劉牧青，馬巖，謝潔，韓寧，代玲敏*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東濟南 250353；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺 264003）

植物的染色體加倍是通過增加優(yōu)勢等位基因數(shù)量和降低有害隱性等位基因的影響，進而提高植物活性并增強植物的適應(yīng)性[1-3]。植物多倍體常表現(xiàn)出器官（如花、果實、種子、葉、莖和根等）的巨大性[4]。通過種植多倍體植物，能夠減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的投入（化肥、植物生長調(diào)節(jié)劑等），增加產(chǎn)量和經(jīng)濟收入，因此多倍體育種是經(jīng)濟作物重要的育種方式之一[5]。此外，植物多倍體可以自然形成，主要是通過不同倍性親本間雜交或形成配子時染色體數(shù)目未減少來實現(xiàn)[4,6]。但是植物自然多倍體發(fā)生概率小，生長進程緩慢，僅有15%的被子植物以多倍體形式存在[7]。相比之下，使用秋水仙素（Colchicine）、安磺靈（Oryzalin）、甲基胺草磷（Amiprophosmethyl）、氟樂靈（Triflralin）、拿草特（Pronamide）等抗有絲分裂藥劑能夠加速植物多倍體的形成進程，因此被廣泛應(yīng)用于人工誘導(dǎo)多倍體的研究[8]。

秋水仙素是從百合科秋水仙中提取的一種天然生物堿[9]，能夠與細(xì)胞中微管蛋白結(jié)合，通過阻礙細(xì)胞有絲分裂過程中維管形成的方式阻止細(xì)胞染色體在分裂后期向細(xì)胞兩極移動[10]，細(xì)胞周期結(jié)束時胞質(zhì)分裂的失敗將導(dǎo)致兩組染色體留在一個細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞停留在分裂中期，形成多倍體[5,11-12]。早在1938年，秋水仙素即應(yīng)用于植物染色體加倍研究[13]。目前，秋水仙素應(yīng)用于多種作物的多倍體培育中，包括葡萄、蘋果、柑橘、枇杷等[14-17]，已成功育得約46種多倍體植物[18]。

多倍體葡萄具有果粒大、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、種植廣泛等特點[19]，因此多倍體育種是重要的育種手段。器官再生和體細(xì)胞胚再生是葡萄兩種再生途徑[20]。為研究秋水仙素處理對不同葡萄外植體成活率的影響，采用器官再生途徑的不定芽、體細(xì)胞胚再生途徑的胚性愈傷和體細(xì)胞胚為外植體，進行秋水仙素誘導(dǎo)。

秋水仙素誘導(dǎo)葡萄產(chǎn)生多倍體時，受秋水仙素濃度、處理時間、葡萄品種及外植體類型的影響[5,14]。本研究采用不同秋水仙素濃度，對不同葡萄品種的莖尖等外植體進行誘導(dǎo)，以研究不同品種適宜的多倍體誘導(dǎo)方法。同時采用流式細(xì)胞儀和染色體技術(shù)方法，對誘導(dǎo)獲得的再生苗進行染色體數(shù)目鑒定，并比較不同倍性葡萄植株的形態(tài)特征和氣孔等的差異。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)條件

本實驗室前期使用‘5BB’‘紅寶石無核’‘金星無核’‘陽光玫瑰’‘白奧林’和‘藤稔’葡萄的花器官誘導(dǎo)胚性愈傷組織，但葡萄體細(xì)胞胚途徑的誘導(dǎo)受基因型影響大，僅‘5BB’砧木品種成功誘導(dǎo)出胚性愈傷[21]。因此本研究中采用前期實驗室誘導(dǎo)保存的‘5BB’不定芽、胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚為外植體，經(jīng)不同濃度秋水仙素分別處理1、2、3 d后再培養(yǎng)6個月，以確定適宜秋水仙素處理的外植體類型。

在前期通過對‘紅寶石無核’‘金星無核’‘陽光玫瑰’‘藤稔’和‘白奧林’5個葡萄品種的單芽莖段進行初代組織培養(yǎng)，以獲得的不定芽為材料，探究秋水仙素處理對不同品種不定芽再生的影響。葡萄組培苗于溫度25±1 ℃、16/8 h光周期和光照強度2000 Lx無菌條件下培養(yǎng)。

不定芽培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-16-BA+0.15 mg·L-1IBA+20 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂。胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚培養(yǎng)基為MS+60 g·L-1蔗糖+1 g·L-1活性炭+3 g·L-1植物凝膠。培養(yǎng)基用2 mol·L-1NaOH溶液調(diào)整pH為6.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2 秋水仙素處理

配制秋水仙素濃度分別為100、250 、500 mg·L-1的固體培養(yǎng)基，外植體分別在不同濃度秋水仙素培養(yǎng)基上各培養(yǎng)1、2、3 d。其中，100 mg·L-1秋水仙素處理1、2、3 d，簡寫為1-1、1-2和1-3；250 mg·L-1秋水仙素處理1、2、3 d，簡寫為2-1、2-2和2-3；500 mg·L-1秋水仙素處理1、2、3 d，簡寫為3-1、3-2和3-3。秋水仙素處理后，外植體用無菌水沖洗3次，轉(zhuǎn)至不含秋水仙素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。外植體每4周繼代一次，直至長成完整新植株，統(tǒng)計外植體存活率。

