞膜脂，短鏈酰基輔酶A如乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A被用作多殺菌素合成前體，這解釋了為什么外源脂肪酸添加能提高聚酮化合物的產(chǎn)量［27］。另外，增強(qiáng)以初級(jí)代謝產(chǎn)物為代表的底物供應(yīng)也能提高聚酮化合物的產(chǎn)量，初級(jí)代謝提供的前體通常是通過碳底物（如脂肪酸、單糖和蛋白質(zhì)）的分解代謝形成的［28］。

2 強(qiáng)化脂肪酸β-氧化途徑促進(jìn)聚酮化合物生物合成

如何提高鏈霉菌產(chǎn)聚酮化合物的能力，一直是菌株改良、代謝工程和發(fā)酵工程的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。以往的研究大多集中在調(diào)控因子水平上，但這種操作很大程度上依賴基因的基因工程或者僅限于在生物合成基因簇上操作，而面對(duì)鏈霉菌次生代謝復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和高拷貝的基因簇，這給操作帶來一定的挑戰(zhàn)以及僅獲得低產(chǎn)量的聚酮化合物的問題，效果并不理想［29-30］。鏈霉菌在發(fā)酵過程中經(jīng)歷了從初級(jí)代謝到次級(jí)代謝的轉(zhuǎn)變，所有次級(jí)代謝都是以初級(jí)代謝的產(chǎn)物為底物進(jìn)行的，了解代謝是如何轉(zhuǎn)變的有利于最大限度生產(chǎn)聚酮化合物等目標(biāo)次級(jí)代謝產(chǎn)物［31］。在初級(jí)代謝過程中，細(xì)胞消耗外部營(yíng)養(yǎng)呈指數(shù)生長(zhǎng)，當(dāng)外部營(yíng)養(yǎng)物被消耗完時(shí)，細(xì)胞停止生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期并開始產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，如聚酮化合物［32］。鏈霉菌不僅能夠產(chǎn)生具有生物活性的聚酮化合物，還能在初級(jí)代謝過程中積累大量的TAGs。TAGs作為一種中性脂質(zhì)化合物，最高可由65%（占細(xì)胞干重）的脂肪酸組成，這代表了鏈霉菌所描述的最高脂質(zhì)含量［33-34］。脂肪酸除了是TAGs的主要組分外，還能合成細(xì)胞膜脂（磷脂和糖脂），用以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。鏈霉菌體內(nèi)TAGs的有效水解能夠產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，游離脂肪酸經(jīng)β-氧化途徑進(jìn)行降解。因此，鏈霉菌體內(nèi)大量積累TAGs，會(huì)導(dǎo)致脂肪酸降解的減少［35］。鏈霉菌初級(jí)代謝和次級(jí)代謝過程具有密切的聯(lián)系，初級(jí)代謝向次級(jí)代謝轉(zhuǎn)變的觸發(fā)因子以及初級(jí)代謝產(chǎn)物如何過渡到穩(wěn)定期用作次級(jí)代謝產(chǎn)物合成底物的機(jī)制尚不清楚。近年來，在初級(jí)代謝到次級(jí)代謝的代謝轉(zhuǎn)變方面的研究獲得突破性進(jìn)展。Wang等［36］首次在代謝水平上發(fā)現(xiàn)鏈霉菌胞內(nèi)TAGs在銜接初級(jí)代謝和聚酮化合物合成過程中起著關(guān)鍵作用。在生長(zhǎng)階段，鏈霉菌利用外源營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的同時(shí)積累內(nèi)源TAGs，當(dāng)菌株停止生長(zhǎng)時(shí)，TAGs開始降解，為聚酮化合物生物合成提供必要的前體和還原力。研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)嗜油白色鏈霉菌ZD11（Streptomyces albus ZD11）TAGs和脂肪酸的降解，有利于為菌體生長(zhǎng)和鹽霉素（salinomycin）的生物合成提供豐富的碳前體［37］。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，脂肪酸生物合成基因在TAGs合成時(shí)上調(diào)，在Act合成和TAGs降解時(shí)下調(diào)，而β-氧化相關(guān)基因則相反［36］。據(jù)此推測(cè)β-氧化相關(guān)基因是TAGs降解的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

