楊曙 伍偉景 賴若沙 汪芹 張康佳 張勇 肖自安 謝鼎華

收稿日期：2023-09-03；修回日期：2023-09-15。

基金項目：湖南省衛(wèi)生健康委科研計劃項目（20200666）；長沙市自然科學基金項目（kq2208326）；湖南省自然科學基金面上項目（2023JJ30753）。

作者簡介：楊曙，博士研究生。

* 通信作者：謝鼎華，教授，主要從事耳病研究及聾病防治，E-mail： dhuaxie@163.com；

肖自安，教授，主要從事耳鼻咽喉疾病研究，E-mail： xiaozian@csu.edu.cn。

摘 要：adgrf3a基因編碼的ADGRF3A蛋白是黏附類G蛋白偶聯(lián)受體（aGPCRs）家族的一員，主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑馬魚的頭部和性腺中表達。它含有一個GPS蛋白水解位點和7個跨膜結(jié)構(gòu)域，與G蛋白相互作用行使其功能。斑馬魚是研究早期發(fā)育和成體內(nèi)生理和病理的重要模式生物。為了研究adgrf3a在斑馬魚早期發(fā)育中的作用，我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了adgrf3a基因敲除斑馬魚品系。首先，通過分析軟件篩選出該基因的敲除位點，利用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增該基因的向?qū)NA（sgDNA），再以sgDNA為模板進行體外轉(zhuǎn)錄得到向?qū)NA（sgRNA）并純化回收，將純化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑馬魚1細胞期胚胎中，得到F0代嵌合體。隨后，對斑馬魚胚胎進行基因編輯的有效性檢測，結(jié)果表明，注射的胚胎出現(xiàn)了堿基缺失的現(xiàn)象，即sgRNA有效，將剩余胚胎培養(yǎng)至成魚。將嵌合體與野生型斑馬魚雜交所得的F1代斑馬魚進行基因型鑒定，篩選adgrf3a突變雜合子，并對其adgrf3a突變位點進行Sanger測序，建立能夠穩(wěn)定遺傳的adgrf3a基因雜合突變品系。之后，adgrf3a突變雜合子斑馬魚自交，獲得adgrf3a純合子突變斑馬魚。體視顯微鏡觀察其成像發(fā)現(xiàn)，adgrf3a突變純合子斑馬魚與野生型整體上未出現(xiàn)明顯差異，然而，體內(nèi)組織與器官的發(fā)育是否發(fā)生變化需要進一步驗證。該基因敲除品系的建立為研究adgrf3a在早期發(fā)育及病理過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；adgrf3a；CRISPR-Cas9；基因敲除; 基因雜合突變品系

中圖分類號：Q341；Q812? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.005

Construction of Zebrafish adgrf3a Gene Knockout Line

YANG Shu， WU Weijing， LAI Ruosha， WANG Qin， ZHANG Kangjia，

ZHANG Yong， XIAO Zian*， XIE Dinghua*

（Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery， the Second Xiangya Hospital of Central South University， Changsha 410011， China）

Abstract： The ADGRF3A protein， encoded by the adgrf3a gene， is a member of the family of adhesion G protein-coupled receptors （aGPCRs） and is mainly expressed in embryos at 5 days after fertilization and in the head and gonads of adult zebrafish. It contains a GPS proteolytic site and seven transmembrane structural domains that interact with G proteins to perform its function. Zebrafish is a model organism for studying physiology and pathology during early development and adulthood. In order to study the role of adgrf3a in early zebrafish development， an adgrf3a knockout zebrafish line was constructed using CRISPR-Cas9 technology. Firstly， the knockout site of the gene was screened out by using analyzing software， and the guide DNA （sgDNA） was amplified by using polymerase chain reaction， next the guide RNA （sgRNA） was obtained by in vitro transcription and then the sgRNA and the Cas9 protein were co-injected into the zebrafish 1-cell-stage embryos. Then， the effectiveness of gene editing was tested， and the results showed that the injected embryos had base deletions， indicating that the gene knockout was successful. The F1 generation of zebrafish resulting from crosses between chimeras and wild-type zebrafish were genotyped， screened for adgrf3a mutant heterozygotes， and their adgrf3a mutant alleles were subjected to Sanger sequencing to determine the establishment of adgrf3a knockout lines. Subsequently， the adgrf3a mutant heterozygous zebrafish were self-crossed to obtain adgrf3a mutant homozygous zebrafish. As observed and imaged by stereomicroscopy， the adgrf3a mutant zebrafish did not show a phenotype significantly different from that of the wild type. However， whether the development of tissues and organs in vivo is altered needs to be further verified. The establishment of this knockout line lays the foundation for exploring the role of adgrf3a in early development and pathology.

