王立娟,楊義琳,高慧鑫,張延妍,何艷慧,武占省,,盧華丹

(1. 西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院 西安市紡織化工助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710048;2. 石河子大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,新疆 石河子 832003)

在植物根際土壤發(fā)現(xiàn)的82%的促生菌(PGPRs)都可以利用色氨酸或者其中間物合成植物激素吲哚-3-乙酸(IAA)、細(xì)胞分裂素、赤霉素等調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì),刺激植物側(cè)根和根毛的過量生長(zhǎng),進(jìn)而增加對(duì)礦物營(yíng)養(yǎng)和水分子的吸收,最終促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1-5]。其中,IAA是最常見的天然生長(zhǎng)素,對(duì)植物根系的生長(zhǎng)具有有益作用,常被用作蘸根劑的主要成分[6-7]。有研究表明,施加107CFU/mL的BacillusamyloliquefaciensSQR9可以增加黃瓜根長(zhǎng)137%和根表面積88%,而同樣處理敲除其IAA基因的菌株卻未對(duì)黃瓜的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響,由此推測(cè)菌株SQR9產(chǎn)生的IAA是其發(fā)揮促生作用的主要機(jī)制[8-9]。

在PGPRs中,IAA的合成主要有5種依賴色氨酸的途徑,分別是吲哚乙酰胺(IAM)途徑、吲哚丙酮酸(IPyA)途徑、色胺(TAM)途徑、吲哚乙腈(IAN)途徑和色氨酸側(cè)鏈氧化酶途徑,而且在一種細(xì)菌中可能存在一條或者多條途徑[10-12]。Liu等[13]利用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析菌株B.pyrrociniaJK-SH007的發(fā)酵液,在其中檢測(cè)到了IAA及其中間物吲哚乙酰胺,同時(shí)也檢測(cè)到了微量的吲哚丙酮酸、吲哚乙腈和色胺,表明IAM途徑為菌株JK-SH007合成IAA的主要途徑。Idris等[14]發(fā)現(xiàn),在添加5 mmol/L色氨酸的條件下,BacillusamyloliquefaciensFZB42菌株的IAA的分泌量增加了5倍;此外,其trp營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體E101(ΔtrpBA)和E102(ΔtrpED)以及E103(ΔysnE)和E105(ΔyhcX)的培養(yǎng)濾液中的IAA濃度顯著降低,這3個(gè)突變株在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面的效率也明顯較低,說明FZB42菌株依賴色氨酸的生長(zhǎng)素合成與其促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能是相關(guān)的。曾秀麗等[15]研究發(fā)現(xiàn),與敲除突變株相比,草螺菌ZXN111的tyrB基因回補(bǔ)菌株產(chǎn)IAA的能力顯著恢復(fù),但與野生型菌株相比,其 IAA 合成量仍然較少,可見tyrB基因在草螺菌ZXN111合成IAA途徑中起關(guān)鍵作用,但不是唯一的合成途徑。

筆者所在課題組已經(jīng)從棉花根際分離出的優(yōu)勢(shì)菌株惡臭假單胞菌Rs-198具有產(chǎn)生IAA的能力[16-17],然而其合成途徑并未解析。因此,本研究對(duì)Rs-198菌株的IAA合成途徑進(jìn)行深入探索,以期對(duì)該菌株作為潛在生物肥料的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料方法

1.1 材料

假單胞菌(Pseudomonassp.)Rs-198,由筆者所在課題組前期從植物根際土壤中獲得[18-19](GenBank登錄號(hào):PRJNA780237)。菌株培養(yǎng)條件為1%的種子液接種于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(NA),30 ℃、170 r/min培養(yǎng)36 h。

辣椒:市售普通辣椒種子。

種植基質(zhì):市售的珍珠巖(粒徑2 mm)和蛭石(粒徑0.5 mm),混合比例為2∶3(體積比)。

1.2 方法

1.2.1P.putidaRs-198生長(zhǎng)測(cè)定

在滅菌后分裝有50 mL的NA培養(yǎng)基中分別添加一定量的色氨酸使其終質(zhì)量濃度為0.1、50、100、150和200 mg/L。接種P.putidaRs-198后在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h,在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600。