啟動(dòng)子工程是提高天然產(chǎn)物產(chǎn)量或發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物的有效策略。組成型啟動(dòng)子持續(xù)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，不能在時(shí)間上協(xié)調(diào)目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成和宿主其他生理代謝之間的平衡，給宿主帶來了代謝負(fù)擔(dān)。因此，利用組成型啟動(dòng)子工程改善宿主的生產(chǎn)能力難以達(dá)到理想的效果，而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能在時(shí)間和強(qiáng)度兩個(gè)方面微調(diào)基因的表達(dá)水平，更適合用于代謝工程提高代謝物的產(chǎn)量［38-39］。為了合理地控制TAGs動(dòng)態(tài)降解，對(duì)脂肪酸降解途徑進(jìn)行優(yōu)化，將編碼ACS的基因sco6196置于cumate誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下，選擇性控制TAGs降解的時(shí)間和強(qiáng)度，從而使更多碳源流向Act的生物合成［36］。該方法使Act、杰多霉素B（jadomycin B）、土霉素（oxytetracycline）和阿維菌素B1a 4種不同模塊的聚酮化合物的產(chǎn)量均顯著提高。其中，阿維菌素B1a產(chǎn)量從6.2 g/L提高到9.3 g/L，產(chǎn)量增加50%，表明該方法具有廣泛的應(yīng)用性［36］。聚酮化合物的生物合成基因簇可以通過攜帶β-氧化基因來調(diào)節(jié)β-氧化途徑，使鏈霉菌能夠有效合成目標(biāo)聚酮化合物并經(jīng)濟(jì)地利用環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)［40］。該研究再次證明了初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的耦合機(jī)制，為促進(jìn)鏈霉菌聚酮化合物的合成制定策略提供了理論依據(jù)。將天藍(lán)色鏈霉菌中參與β-氧化途徑的fadD和fadE基因重組到刺糖多孢菌中，重組菌株產(chǎn)多殺菌素能力顯著增強(qiáng)［25］。

無獨(dú)有偶，美國(guó)Almer等［41］報(bào)道了真菌系統(tǒng)——解脂耶氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）利用β-氧化相關(guān)策略改善真菌系統(tǒng)中多種不同的聚酮化合物生產(chǎn)。通過檸檬酸途徑、丙酮酸旁路途徑和丙酮酸脫氫酶復(fù)合物途徑探索發(fā)現(xiàn)，丙酮酸旁路途徑和丙酮酸脫氫酶復(fù)合物途徑均可以提高聚酮化合物三油酸內(nèi)酯（triacetic acid lactone，TAL）的產(chǎn)量，且丙酮酸旁路途徑使TAL達(dá)到了前所未有的效價(jià)，但其只能在復(fù)雜的培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)，而不能在規(guī)定的培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)，這限制了其在工業(yè)上的實(shí)際應(yīng)用。另外，通過過表達(dá)PEX10證明了β-氧化修飾同樣可以提高TAL的產(chǎn)量［42］。PEX10編碼過氧化物酶體生物發(fā)生因子，過氧化物酶體含多種氧化酶和觸酶，其主要功能是催化脂肪酸的β-氧化，將長(zhǎng)鏈脂肪酸分解為短鏈脂肪酸，從而增強(qiáng)脂肪酸β-氧化途徑。這些結(jié)果表明，脂肪酸β-氧化途徑是提高聚酮化合物產(chǎn)量的有效改良靶點(diǎn)。

3 強(qiáng)化脂肪酸β-氧化途徑提高聚酮化合物產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)

