李栗妍, 馬向薇, 劉星池, 張 寧, 于月新

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科,遼寧 沈陽(yáng) 110016

反復(fù)種植失敗的原因很多,除了遺傳、內(nèi)分泌、感染及解剖等以外,還有免疫因素。未知原因?qū)е碌牧鳟a(chǎn)大多與免疫因素密切相關(guān),而其中具體機(jī)制仍無(wú)法確定[1]。隨著生殖免疫學(xué)研究的深入,人們對(duì)妊娠免疫、免疫性不孕及反復(fù)種植失敗等問(wèn)題有了新的認(rèn)識(shí),已經(jīng)逐漸確定了免疫因素在生殖過(guò)程中的重要作用[2]。有研究表明,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和不明原因性不孕癥可能與同種異體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的失衡、封閉抗體缺乏等相關(guān)[3-4],淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療(lymphocyte immune therapy,LIT)可以提高封閉抗體陽(yáng)性率,從而防止胚胎被母體免疫系統(tǒng)攻擊而流產(chǎn)[5]。LIT是將患者配偶或第三方無(wú)關(guān)人士的淋巴細(xì)胞注入患者皮下,刺激母體的免疫耐受機(jī)制,促進(jìn)封閉抗體的產(chǎn)生,有效阻止胚胎父系抗原被母體免疫系統(tǒng)攻擊,保護(hù)胚胎[6],多次注射刺激還可以提高免疫記憶力,從而進(jìn)一步提高再次妊娠成功的概率[7]。本研究旨在探討LIT對(duì)反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結(jié)局的影響,并分析其相關(guān)影響因素?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取自2018年1月至2020年12月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的封閉抗體陰性且反復(fù)種植失敗的94例患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):封閉抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性;無(wú)家族遺傳性疾病及近親婚史;患者及配偶染色體檢查結(jié)果正常;患者配偶精液檢查結(jié)果正常;符合《反復(fù)種植失敗臨床診治中國(guó)專家共識(shí)》中反復(fù)種植失敗的臨床診斷[8]。排除標(biāo)準(zhǔn):合并輸卵管堵塞、子宮畸形等生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變;合并生殖道感染;合并生殖系統(tǒng)惡性腫瘤;合并自身免疫性疾病;合并傳染性疾病,無(wú)法耐受LIT或不符合LIT指征。根據(jù)患者是否愿意接受LIT,將患者納入LIT組(n=58)和非LIT組(n=36)?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 根據(jù)準(zhǔn)備行LIT的夫妻雙方的血常規(guī)、生化檢驗(yàn)結(jié)果及家族遺傳性疾病史、近親婚史等判定是否可進(jìn)行LIT。抽取供者30 ml全血,肝素鈉抗凝,用淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笕A科生物科技有限公司)、0.9%氯化鈉溶液稀釋并充分混勻后,緩慢加入另一新的含10 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,以2 000 r/min離心20 min。充分離心后,管中由上而下分為4層:第1層為血漿,第2層環(huán)裝乳白色層為淋巴細(xì)胞層,第3層透明層為分離液層,第4層為紅細(xì)胞層。小心收集乳白色淋巴細(xì)胞層并以5 ml 0.9%氯化鈉溶液稀釋,以2 000 r/min離心15 min,將離心底部淋巴細(xì)胞團(tuán)用1 ml 0.9%氯化鈉溶液渦旋混勻。取20 μl分離的淋巴細(xì)胞混懸液進(jìn)行計(jì)數(shù),處理后的淋巴細(xì)胞濃度應(yīng)調(diào)整至20×106～40×106個(gè)/L,總體積為1 ml。將淋巴細(xì)胞混懸液在患者雙側(cè)前臂皮內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)注射,每次每點(diǎn)為0.3～0.5 ml。經(jīng)3次LIT后,于末次治療后7～10 d檢查封閉抗體是否轉(zhuǎn)陽(yáng)。若沒(méi)有產(chǎn)生封閉抗體,從第4次治療開始,每次治療后7～10 d檢測(cè)封閉抗體,直到轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。在實(shí)驗(yàn)取得陽(yáng)性結(jié)果后,根據(jù)臨床情況進(jìn)行輔助生殖,并每2～3個(gè)月進(jìn)行1次后續(xù)LIT,確定妊娠后至12周超聲顯示胎盤發(fā)育良好后可結(jié)束治療。非LIT組患者直接根據(jù)自身情況選擇合適的輔助生殖策略進(jìn)行助孕。