P.putidaRs-198生長(zhǎng)曲線測(cè)定:在色氨酸終濃度為50 mg/L的NA培養(yǎng)液中接種P.putidaRs-198后,30 ℃、170 r/min培養(yǎng),再分別在接種后的6、12、24、48、72 和96 h吸取3 mL培養(yǎng)液,測(cè)定OD600,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 IAA的定性定量檢測(cè)

IAA的測(cè)定采用Salkowski比色法[20],用紫外分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液在波長(zhǎng)530 nm處的吸光值A(chǔ)530,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中IAA的含量。

1.2.3 HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中的IAA量

發(fā)酵液中IAA的測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]的方法,并加以改進(jìn):測(cè)試液為不同菌株發(fā)酵液,制備待測(cè)液后,吸取1 mL發(fā)酵液離心,于8 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液置于凈離心管中,用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.5,隨后使用等體積的乙酸乙酯萃取3次,之后使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,甲醇復(fù)溶定容至5 mL,隨后轉(zhuǎn)移至離心管中保存在-20 ℃冰箱中備用。上樣前,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,再進(jìn)行HPLC分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的峰面積計(jì)算IAA含量。HPLC分析使用的色譜柱為Agilent Technologies ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫為30 ℃,流動(dòng)相為甲醇-0.6%乙酸溶液(兩者體積比為1∶1),流速為0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.4 IAA合成途徑分析

在NA培養(yǎng)基中分別添加一定質(zhì)量的中間物(吲哚乙腈、吲哚丙酮酸、色胺或吲哚乙酰胺),使其終質(zhì)量濃度為80 mg/L。在接種P.putidaRs-198菌株后的3、6和12 h收集發(fā)酵液,經(jīng)樣品前處理后,利用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中中間物吲哚乙腈、吲哚丙酮酸、色胺或吲哚乙酰胺以及目標(biāo)終產(chǎn)物IAA的濃度變化。

1.2.5 含色氨酸發(fā)酵液辣椒促生能力測(cè)定

通過盆栽實(shí)驗(yàn)測(cè)定含色氨酸發(fā)酵液的促生能力。盆栽實(shí)驗(yàn)設(shè)置有5個(gè)處理組:①單純NA發(fā)酵液(CK);②NA發(fā)酵液離心后的上清液(NA-S);③NA發(fā)酵液離心后的菌體重懸于等體積的無菌水(NA-C);④NA培養(yǎng)基添加色氨酸后的發(fā)酵液離心的上清液(TRY-S);⑤色氨酸添加后發(fā)酵液離心的菌體重懸于等體積的無菌水(TRY-C)中。將以上處理液浸泡滅菌的辣椒種子10 min后,播種。待辣椒苗長(zhǎng)到兩葉一心的時(shí)候,取樣測(cè)量辣椒苗的根長(zhǎng)、株高、莖粗(游標(biāo)卡尺測(cè)量)和鮮質(zhì)量等指標(biāo)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel記錄并處理相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用ANOVA進(jìn)行單因素方差分析,用Origin 9.0(Origin Lab公司)繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 色氨酸加量對(duì)P. putida Rs-198生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

考察外源添加不同量的色氨酸對(duì)P.putidaRs-198生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖1。由圖1可知:與單純的NA培養(yǎng)基培養(yǎng)相比,雖然添加色氨酸并沒有顯著影響P.putidaRs-198細(xì)胞的生長(zhǎng),但是IAA的產(chǎn)量隨色氨酸加量的增加會(huì)顯著增加,當(dāng)色氨酸的質(zhì)量濃度分別為50、100、150和200 mg/L時(shí),IAA的產(chǎn)量分別是不添加色氨酸發(fā)酵液的2.47倍、4.02倍、4.88倍和5.07倍。另外,培養(yǎng)基中色氨酸終質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)的IAA產(chǎn)量是為50 mg/L色氨酸的2倍,然而細(xì)胞數(shù)量卻相對(duì)減少了21%。但是與Myo等[21]添加不同濃度色氨酸對(duì)NKZ-259菌株產(chǎn)IAA的研究結(jié)果不一致,當(dāng)色氨酸為10 g/L時(shí),IAA的產(chǎn)量?jī)H為40.22 mg/L。這可能是因?yàn)檫^高的色氨酸對(duì)細(xì)胞的滲透壓產(chǎn)生了不利影響,影響了菌株細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,綜合考慮P.putidaRs-198菌株的其他促生特性,選擇50 mg/L色氨酸加量進(jìn)一步探究其對(duì)P.putidaRs-198的細(xì)胞生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的關(guān)系。