Key words： zebrafish; adgrf3a; CRISPR-Cas9; gene knockout; gene heterozygous mutant strain

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（5）： 423-430）

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）是在后生動物蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)的最大的一類細胞膜受體［1］。在人類中，已經(jīng)確定了800多個編碼不同GPCR的基因［2］。GPCR包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域（seven-transmembrane，7TM），該受體與配體結(jié)合后，與胞內(nèi)不同的G蛋白結(jié)合，介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細胞增殖、生長和遷移等生理活動中發(fā)揮重要作用。GPCRs對健康和疾病具有廣泛影響，人們對其進行了大量的研究，并將其作為許多已批準藥物的靶點［3］。因此，對每個GPCR亞類的研究都將為治療學的發(fā)展提供獨特的角度，有利于治療藥物的開發(fā)。通常情況下，GPCR信號是通過激動劑與其正構(gòu)體結(jié)合而啟動的，這將導(dǎo)致跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的重新排列，從而實現(xiàn)有效的異源三聚體G蛋白偶聯(lián)和激活。GPCRs主要有以下6類：A類（如類視紫紅質(zhì)）、B類（如促胰液素）、C類（如代謝型谷氨酸鹽）、D類（如信息素）、E類（如cAMP）和F類（如Frizzled蛋白）［2，4-5］。黏附類G蛋白偶聯(lián)受體（adhesion G protein-coupled receptors，aGPCRs）屬于B家族成員中的B2亞族［2，6］，在人類中有33個成員［7］。

作為GPCRs超家族中進化古老的家族之一，aGPCRs又可以分為9個小亞群，因為幾乎沒有觀察到配體介導(dǎo)的信號事件，所以其中大部分成員都被認為是孤兒受體［6，8］。與其他GPCRs家族相比，整個aGPCRs家族的研究相對較少，雖然目前大多數(shù)成員功能不明，但aGPCRs已被證明在各種生理和病理條件下發(fā)揮作用（如腦發(fā)育、水鹽平衡、炎癥、神經(jīng)發(fā)育、血管生成和細胞命運決定等），是重要的分子開關(guān)［9-15］。此外，目前的研究表明，aGPCRs的突變與特定的人類疾病有關(guān)，包括軟骨形成、Usher綜合征和男性不育癥等［9，11-12］。相比于其他的GPCRs蛋白，aGPCRs的不同之處不僅在于其巨大的胞外區(qū)域（extracellular regions，ECRs）包含多種黏附性亞結(jié)構(gòu)域，而且還在于高度保守的GPCR自蛋白水解誘導(dǎo)（autoproteolysis-inducing，GAIN）結(jié)構(gòu)域，其中包含高度保守的GPCR蛋白水解位點（GPCR proteolytic site，GPS），該結(jié)構(gòu)域可將受體結(jié)構(gòu)性地自切割成兩個片段［16］。

近年來，斑馬魚（Danio rerio）已成為研究發(fā)育過程以及成年動物體內(nèi)各種生理過程和疾病狀態(tài)的首選模式生物［17-18］。此外，斑馬魚已被證明是研究aGPCRs（尤其是發(fā)育過程中的aGPCRs）的理想模型。Harty等［19］通過使用高通量qPCR和常規(guī)qPCR試驗，發(fā)現(xiàn)adgrf3a在斑馬魚受精后5 d（5 days post fertilization，5 dpf）有表達， 且在成魚的肝臟、大腦和睪丸中表達豐富。目前，aGPCRs調(diào)控機體的發(fā)育、腫瘤發(fā)生等受到人們的廣泛關(guān)注，為了探究adgrf3a在發(fā)育中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚adgrf3a基因敲除品系，為研究adgrf3a在發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

