郝思怡，朱群英

（陜西省藥品和疫苗檢查中心, 陜西 西安 710075）

0 引 言

雜質(zhì)是除了藥物中的活性成分以外的化學成分，其對藥物的療效與穩(wěn)定性具有不良影響，同時還會產(chǎn)生毒副作用，從而影響藥物的臨床安全性。由于雜質(zhì)的鑒定閾值比較低，傳統(tǒng)的分離方法如溶劑萃取等只能用于溶液的預(yù)分離，目前比較常用的雜質(zhì)分離技術(shù)為色譜分離法[1-2]。常見的色譜分離技術(shù)包括柱色譜、循環(huán)色譜、薄層色譜等方法。其中薄層色譜法(Thin Layer Chromatography,TLC)是將固定相均勻涂抹在玻璃板上(或其他支物上，如塑料片或鋁制薄板)成膜，然后用適當?shù)狞c樣器將樣品點加在薄層的起始線上，待溶劑揮發(fā)后，置入展開槽中，用一定的溶劑展開，當展開到適當距離時取出，晾干，顯色后定性、定量。

柱色譜包括高壓、中壓以及常壓制備柱色譜，制備柱色譜是目前應(yīng)用最為廣泛的分離技術(shù)，其結(jié)構(gòu)簡單，且具有很強的靈活性。但該方法要求各組分間必須存在較大的分離度，否則會導致產(chǎn)率不高等情況發(fā)生。此外該方法還存在非線性的吸附現(xiàn)象從而導致產(chǎn)品被過度稀釋[3]。模擬移動床（Simulated Moving Bed，SMB）技術(shù)主要通過改變樣品進出的方式實現(xiàn)固液兩相“模擬”逆流，實際上是實施色譜分離的高度工程化過程。相比于柱色譜技術(shù)，SMB 的處理規(guī)模大、分離效率高，但其工藝較為復雜且成本較高[4]。因此，綜合考慮制備工藝、設(shè)備成本以及分離效率，研究在雙柱循環(huán)色譜的基礎(chǔ)上引入了溶劑梯度，并將其應(yīng)用于微量雜質(zhì)的提取制備中，期望此方式能為雜質(zhì)分離提取提供新思路。

1 溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜的雜質(zhì)分離與制備

1.1 溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜的雜質(zhì)分離

常見的色譜分離技術(shù)中的TLC 具有能同時分離多種樣品、固定相和流動相的選擇與變換靈活性大、可利用多種定性檢測技術(shù)(如物理和化學方法等)特點。但該方法操作量大且精度較低，因此應(yīng)用較少。單柱循環(huán)色譜主要是通過閥門切換技術(shù)使譜帶在單色譜柱內(nèi)進行循環(huán)往復流動，其能夠在不外加壓力的條件下延長等效柱長。但其易產(chǎn)生展寬現(xiàn)象，從而導致分離失敗，故研究對其進行改進并應(yīng)用于雜質(zhì)分離中，改進后的單柱型閥切換循環(huán)色譜改變了原溶質(zhì)譜帶的經(jīng)過路徑，其不再流入貯存池而是直接流入溶劑泵。該技術(shù)減小了柱外死體積，在一定程度上提升了分離效率。此外，零死體積循環(huán)色譜技術(shù)通過使用二位4 通閥形成了閉合回路，并在循環(huán)回路外設(shè)置了溶劑泵，該方法能夠有效避免由柱外死體積所造成的譜帶展寬現(xiàn)象，但目前該技術(shù)尚未應(yīng)用到色譜的制備中[5-6]。交替泵雙柱循環(huán)色譜主要通過二位6 通閥來進行色譜柱的位置切換，且每個色譜柱的出口處都安裝了檢測器以對溶液譜帶的洗脫情況進行監(jiān)測，其結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 交替泵雙柱循環(huán)色譜Fig. 1 The alternating pump dual column cyclic chromatography