1.3 葡萄倍性分析

由于本試驗中獲得的‘5BB’等品種的再生苗長勢較弱，因此選取長勢較好的100 mg·L-1秋水仙素處理1 d后的19個‘紅寶石無核’不定芽染色體加倍的無菌苗進行染色體數(shù)目鑒定。取其生長點下方第2、3片幼葉，使用流式細(xì)胞儀（Partec，德國）檢測，檢測方法參照Xie等[14]，未處理的‘紅寶石無核’葉片為對照。選取再生植株莖尖，用1%纖維素酶和10%果膠酶酶解、Carnoy I溶液固定并分散、壓片，使用改良苯酚品紅溶液染色15 min后于顯微鏡下觀察得到具體染色體數(shù)目。

1.4 ‘紅寶石無核’再生植株形態(tài)特征和葉綠素含量分析

選取4周苗齡的無菌苗，觀察并檢測植株和根系的生長情況，并分別選取其生長點下方第4片葉，檢測葉片大小和葉綠素相對含量（參照SPAD-502P，日本，使用說明書）；檢測生長點下方第3～4節(jié)的節(jié)間長度和粗度。

1.5 ‘紅寶石無核’再生植株氣孔分析

選取苗齡4周的無菌苗生長點下方第4片葉，撕取下表皮，顯微鏡下觀察下表皮氣孔的大小和數(shù)量。以上試驗均重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析方差，選用Oneway ANOVA進行單因素方差分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理后的成苗率及成苗時間

秋水仙素處理后‘5BB’不定芽、胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚再生成苗情況見圖1。從3種外植體的成活率統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不定芽存活率受抑制程度最大，其次為體細(xì)胞胚；胚性愈傷組織存活率受抑制程度最??；秋水仙素濃度越高、處理時間越長，外植體存活率越低（圖2A）。秋水仙素處理后，外植體再生成苗過程受抑制，成苗用時較對照顯著升高。不定芽作為外植體，秋水仙素處理后成苗時間用時最短，為5周，而胚性愈傷和體細(xì)胞胚的成苗用時分別為22周和20周（圖2B）。不定芽易誘導(dǎo)獲得，并且將其作為外植體進行秋水仙素誘導(dǎo)處理后成苗迅速，操作簡便，因而不定芽可以作為外植體用于葡萄染色體加倍研究。

圖2 不同秋水仙素處理時‘5BB’葡萄外植體存活率和成苗時間Figure 2 Survival rate and period of plantlets of '5BB' explants regenerated after treated with colchicine

2.2 不同葡萄品種不定芽秋水仙素染色體加倍成活率

不同基因型葡萄的不定芽在秋水仙素影響下，存活率呈下降趨勢，且各品種間具體表現(xiàn)略有差異（圖3）。秋水仙素處理1～2月后，‘紅寶石無核’‘陽光玫瑰’和‘藤稔’存活率下降幅度小，而‘金星無核’和‘白奧林’存活率下降幅度大；處理6個月后，秋水仙素濃度越高、處理時間越長，5個品種的存活率均達到最低水平。不同葡萄品種中，‘白奧林’不定芽存活率差異較小，而其余品種的差異較大。秋水仙素濃度為100 mg·L-1、處理時間為1 d時‘紅寶石無核’‘陽光玫瑰’‘白奧林’和‘藤稔’葡萄存活率最高，而在250 mg·L-1秋水仙素處理1d時，‘金星無核’存活率最高。

圖3 不同鮮食葡萄不定芽秋水仙素處理后存活率Figure 3 Survival rate of adventitious buds from diあerent table grape varieties treated with colchicine

2.3 秋水仙素處理后葡萄染色體數(shù)目鑒定

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，‘紅寶石無核’二倍體葡萄的標(biāo)準(zhǔn)峰出現(xiàn)在100。與對照比較，秋水仙素處理后，染色體加倍檢測表明，送檢的19個株系中有2個株系最高峰右移，證明秋水仙素處理后，再生的葡萄出現(xiàn)染色體數(shù)目增加。后續(xù)操作中進一步確認(rèn)再生葡萄染色體的具體數(shù)目后發(fā)現(xiàn)，再生葡萄中包括具有48條染色體的植株1株、具有58條染色體的植株1株，具有112條染色體的植株1株，其余16個株系為二倍體，染色體加倍率為15%。

2.4 秋水仙素處理后葡萄形態(tài)特征和葉綠素含量分析

為研究染色體數(shù)目加倍對‘紅寶石無核’形態(tài)或生理的影響，對染色體數(shù)目分別為38（二倍體）、48、58、112的株系進行形態(tài)特征和葉片葉綠素相對含量分析。結(jié)果表明，隨著染色體數(shù)目的增加，植株生長速度更快，根系更發(fā)達。同時，染色體數(shù)目增加后，植株葉片大小和葉綠素含量、節(jié)間長度、根系質(zhì)量略高于二倍體對照植株；其中，染色體數(shù)目為112的葡萄植株葉片大小和葉綠素相對含量、節(jié)間長度、根系質(zhì)量顯著高于對照。但其莖粗與對照差異不顯著（表1）。