TU斑馬魚（Danio rerio）品系由湖南師范大學動物營養(yǎng)與人體健康實驗室養(yǎng)殖。養(yǎng)殖水（5.00 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.33 mmol/L MgSO4，0.10% 甲基藍）的水溫為28.0℃，pH值為6.5～7.5，14 h光照和10 h黑暗交替循環(huán)。斑馬魚幼魚從第5 天開始喂食草履蟲（Paramecium）至15 d左右，然后再轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖系統(tǒng)架上喂食豐年蟲（Chirocephalus）。

1.1.2 試驗試劑

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Cas9蛋白（A36498，Invitrogen公司）；PCR高保真酶（AG12201，艾科瑞生物工程有限公司）；DNA Marker（TSJ012，擎科生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（TSJ001，擎科生物技術(shù)有限公司）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒（B518131，上海生工生物工程股份有限公司）；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Am1314，invitrogen公司）；RNA純化試劑盒（74104，Qiagen公司）；Sanger測序委托北京擎科生物科技有限公司進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 向?qū)NA（sgRNA）靶位點設(shè)計

首先，在Ensembl網(wǎng)站（http：//www.ensembl.org/index.html）上查找到斑馬魚adgrf3a基因的完整基因組序列（ENSDARG00 000 087 870）、轉(zhuǎn)錄本以及內(nèi)含子和外顯子等信息；接著在E-CRISP網(wǎng)站（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP）上找出所有緊鄰5'-NGG-3'（protospacer adjacent motif，PAM）的候選靶序列，并評估候選靶序列的脫靶情況，靶序列長度一般為18～20 bp。在靶序列前加上保護堿基（gcg）和T7啟動子（TAATACGACTCACTATA），靶序列后加上sgRNA骨架序列上游序列（GTTTTAGAGGCTAGAAATAGG），由此構(gòu)成sgRNA的正向引物序列。sgRNA的反向引物為固定序列：AAGCACCGACTCGGTGCCACT。根據(jù)設(shè)計的adgrf3a基因的靶位點，通過Primer3.0（https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）在線工具設(shè)計基因組正反檢測引物adgrf3a-F和adgrf3a-R（表1）。

1.2.2 合成sgRNA

用Template DNA作為模板［20］，sgRNA1-F/sgRNA-R或sgRNA2-F/sgRNA-R作為PCR引物，退火溫度設(shè)置為60℃，用高保真酶進行PCR擴增，獲得adgrf3a基因靶位點序列1及序列2 sgRNA的擴增產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳并純化回收，將純化得到的DNA用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行轉(zhuǎn)錄，合成sgRNA，再用RNA純化試劑盒進行純化回收，測定質(zhì)量濃度后-80℃保存。

1.2.3 顯微注射以及靶位點有效性檢測

收集斑馬魚15 min內(nèi)產(chǎn)的受精卵，待其發(fā)育至1細胞期時排列在注射板上。將adgrf3a基因靶位點的sgRNA1、sgRNA2和Cas9蛋白按合適比例混勻（終質(zhì)量濃度分別為20、20、500 ng/μL），將混合溶液（約1 nL）共注射到斑馬魚受精卵中，放置到28.5℃的恒溫箱中進行培養(yǎng)。每日對胚胎進行觀察并更換新鮮的培養(yǎng)水，待受精后36 h（36 hours post fertilization， 36 hpf），隨機收集野生型和部分注射后胚胎進行基因敲除有效性鑒定，剩余的胚胎則繼續(xù)培養(yǎng)至成魚。