由圖1 所示，當檢測器1 監(jiān)測信號值上升，且檢測器2 監(jiān)測到信號值降低時，二位6 通閥將進行閥門的切換使譜帶流入色譜柱2 中。該色譜能夠在不使用泵的情況下使譜帶在兩個色譜柱間循環(huán)流動，且能夠避免由泵腔死體積引起的譜帶擴展情況發(fā)生，但其存在容納譜帶寬度不夠長的問題[7]。因此，研究基于此引入了捕集系統(tǒng)，并在循環(huán)系統(tǒng)中設(shè)置了捕集柱，由此形成了帶捕集系統(tǒng)的雙柱型循環(huán)制備液相色譜。該系統(tǒng)主要將純水注入捕集柱中以增加流動相的含水率，從而使溶液富集在捕集柱中，具體的裝置結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖2 帶捕集柱的雙柱型循環(huán)色譜Fig. 2 The dual column cyclic chromatography with capture column

帶捕集柱的雙柱型循環(huán)色譜處理起到富集作用，還可以在六通閥與十通閥之間進行耦合切換。但該系統(tǒng)要求流動相的含水率不能過高，否則可能會導致固定相的塌陷以及流失，從而造成捕集能力下降。此外，通過改進雙柱型循環(huán)結(jié)構(gòu)基本能夠避免柱外死體積的情況發(fā)生，但在實際的雜質(zhì)提取過程中，仍然存在渦流擴散、傳質(zhì)阻力以及譜帶展寬等不良現(xiàn)象。其中，譜帶展寬主要是由非線性吸附和一些非理想因素造成的，其為雜質(zhì)的分離過程帶來了嚴重的負面影響。譜帶展寬會對合格的流份進行稀釋從而導致其濃度降低，且容易引起分解變質(zhì)。而譜帶壓縮機制能夠使譜帶前沿的遷移速度低于譜帶后沿，形成溶劑梯度，進而起到對譜帶的壓縮作用[8-9]。因此，研究進一步引入了溶劑梯度，并將其應(yīng)用到雙柱循環(huán)色譜之中。該技術(shù)主要通過在雙柱之間不斷注入一種弱溶劑，從而在上下游的流動相間形成了洗脫強度差，使得處于上游柱中的譜帶后沿速度加快。這種方式很大程度地提升了循環(huán)色譜的分離性能，且有利于產(chǎn)品濃度的增加以及產(chǎn)量的提高，提高產(chǎn)率并增大產(chǎn)品濃度，與傳統(tǒng)的雙柱型色譜相比具有顯著優(yōu)勢。因此研究將該技術(shù)運用到微量雜質(zhì)的分離制備中，以解決雜質(zhì)分離效率過低等問題。

1.2 基于溶劑梯度的雙柱循環(huán)色譜實驗

研究將引入了溶劑梯度的雙柱循環(huán)色譜應(yīng)用到實際的關(guān)鍵前雜分離中，并設(shè)計了相應(yīng)實驗進行測試。實驗選用的材料為奧利司他原料、乙腈、甲醇以及純凈水。實驗采用反相色譜對奧利司他進行分離制備，并選取甲醇與水的混合溶液作為流動相、C8 柱作為固定相。同時，實驗選用的裝置為溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜裝置，該裝置的組成部分包括2 根色譜柱、1 個二位10 通閥、1 個檢測器和3 個高壓恒流泵，其具體裝置如圖3 所示。

圖3 溶劑梯度循環(huán)色譜裝置Fig. 3 The solvent gradient cyclic chromatography device

目標雜質(zhì)的體積主要由洗脫劑中的水含量決定，通過增大循環(huán)色譜的下游水含量可以使譜帶收縮。但由于增加洗脫劑中的水含量可能會導致溶劑消耗增大、分離時間過長等問題，因此實驗將甲醇與水的比例設(shè)為了87/13 至89/11 之間。要實現(xiàn)目標雜質(zhì)的分離與純化，必須保證雜質(zhì)譜帶處于循環(huán)色譜系統(tǒng)的整個循環(huán)周期內(nèi)，其中，譜帶的前沿不能流出下游色譜柱，而后沿必須從上游色譜柱被洗脫出來，具體表示如式（1）所示。