圖1 色氨酸濃度對(duì)P. putida Rs-198的生長(zhǎng)及IAA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of tryptophan concentrations on P. putida Rs-198 growth and IAA production

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,考察添加50 mg/L色氨酸對(duì)P.putidaRs-198生長(zhǎng)曲線及IAA產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可知:外源添加色氨酸并未對(duì)P.putidaRs-198的生長(zhǎng)曲線,尤其是各生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短產(chǎn)生影響,P.putidaRs-198細(xì)胞生物量在2個(gè)處理組中均在培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到最大;兩個(gè)處理組的P.putidaRs-198的IAA產(chǎn)量都會(huì)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,經(jīng)50 mg/L色氨酸處理后,IAA產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組,并且在96 h時(shí)IAA產(chǎn)量可以達(dá)到55.52 mg/L,是對(duì)照組(15.53 mg/L)的3.58倍。而Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn),菌株B.pyrrociniaJK-SH007的IAA產(chǎn)量會(huì)隨著色氨酸濃度的增加而持續(xù)升高,但是當(dāng)色氨酸的質(zhì)量濃度為8.0～10.0 mg/mL時(shí),合成的IAA開始減少,但是依然高于對(duì)照組的產(chǎn)量,且在36 h時(shí)到達(dá)最大(6.969 mg/L)。這主要可能是由于在6～24 h期間為細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期,細(xì)胞快速分裂,即24～36 h為生長(zhǎng)穩(wěn)定期,細(xì)菌在生長(zhǎng)后期開始產(chǎn)生并積累次級(jí)代謝產(chǎn)物IAA。類似的,色氨酸的添加不會(huì)顯著影響菌株R.tropiciCIAT 899的生長(zhǎng)曲線,并且其產(chǎn)生的IAA的量也是開始時(shí)緩慢,中期穩(wěn)定,中后期達(dá)到最大(47.83 mg/L)[22]。

圖2 色氨酸對(duì)P. putida Rs-198生長(zhǎng)曲線和IAA產(chǎn)量影響Fig.2 Effects of exogenous tryptophan on P. putida Rs-198 growth and IAA production

2.2 P. putida Rs-198合成IAA中間代謝產(chǎn)物分析

2.2.1 吲哚丙酮酸添加對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響

在P.putidaRs-198的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加吲哚丙酮酸(IPyA),以判斷其是否可以利用IPyA合成IAA,結(jié)果見圖3。由圖3可知:發(fā)酵3 h時(shí),IAA的產(chǎn)量為4.60 mg/L;而12 h時(shí),IAA的含量達(dá)到20.94 mg/L,是不添加IPyA處理組的2.16倍,且此時(shí)IPyA已被完全消耗殆盡。另外,IPyA的下游另一類產(chǎn)物吲哚-3-乳酸(ILA)從3 h起就有較高的含量,但是隨時(shí)間延長(zhǎng)并未有明顯變化,而IAA的量卻在逐漸增加,表明IPyA在發(fā)酵3 h之后的消耗主要是在向IAA轉(zhuǎn)化,有可能是因?yàn)镻.putidaRs-198菌株含有充足的吲哚丙酮酸脫羧酶及醛脫氫酶,使得IPyA不斷向IAA轉(zhuǎn)化。然而,添加色氨酸后,P.putidaRs-198菌株中IAA的量并不會(huì)無限制增長(zhǎng),這可能是因?yàn)榇司狈纳彼岬竭胚岜徂D(zhuǎn)化的氨基轉(zhuǎn)移酶,所以推斷P.putidaRs-198依賴IPyA途徑合成IAA,這是主要限速步驟。而Koga等[23]發(fā)現(xiàn),在最高添加1 mg/mL色氨酸的腸桿菌發(fā)酵液中,同時(shí)檢測(cè)到了IAA、ILA和吲哚-3-乙醇(TOL),但是在有氧條件下IAA的產(chǎn)量較高,而在少氧條件下,ILA和TOL的產(chǎn)量則要高一些,充分說明腸桿菌通過IPyA和吲哚乙醛(IAAld)將色氨酸轉(zhuǎn)化為IAA。