為了提高聚酮化合物的產(chǎn)量，人們采用了過表達(dá)其合成途徑中的限速酶、在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)以及生物合成基因或合成基因簇異源表達(dá)等策略。聚酮化合物生物合成基因簇異源表達(dá)雖然已有很多成功的案例，但異源表達(dá)偶爾獲得較低的產(chǎn)量甚至不能產(chǎn)生目標(biāo)化合物。在鏈霉菌中，聚酮化合物的異源生產(chǎn)可能需要添加前體和輔助因子以調(diào)節(jié)基因簇的轉(zhuǎn)錄和催化蛋白的酶活性［43］。此外，異源生產(chǎn)通常需要構(gòu)建工業(yè)底盤菌株，以消除異源宿主次級(jí)代謝產(chǎn)物同目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)，這是一項(xiàng)繁雜的研究工作［10］。過表達(dá)合成途徑中的限速酶，雖然在一定程度上提高了聚酮化合物產(chǎn)量，但通常僅操縱單一限速酶所達(dá)到的效果有限，為了獲得更高產(chǎn)量的聚酮化合物，無疑要求對(duì)聚酮化合物合成途徑中的多個(gè)限速酶同時(shí)進(jìn)行基因修飾［44］。例如，在過表達(dá)了PEX10的基礎(chǔ)上進(jìn)一步過表達(dá)耶氏酵母菌內(nèi)源性乙酰輔酶A羧化酶ACC1，使TAL、柚皮苷（naringenin）、白藜蘆醇（resveratrol）以及雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin）的產(chǎn)量進(jìn)一步增加，其中柚皮苷的發(fā)酵產(chǎn)量高達(dá)898 mg/L［41］。

脂肪酸降解代謝及其相關(guān)酶在提供聚酮化合物生物合成的前體物質(zhì)方面起著重要的作用。一方面，通過脂肪酸β-氧化途徑的強(qiáng)化，加強(qiáng)體內(nèi)前體供應(yīng)來增加聚酮化合物的生物合成。另一方面，脂肪酸通過多輪β-氧化，產(chǎn)生高水平的還原力和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）［36］。有研究表明，高水平的還原力和ATP控制著TCA，對(duì)TCA循環(huán)過程中α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，KGDH）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）和檸檬酸合成酶（citrate synthase，CS）的活性具有一定的抑制作用［45-46］。因此，增強(qiáng)脂肪酸β-氧化能夠削弱三羧酸循環(huán)，減少其與聚酮化合物生物合成競(jìng)爭(zhēng)共同前體物質(zhì)，使更多碳源流向聚酮化合物生物合成途徑，促進(jìn)聚酮化合物的生物合成。通過合理控制脂肪酸β-氧化相關(guān)基因表達(dá)，使多殺菌素［25］、阿維菌素B1a、杰多霉素［36］以及三油酸內(nèi)酯［47］、柚皮苷和白藜蘆醇［41］等多種聚酮化合物類抗生素的產(chǎn)量得到了提高，這表明該方法具有廣譜適用性。

4 總結(jié)與展望

聚酮化合物是一大類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的次生代謝產(chǎn)物，其中許多聚酮化合物具有重要的生物活性。雖然聚酮化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，但都是由簡(jiǎn)單的小分子?；o酶Ａ分子作為起始單元和延伸單元進(jìn)行連續(xù)的脫羧縮合完成生物合成的，如乙酰輔酶Ａ和丙二酰輔酶Ａ。鏈霉菌發(fā)酵是產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的有效途徑，在發(fā)酵過程中發(fā)生了從初級(jí)代謝到次級(jí)代謝的劇烈轉(zhuǎn)變，所有次級(jí)代謝產(chǎn)物都是建立在初級(jí)代謝的底物基礎(chǔ)上，因此，利用代謝工程策略重新分配碳流量走向，可引導(dǎo)更多的底物從初級(jí)代謝到次級(jí)代謝，有利于高效合成次生代謝產(chǎn)物。乙酰輔酶A既是聚酮化合物生物合成的主要前體物質(zhì)，也是脂類物質(zhì)生物合成的底物，兩者在生物合成過程中共同競(jìng)爭(zhēng)乙酰輔酶A，而脂類降解產(chǎn)生的脂肪酸經(jīng)β-氧化途徑，又可以產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A。因此，通過對(duì)脂肪酸β-氧化途徑進(jìn)行合理工程設(shè)計(jì)優(yōu)化和基因編輯，合理調(diào)控細(xì)胞內(nèi)代謝物相關(guān)途徑，將更多碳源引向聚酮化合物生物合成，能有效提高聚酮化合物的產(chǎn)量。