式（1）中，F(xiàn)1代表上游的洗脫劑流量，F(xiàn)2指的是下游流量，VR，up、VR，down分別表示上下游流動相組成下的關(guān)鍵雜質(zhì)的保留體積，△t 代表循環(huán)周期。其中，上游流量不能過高，否則會對檢測器造成破壞，因此其流量設(shè)為3 mL/min，下游流量過大也會對譜帶的壓縮作用造成抵消，因此實驗將其設(shè)為了3.08 mL/min，同時，修飾劑流量設(shè)為了0.08mL/min。奧利司他的關(guān)鍵前雜分離實驗一共分為了三個階段，分別是進料階段、循環(huán)階段以及回收階段。其中進料階段是指在色譜裝置處于位置A 狀態(tài)時將原料全部注入到色譜柱1 中。在循環(huán)階段中，先添加洗脫液，再在設(shè)備中添加弱溶劑，使其成為改性劑。這時，前雜波段將由1 號柱子移入2 號柱子，閥將轉(zhuǎn)換到B 位。在此過程中，奧利司他的波段向下游移動，并向外排出，此時，目的波段由第2 色譜柱向第1 色譜柱傳遞，形成一個循環(huán)。在此基礎(chǔ)上，通過多個開關(guān)，可以將非靶標雜質(zhì)排出體系，并將靶標雜質(zhì)與整個能譜的前線分離。回收階段中，一般是在前雜與目標組分分離到一定程度時，對目標譜帶的前沿和后沿進行切割處理，并收集中間純度最高的部分作為最終產(chǎn)品。

溶劑梯度循環(huán)色譜分離技術(shù)需要對溶劑梯度、循環(huán)周期、洗脫劑含水率以及循環(huán)次數(shù)進行研究。實驗選取關(guān)鍵雜質(zhì)的純度、產(chǎn)率以及收率幾個指標來對分離效果進行評價。收率計算表示如式（2）所示。

式（2）中，VProduct、VFeed分別代表產(chǎn)品以及原料的體積，AProduct、AFeed分別表示關(guān)鍵雜質(zhì)在產(chǎn)品與原料中的峰面積。產(chǎn)率的計算如式（3）所示。

式（3）中，CFeed代表關(guān)鍵雜質(zhì)在原料中的濃度，T表示運行時間，其中包括了進料、循環(huán)以及回收階段所消耗的時間。為了直觀看出濃度譜帶的收縮程度，還需要計算相對濃度，其計算如式（4）所示。

2 溶劑梯度循環(huán)色譜在雜質(zhì)分離中的應(yīng)用分析

研究為驗證溶劑梯度循環(huán)色譜分離技術(shù)的有效性，分別采用不同的洗脫劑含水率、溶劑梯度、循環(huán)周期，以及循環(huán)次數(shù)進行實驗對比，實驗條件及結(jié)果如表1 所示。

表1 溶劑梯度循環(huán)色譜分離技術(shù)的實驗條件及結(jié)果Table 1 The experimental conditions and results of solvent gradient cyclic chromatography separation technology

由表1 可得，洗脫劑含水率分別為11%、12%、13%，原料進料體積分別為52.9mL、62.4mL、73.3mL，循環(huán)周期時長分別為18.5min、21.5min、24.5min，溶劑梯度均為1.0%。不同洗脫劑含水量情況下的純度、收率與產(chǎn)率結(jié)果如圖4 所示。由圖4可知，洗脫劑含水率越高，產(chǎn)品的純度、收率以及產(chǎn)率均隨之提升。相比于11%的洗脫劑含水率，13%的洗脫劑含水率的純度、收率及產(chǎn)率分別提升了15.2%、7%、5.2%。說明洗脫劑含水量的增加有利于關(guān)鍵雜質(zhì)與奧利司他的分離。同時可以看出，產(chǎn)率與收率隨水含量增加的趨勢逐漸變緩，說明循環(huán)周期對其影響逐步增加，倘若繼續(xù)增加含水量可能造成產(chǎn)率與收率降低且會增加溶劑消耗，因此研究選用的洗脫劑含水率為13%。此外，從三次實驗的關(guān)鍵雜質(zhì)相對濃度的數(shù)據(jù)來看，可以說明溶劑梯度能夠?qū)崿F(xiàn)對關(guān)鍵雜質(zhì)的分離以及富集。

圖4 不同洗脫劑含水量的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 4 The purity, yield, and productivity of different eluents with different water contents