圖3 IPyA添加對(duì)P. putida Rs-198合成IAA的影響Fig.3 Effects of IPyA on IAA production in P. putida Rs-198

2.2.2 色胺添加對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響

考察外源添加色胺(TAM)對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可知:在發(fā)酵3 h時(shí),發(fā)酵液中的TAM的含量較高,且未檢測(cè)到IAA;而在6和12 h時(shí),TAM峰面積減小的同時(shí),IAA的峰面積卻逐漸增大,表明P.putidaRs-198可以利用TAM途徑合成IAA。同時(shí)發(fā)現(xiàn),在12 h時(shí),發(fā)酵液中仍有TAM,表明P.putidaRs-198可以TAM為底物合成IAA,但是該途徑中催化IAA轉(zhuǎn)化的色胺氧化酶或醛脫氫酶產(chǎn)量有限,限制了其向IAA的不斷轉(zhuǎn)化。結(jié)合IPyA途徑的醛脫氫酶量充足可以推斷,色胺氧化酶為P.putidaRs-198可通過TAM途徑利用色氨酸合成IAA,色胺氧化酶是主要限速酶。

圖4 添加TAM對(duì)P. putida Rs-198合成IAA的影響Fig.4 Effects of TAM addition on IAA production in P. Putida Rs-198

2.3.3 吲哚乙酰胺添加對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響

考察外源添加吲哚乙酰胺(IAM)對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響,結(jié)果見圖5。由圖5可知:在發(fā)酵培養(yǎng)3、6和12 h時(shí),IAM的濃度并沒有發(fā)生明顯的變化;與不添加IAM相比,IAA的產(chǎn)量變化也不顯著,分別為0.56、1.50和8.32 mg/L,表明P.putidaRs-198菌株可能無法利用外源添加的IAM來合成IAA。

圖5 外源添加IAM對(duì)IAA合成的影響Fig.5 Effects of IAM addition on IAA production in P. putida Rs-198

2.2.4 吲哚乙腈添加對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響

考察外源添加吲哚乙腈(IAN)對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響,結(jié)果見圖6。由圖6可知:與添加IAM類似,發(fā)酵培養(yǎng)3、6和12 h時(shí), IAN的濃度并沒有產(chǎn)生明顯的變化,特別12 h時(shí)發(fā)酵液中IAA的濃度與對(duì)照相比反而減少了59.37%,可以推斷,P.putidaRs-198并不能利用外源添加的IAN合成IAA。

圖6 外源添加IAN對(duì)P. putida Rs-198 IAA合成的影響Fig.6 Effects of exogenous addition of IAN on IAA production in P. Putida Rs-198

2.3 P. putida Rs-198菌株中與IAA合成相關(guān)酶編碼基因分析

對(duì)P.putidaRs-198進(jìn)行了全基因組測(cè)序和KEGG功能注釋,結(jié)果見表1。由表1可知:在KEGG的mapko00380色氨酸代謝途徑中,5個(gè)與IAA相關(guān)酶編碼基因被鑒定出來,其中,有吲哚乙酰胺途徑的單加氧酶(IaaM,EC 1.13.12.3)、吲哚乙酰胺水解酶(AmiE,EC 3.5.1.4)。目前,IAM途徑是細(xì)菌研究最為深入的吲哚乙酸合成途徑,IAA合成前體色氨酸首先由色氨酸單加氧酶(IaaM)氧化為IAM,第二步是IAM水解酶將IAM轉(zhuǎn)化為IAA和氨,這一途徑也為植物提供了額外的氮源,然而這一途徑產(chǎn)生的IAA只占IAA總合成量的1%[2]。因此,這也解釋了為什么P.putidaRs-198全基因組數(shù)據(jù)分析結(jié)果中同時(shí)含有色氨酸單加氧酶(IaaM)和酰胺酶(AmiE)。但本研究結(jié)果顯示,額外添加的IAM并未明顯增加IAA合成的產(chǎn)量。此外,吲哚乙腈途徑中的腈水解酶(nitrilase,EC 3.5.5.1)被注釋,但沒有發(fā)現(xiàn)從色氨酸到吲哚乙腈反應(yīng)途徑的氧化還原酶和醛肟水解酶。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),參與色胺途徑、吲哚丙酮酸、色氨酸側(cè)鏈氧化途徑中的醛脫氫酶(EC 1.2.1.3)以及色胺到吲哚-3-乙醛的色氨酸氧化酶(MAO,EC 1.4.3.4),但是沒有發(fā)現(xiàn)從色氨酸到色胺反應(yīng)途徑的色氨酸脫羧酶、吲哚-3-乙醛的氨基轉(zhuǎn)移酶和吲哚丙酮酸脫脫羧酶以及色氨酸側(cè)鏈氧化酶。這與在添加TAM以及IPyA對(duì)P.putidaRs-198代謝產(chǎn)物的影響結(jié)果一致,TAM、IPyA消耗的同時(shí),IAA逐漸增加,說明該菌中含有色胺氧化酶和醛脫氫酶。