1.2.4 可穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

注射后的胚胎培養(yǎng)至1.5個月左右時，對幼魚進行編號并逐條剪尾，提取其尾鰭基因組DNA進行基因型鑒定。由于設(shè)計的兩個靶位點之間相距108 bp，若兩個靶位點都有效，就會造成較大片段的缺失。對基因組進行PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，如果PCR產(chǎn)物同時出現(xiàn)500 bp左右的野生型目的條帶以及比野生型目的條帶小100 bp左右的條帶，那么這些幼魚為攜帶突變的F0代魚。將幼魚繼續(xù)飼養(yǎng)至性成熟，分別與野生型進行雜交，提取受精卵DNA并進行基因型檢測，篩選出可穩(wěn)定遺傳突變的F0代魚，這些可穩(wěn)定遺傳的魚即為F1代突變體。將F1代突變體中比野生型目的條帶小的條帶進行切膠回收，并送公司測序，根據(jù)堿基測序結(jié)果分析突變位點和缺失的堿基數(shù)目。

1.2.5 體視顯微鏡成像

將斑馬魚幼魚收集到離心管中，加入三氯卡因麻醉劑使其麻醉后，使用1%低熔點瓊脂糖固定幼魚，使其頭朝左腹部朝下。使用體視顯微鏡（Leica公司，德國）觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADGRF3A蛋白結(jié)構(gòu)域分析

在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上查找斑馬魚adgrf3a基因編碼的氨基酸序列，在SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de）分析該序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖1所示，ADGRF3A蛋白有一個GPS結(jié)構(gòu)域及7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。

2.2 設(shè)計adgrf3a基因的靶位點

在adgrf3a基因編碼的GPS蛋白結(jié)構(gòu)域的序列區(qū)域上，選擇一對合適的基因敲除位點（圖2）。在靶序列前加上保護堿基和啟動子序列，靶序列后加上sgRNA骨架上游序列，送至上海生工生物工程股份有限公司進行序列合成，并將此分別作為正向引物sgRNA1-F和sgRNA2-F。反向引物sgRNA-R為sgRNA骨架的下游序列。

2.3 adgrf3a基因敲除sgRNA的合成

以Template DNA為模板，sgRNA1-F/sgRNA-R或sgRNA2-F/sgRNA-R為正向引物和反向引物進行PCR擴增。將100 bp左右的特異性條帶切下，并按照柱式DNA膠回收試劑盒說明書的要求進行DNA純化回收。以回收的DNA作為模板，使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得sgRNA1和sgRNA2。純化后進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在100 bp左右分別有一條單一且明亮的條帶，表明sgRNA成功合成（圖3）。

2.4 F0代突變等位基因嵌合體成年斑馬魚的篩選

為了驗證斑馬魚胚胎的顯微注射靶位點是否有效，選擇注射后發(fā)育至30 dpf的斑馬魚尾鰭提取基因組DNA，并將其作為模板，通過PCR擴增進行注射有效性的鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，第6條泳道除了有野生型條帶外，還出現(xiàn)了一條較為明顯的小帶，說明雙靶位點的顯微注射是有效的（圖4）。將這條F0代斑馬魚繼續(xù)養(yǎng)至性成熟。

2.5 穩(wěn)定遺傳突變體的篩選及Sanger測序

為了驗證F0代中的adgrf3a基因突變是否可以遺傳至后代，將篩選到的F0代突變體與野生型斑馬魚雜交，得到F1代。收集F1代斑馬魚胚胎，進行DNA鑒定，結(jié)果顯示，F(xiàn)0代突變體后代產(chǎn)生了adgrf3a突變等位基因的雜合子斑馬魚，證明了該F0代魚可穩(wěn)定遺傳（圖5）。隨后將較小的條帶進行切膠回收并送公司進行Sanger測序。將測序結(jié)果與野生型斑馬魚的adgrf3a基因進行比對，結(jié)果表明，該突變斑馬魚的adgrf3a基因共缺失101 bp，導(dǎo)致其開放閱讀框改變，并提前終止翻譯（圖6）。通過SMART網(wǎng)站對突變斑馬魚的氨基酸序列進行分析，結(jié)果表明，該突變斑馬魚雖然可以正常編碼GPS區(qū)域，但無法正常編碼與G蛋白結(jié)合從而傳遞信號的7TM區(qū)。將剩余的F1代胚胎養(yǎng)至2個月左右，再逐條剪尾進行基因型鑒定，獲得可穩(wěn)定遺傳的F1代魚，說明adgrf3a基因敲除斑馬魚品系構(gòu)建成功。