實驗3~實驗5 主要考察了溶劑梯度對分離過程的影響，其中，實驗設(shè)置的洗脫劑均為13%，原料體積為73.3mL，循環(huán)次數(shù)均為8 次，循環(huán)周期均為24.5min，溶劑梯度依次為1.0%、2.0%、1.5%。同時需要保證在修飾劑流量不變的條件下改變修飾劑的含水量以調(diào)整溶劑梯度大小。由表1 可知，目標組分的相對濃度溶劑隨著溶度梯度的增大而增加，說明譜帶受到的壓縮力隨著梯度的增加而有所提升。溶劑梯度對產(chǎn)品純度、收率以及產(chǎn)率的影響效果如圖5 所示。由圖5 可知，產(chǎn)品的純度在溶劑梯度為1.5%時達到最高，其值為52.3%。因此研究選用的溶劑梯度為1.5%。

圖5 不同溶劑梯度的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 5 The purity, yield, and productivity of different solvent gradients

實驗5~實驗7 主要考察了循環(huán)周期對分離效果的影響，其中，實驗設(shè)置的洗脫劑含水量均為13%，溶劑梯度均為1.5%，循環(huán)次數(shù)均設(shè)為了8 次，循環(huán)周期分別設(shè)為了24.5min、26.5min、28.5min。循環(huán)周期時長對產(chǎn)品純度、收率以及產(chǎn)率的影響效果如圖6 所示。由圖6 可知，產(chǎn)品的純度以及收率隨著循環(huán)周期的加長而增大，其中循環(huán)周期為28.5min 的產(chǎn)品純度為72.5%，相比于24.5min 的循環(huán)周期增長了20.4%。同時，循環(huán)周期為28.5min 的產(chǎn)品收率高達90.1%，說明隨著循環(huán)周期時長的增加，奧利司他與關(guān)鍵雜質(zhì)的分離效果也隨之提升。但產(chǎn)率波動不大，主要原因在于其受到循環(huán)周期與收率的限制。此外，循環(huán)周期不宜過長，否則會導致目標組分流出下游的色譜柱，因此研究選用28.5min 作為循環(huán)周期。

圖6 不同循環(huán)周期下的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 6 The purity, yield, and productivity under different cycle cycles

實驗7~實驗9 主要考察循環(huán)次數(shù)對分離過程的影響，其中，實驗設(shè)置的洗脫劑含水量均為13%，溶劑梯度均為1.5%，循環(huán)周期時長為28.5min，循環(huán)次數(shù)依次為8 次、10 次以及12 次。圖7 為循環(huán)次數(shù)對的純度、收率以及產(chǎn)率的影響結(jié)果。

圖7 不同循環(huán)次數(shù)下的純度、收率與產(chǎn)率Fig. 7 The purity, yield, and productivity under different cycles

通過圖7 可得，當循環(huán)次數(shù)為8~10 次時，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，雜質(zhì)的純度和收率均隨著循環(huán)次數(shù)的增加而提升，但循環(huán)次數(shù)從10 次到12 次的增長較為平緩。主要原因在于奧利司他以及關(guān)鍵前雜的總寬度會隨著循環(huán)系數(shù)的增加而增大，而譜帶壓縮機制會抑制總譜帶的展寬。因此當循環(huán)次數(shù)繼續(xù)增加到12 次時，譜帶的壓縮與總譜帶的展寬會趨于動態(tài)平衡，因此，研究選擇10 次作為最終的循環(huán)次數(shù)。

3 結(jié) 論

藥物微量雜質(zhì)的分離提取對藥物的安全性具有重要影響作用。研究將溶劑梯度與雙柱循環(huán)色譜技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計出了一種藥物雜質(zhì)分離新方法。結(jié)果表明，在探究循環(huán)周期對分離效果的影響實驗中，產(chǎn)品的純度以及收率隨著循環(huán)周期的加長而增大，其中循環(huán)周期為28.5min 的產(chǎn)品純度為72.5%，相比于24.5min 的循環(huán)周期增長了20.4%。在探究洗脫劑含水率對分離效果的影響實驗中，產(chǎn)品的純度、收率以及產(chǎn)率隨洗脫劑含水率的提升而增加。在考察洗脫劑含水率對分離過程的影響實驗中，關(guān)鍵雜質(zhì)的純度和收率隨著循環(huán)次數(shù)的增加而提升。說明溶劑梯度雙柱循環(huán)色譜技術(shù)能夠有效解決雜質(zhì)分離效率過低、分離純度不高等問題。但研究對于溶劑梯度在雙柱循環(huán)色譜技術(shù)中的應(yīng)用只考慮到反相層面，因此有待進一步改進。