表1 ‘紅寶石無核’秋水仙素處理后再生苗形態(tài)特征和葉綠素含量分析Table 1 Morphological characteristics and chlorophyll content analysis of regenerated seedling of 'Ruby Seedless' with colchicine treatment

2.5 秋水仙素處理后葡萄葉片氣孔觀察

為進一步驗證染色體數(shù)目增加后對葡萄性狀的影響，對‘紅寶石無核’葡萄葉片下表皮氣孔進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與二倍體對照相比，染色體數(shù)目增加后，‘紅寶石無核’葡萄葉片下表皮氣孔密度降低，但氣孔體積較大（圖4）。

圖4 ‘紅寶石無核’秋水仙素處理后再生苗葉片氣孔特征Figure 4 Stomatal characteristics of regenerated seedling leaf of'Ruby Seedless' treated with colchicine

3 討論與結(jié)論

秋水仙素能夠抑制生長旺盛、細(xì)胞分裂活躍的植物幼嫩部位的細(xì)胞有絲分裂，實現(xiàn)植物染色體加倍[22]。秋水仙素的濃度、處理時間、外植體類型等均影響多倍體的誘導(dǎo)效果[5]。由于與植物微管蛋白親和力較差，秋水仙素處理濃度在0.05%～1%[5,14]。有研究表明，秋水仙素對植物有毒害作用，隨著秋水仙素濃度增高和處理時間延長，植物外植體存活率降低[23-24]，本試驗的研究結(jié)果與其一致。

植物不同部位用秋水仙素處理后的效果不同[14]。不定芽、胚性愈傷組織和合子胚等常作為外植體，用于葡萄多倍體誘導(dǎo)[25-26]。合子胚是葡萄有性繁殖后代，性狀與親本間存在差異，生產(chǎn)上應(yīng)用較少。本試驗采用‘5BB’葡萄的花器官誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚作為外植體，研究其與不定芽、胚性愈傷組織等受秋水仙素的影響。結(jié)果表明，秋水仙素處理后，胚性愈傷存活率較高，不定芽和體細(xì)胞胚存活率抑制效果更顯著，試驗結(jié)果與Xie等[14]較一致，可能與胚性愈傷組織活性較高有關(guān)。此外，秋水仙素處理后明顯減緩了葡萄植株再生速度，胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚再生成苗速度遠遠小于不定芽。另外，不定芽的誘導(dǎo)不受季節(jié)限制，易獲得，且操作簡便，因此不定芽成為葡萄多倍體誘導(dǎo)的較適宜的外植體。不同葡萄品種的不定芽用秋水仙素處理后的表現(xiàn)也不同。植物用秋水仙素處理后，致死率在25%～50%以上，植物染色體變異率高[27]。本研究中，秋水仙素處理后，不同葡萄品種再生率在5%～70%，證明試驗中秋水仙素處理濃度和處理時間較適宜，可產(chǎn)生較高的突變率。

流式細(xì)胞儀是一種鑒定植物染色體倍性的常用方式，該方法具有速度快、操作簡便的特點，但是不能準(zhǔn)確得到染色體的具體數(shù)目。相比之下，染色體計數(shù)雖耗時費力，但結(jié)果較準(zhǔn)確[28]。本研究采用流式細(xì)胞儀和染色體計數(shù)方法檢測‘紅寶石無核’不定芽再生植株染色體倍性，染色體加倍的再生苗中出現(xiàn)倍性嵌合植株和6倍體植株，表明染色體部分加倍或過度加倍，誘導(dǎo)過程中出現(xiàn)混合倍體的現(xiàn)象[26]，此結(jié)果與前人研究一致。不定芽再生植株過程屬于器官發(fā)生途徑，再生植株是由多層細(xì)胞分化而來，故在秋水仙素處理時不定芽容易產(chǎn)生混合倍體，從而影響再生植株的均勻多倍體化[28-29]。染色體加倍后，植物形態(tài)特征和氣孔特征會發(fā)生變化，因多倍體葡萄較二倍體葡萄表現(xiàn)出葉片大、節(jié)間長、氣孔更大、氣孔密度較小的特點[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，過度加倍的葡萄植株葉片大小、葉綠素相對含量、節(jié)間長度顯著高于二倍體植株。

本研究利用不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)葡萄外植體，確定了本研究中最適合的葡萄屬植物多倍體育種的外植體類型為不定芽、秋水仙素最佳誘導(dǎo)濃度為100 mg·L-1、處理時長宜為1 d。探究了秋水仙素對不同鮮食品種存活率的影響，在秋水仙素處理1—2月后，‘金星無核’和‘白奧林’存活率下降幅度大；而在秋水仙素不同濃度及處理時間的條件下，‘白奧林’不定芽存活率差異較小，而其余品種不定芽差異較大；并發(fā)現(xiàn)‘紅寶石無核’染色體加倍后，過度加倍致使葡萄植株形態(tài)特征、氣孔特征發(fā)生明顯變化。