表1 P. putida Rs-198合成IAA的基因信息及功能注釋

因此推測(cè)的P.putidaRs-198菌株IAA合成途徑如圖7所示,綠色斜體字為菌株編碼的相關(guān)酶,藍(lán)色表示可以利用的中間物。粗箭頭表示丙酮酸脫羧酶和色胺氧化酶催化吲哚丙酮酸和色胺生成產(chǎn)物吲哚乙醛以及醛脫氫酶在途徑中占主導(dǎo)地位。

圖7 P. putida Rs-198菌株IAA合成途徑推測(cè)Fig.7 IAA synthetic pathway speculation of P. putida Rs-198

2.4 添加色氨酸培養(yǎng)的P. putida Rs-198對(duì)辣椒生長(zhǎng)影響

利用盆栽實(shí)驗(yàn)比較添加色氨酸的發(fā)酵液對(duì)辣椒生長(zhǎng)的影響,結(jié)果見表2。由表2可知:NA-S和NA-C處理組與全發(fā)酵液組相比,并不能顯著影響辣椒植株的生長(zhǎng);添加色氨酸之后再培養(yǎng)P.putidaRs-198獲得的發(fā)酵液,其上清液(Try-S)和菌懸液(Try-C)都可以明顯促進(jìn)辣椒的根長(zhǎng)、株高和莖粗,根長(zhǎng)分別增長(zhǎng)了35.31%和21.34%、株高分別增高了31.99%和18.73%、莖粗分別增加了22.75%和11.51%。這可能是因?yàn)樯彼岬奶砑哟龠M(jìn)P.putidaRs-198合成的大量IAA,主要積累在上清液中。可見,外源添加色氨酸發(fā)酵P.putidaRs-198可以促進(jìn)辣椒苗的生長(zhǎng)。這與文獻(xiàn)[9,24]的結(jié)果較為一致。因此,在應(yīng)用P.putidaRs-198時(shí),在它的培養(yǎng)基中補(bǔ)充關(guān)鍵氨基酸色氨酸將會(huì)使其在土壤中發(fā)揮更好的促生效果。

表2 色氨酸發(fā)酵液對(duì)辣椒苗生物量的影響

3 結(jié)論

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),添加低濃度色氨酸對(duì)P.putidaRs-198菌株的生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響,但是其IAA合成量卻可以隨著色氨酸加量的增加而顯著增加;50 mg/L色氨酸為最佳加量,可用于P.putidaRs-198生長(zhǎng)曲線及IAA合成途徑分析。在P.putidaRs-198中,對(duì)色氨酸到IAA的途徑分析結(jié)果表明,IPyA和TAM為P.putidaRs-198合成IAA利用的主要中間物,也是主要合成途徑,其中色胺氧化酶為限速酶。另外,IAM和IAN的添加并不影響P.putidaRs-198合成IAA。盆栽實(shí)驗(yàn)表明,添加50 mg/L色氨酸培養(yǎng)P.putidaRs-198后的發(fā)酵上清液和菌懸液都可以明顯增加辣椒苗的生物量,充分證明P.putidaRs-198菌株可以利用色氨酸合成IAA,是非常有潛力的新型植物促生菌劑。