2.6 adgrf3a基因突變體純合子的篩選

為了構(gòu)建完整的斑馬魚敲除突變體品系，將上述篩選出的adgrf3a突變雜合子的雌雄魚進行自交，提取其后代的基因組DNA進行PCR以鑒定其基因型。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，此22條adgrf3a突變雜合子自交所產(chǎn)的F2代斑馬魚中含5條adgrf3a突變純合子魚（第14、17、18、19、22號魚）。這證明了adgrf3a基因突變斑馬魚可正常存活至成魚（圖7）。

2.7 adgrf3a基因突變純合子斑馬魚與野生型相比無明顯表型

adgrf3a在斑馬魚早期發(fā)育過程中均有顯著表達，為了觀察adgrf3a基因?qū)ε咛ピ缙诎l(fā)育的影響，我們選取發(fā)育至第5天的斑馬魚幼魚，使用體式熒光顯微鏡拍攝其側(cè)面并進行了觀察。結(jié)果表明，adgrf3a的缺失并沒有使斑馬魚出現(xiàn)明顯的外觀形態(tài)差異（圖8）。之后對同時期的野生型和突變體斑馬魚進行持續(xù)觀察直至180 dpf，相較于野生型斑馬魚，突變體斑馬魚均沒有出現(xiàn)比較明顯的異常表型。

3 討論

根據(jù)序列相似性［8，21］，33個人類aGPCRs被分為9個亞家族，即ADGRA～G、ADGRL和ADGRV。adgrf3a屬于ADGRF家族中的一員，與其他aGPCRs一樣，ADGRF3A具有GPS結(jié)構(gòu)域和7TM結(jié)構(gòu)域，已知后者在許多情況下可通過異三聚體G蛋白傳遞信號。本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在adgrf3a基因功能結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)上進行了基因敲除，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，進而無法正常編碼7TM區(qū)，使ADGRF3A蛋白該結(jié)構(gòu)域缺失。我們的試驗結(jié)果顯示，敲除斑馬魚的adgrf3a基因后，突變體斑馬魚未表現(xiàn)出與野生型明顯不同的表型，且沒有發(fā)現(xiàn)突變體有明顯的缺陷，這說明，基因敲除后不影響胚胎整體發(fā)育，但是該基因是否會導(dǎo)致體內(nèi)組織或者器官的異常有待進一步研究。

遺傳補償效應(yīng)是近年來在斑馬魚中最先描述的一個遺傳現(xiàn)象，指當敲低某一個基因時有明顯的表型，但此基因的敲除遺傳突變體由于其他基因的上調(diào)而沒有表型［22］。在生物體中存在許多補償機制，比如重復(fù)基因的存在、代謝途徑和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的代償?shù)龋?3］。adgrf3a基因是人類adgrf3的同源基因，事實上，adgrf3在斑馬魚基因組中存在兩個旁系同源基因，即adgrf3a和adgrf3b。目前有研究表明，adgrf3b在斑馬魚母體和早期原腸胚中高度表達，此外，adgrf3b在成魚的腎臟、大腦和性腺中也有表達［19］。由于旁系同源物之間的功能可能存在冗余［24-25］，我們推測是adgrf3b基因的表達補償了adgrf3a基因的缺失所帶來的影響，使斑馬魚生理狀態(tài)保持相對正常。

未來我們擬敲除它的旁系同源基因adgrf3b，并構(gòu)建adgrf3a、adgrf3b雙基因敲除的斑馬魚品系，以消除它們可能存在的代償機制，在此基礎(chǔ)上進一步研究該基因的功能，更好地揭示adgrf3基因在遺傳和發(fā)育中的作用。

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