脂肪酸主要儲(chǔ)存在中性脂質(zhì)化合物TAGs中，TAGs具有極強(qiáng)的疏水性，是極好的儲(chǔ)備材料，可以大量積累而不影響細(xì)胞的滲透壓。TAGs的生物合成途徑已被廣泛研究，但其分解涉及到的遺傳因子研究較少［48］。脂肪酸β-氧化途徑在所有生物體中高度保守，鏈霉菌中存在許多潛在的β-氧化相關(guān)基因的同源物，其在β-氧化過程中的作用不明確，這是企圖通過脂肪酸β-氧化工程提高聚酮化合物產(chǎn)量所面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)的運(yùn)用，有望解決這一難題。之前通過β-氧化途徑提高聚酮化合物產(chǎn)量的策略主要集中在直接參與β-氧化途徑的相關(guān)酶水平上，例如，催化脂肪酸活化生成脂酰輔酶A的脂酰輔酶A合成酶、催化脂?；o酶A脫氫的脂?；o酶A脫氫酶以及烯酰輔酶A水合酶。脂肪酶（lipase）能促進(jìn)TAGs高效、穩(wěn)定水解。然而，通過對(duì)脂肪酶進(jìn)行遺傳操作來增強(qiáng)TAGs水解，使更多的脂肪酸進(jìn)入β-氧化途徑，從而為聚酮化合物生物合成提供更多的前體物質(zhì)的研究尚未見報(bào)道。因此，脂肪酶將會(huì)是今后促進(jìn)聚酮化合物生物合成的代謝工程的重要研究對(duì)象。

在放線菌進(jìn)化中，大多數(shù)代謝途徑已經(jīng)被平衡了，以至于沒有一種酶能完整控制通過該途徑的通量。聚酮化合物生物合成通常受級(jí)聯(lián)調(diào)控，比如受多效調(diào)控因子或全局調(diào)控因子的影響［49-50］。因此，單基因遺傳修飾雖有可能提高聚酮化合物的產(chǎn)量，但細(xì)胞代謝的復(fù)雜性會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)酶水平的失衡，導(dǎo)致中間產(chǎn)物的過量積累，有可能對(duì)細(xì)胞造成毒害作用，從而限制菌體生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)物的合成［51］。多途徑組合工程策略將是改善聚酮化合物生產(chǎn)的主要途徑。利用定量蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)水平和代謝物濃度是有必要的。有了上述研究基礎(chǔ)，可以利用合適的啟動(dòng)子控制基因的表達(dá)水平，在提高聚酮化合物的產(chǎn)量的同時(shí)減少代謝紊亂。在今后的研究中，我們將利用脂肪酸代謝與聚酮化合物合成的關(guān)系，通過合成生物學(xué)手段，結(jié)合調(diào)控β-氧化途徑的全局調(diào)控因子的修飾表達(dá)，來協(xié)調(diào)二者的代謝通量，同時(shí)，可以結(jié)合CRISPRi技術(shù)通過抑制TCA、脂肪酸合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，減少乙酰輔酶A流向TCA、脂肪酸合成，使更多的前體物質(zhì)流向聚酮化合物的生物合成，促進(jìn)目標(biāo)聚酮化合物生物合成，以滿足生產(chǎn)聚酮化合物工業(yè)化的需求。利用啟動(dòng)子工程結(jié)合代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)研究方法，篩選在初級(jí)代謝過程中活性較弱而在次級(jí)代謝過程中活性較強(qiáng)的內(nèi)源性生理時(shí)序啟動(dòng)子，合理調(diào)控脂肪和聚酮化合物代謝通量，強(qiáng)化代謝流方向，有利于目標(biāo)產(chǎn)物聚酮化合物的生物合成。

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收稿日期：2022-09-30；修回日期：2022-10-24。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31770106）。

作者簡(jiǎn)介：曹麗，博士研究生。

* 通信作者：夏立秋，教授，主要從事微生物次生代謝產(chǎn)物合成生物學(xué)的研究。E-mail： xialq@hunnu.edu.cn。