1.3 觀察指標(biāo) 記錄LIT組的治療次數(shù)、封閉抗體陽(yáng)性率及LIT治療濃度,封閉抗體采用美國(guó)望嵐達(dá)公司生產(chǎn)的人類白細(xì)胞抗原特異性IgG抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。比較LIT組和非LIT組的臨床指標(biāo),包括:年齡、配偶年齡、體質(zhì)量指數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間,治療前的雙側(cè)竇卵泡數(shù)和卵泡刺激素、促黃體生成素、泌乳素、雌二醇、睪酮、孕酮、抗繆勒氏管激素水平,以及輔助生殖成功率。輔助生殖成功判定:移植后14 d檢查血清人絨毛膜促性腺激素符合妊娠水平、21 d超聲檢查觀察無(wú)異位妊娠的可能、28 d超聲觀察存在胎心胎芽則判定為輔助生殖成功。同時(shí),分析各臨床指標(biāo)與反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結(jié)局的相關(guān)性、反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素。

2 結(jié)果

2.1 LIT組治療情況 58例患者中:11例(18.97%)治療4次后實(shí)現(xiàn)封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),接受LIT的治療濃度為30×106個(gè)/ml;47例(81.03%)治療5次后實(shí)現(xiàn)封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),其中,28例(48.27%)接受LIT的治療濃度為25×106個(gè)/ml,19例(32.76%)接受LIT的治療濃度為22×106個(gè)/ml。

2.2 兩組臨床指標(biāo)比較 兩組平均年齡、配偶年齡、體質(zhì)量指數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間,治療前的雙側(cè)竇卵泡數(shù)和卵泡刺激素、促黃體生成素、泌乳素、雌二醇、睪酮、孕酮、抗繆勒氏管激素水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LIT組輔助生殖成功率高于非LIT組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組臨床指標(biāo)比較

2.3 各臨床指標(biāo)與反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結(jié)局的相關(guān)性分析 年齡、配偶年齡、體質(zhì)量指數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、不孕時(shí)間、卵泡刺激素、促黃體生成素、泌乳素、雌二醇、睪酮、孕酮、抗繆勒氏管激素、左側(cè)竇卵泡數(shù)、右側(cè)竇卵泡數(shù)與反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結(jié)局無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.071、-0.051、0.084、-0.031、-0.017、-0.020、-0.099、0.026、-0.004、-0.028、0.049、-0.037、-0.062、-0.113,P均>0.05)。LIT與反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕結(jié)局存在相關(guān)性(r=0.225,P<0.05)。

2.4 反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素分析 接受LIT是反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素(P<0.05)。見表2。

表2 反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素分析

3 討論

在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中,反復(fù)種植失敗一直都是患者和醫(yī)師共同面對(duì)的難題。胚胎著床的過(guò)程十分復(fù)雜,很容易受到多種因素的影響,在胚胎移植前的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都可能導(dǎo)致著床障礙[9]。盡管尚不清楚其具體的病因及機(jī)制,但是已經(jīng)有研究證實(shí)了反復(fù)種植失敗與包括子宮內(nèi)膜容受性降低、胚胎質(zhì)量、胚胎移植技巧缺陷、精神心理因素等多種因素有關(guān)[10]。優(yōu)質(zhì)的胚胎和良好的子宮環(huán)境是成功種植的關(guān)鍵,但是值得注意的是,在體外受精-胚胎移植過(guò)程中,雖然有些患者擁有優(yōu)質(zhì)的胚胎和正常的子宮內(nèi)膜形態(tài),但是多次移植仍然未能成功妊娠[11]。對(duì)于這些反復(fù)種植失敗的患者,如果排除了染色體異常、解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖道感染、自身免疫疾病等病因,還需要考慮免疫平衡是否遭到了破壞,導(dǎo)致免疫耐受下降,繼而影響胚胎的存活[12]。體外受精-胚胎移植治療周期中,為了募集更多卵泡而使用的外源性促性腺激素會(huì)產(chǎn)生高水平的雌二醇,從而導(dǎo)致患者處于性激素高生理水平狀態(tài),免疫微環(huán)境也會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化[13]。有研究發(fā)現(xiàn),在雌二醇的超生理水平影響下,內(nèi)膜和外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)量,特別是自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量會(huì)增加,這可能與反復(fù)種植失敗的發(fā)生有關(guān)[14]。

隨著生殖免疫學(xué)的進(jìn)展,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)種植失敗與母胎免疫調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)[15]。當(dāng)胚胎攜帶父系抗原種植在母體內(nèi)時(shí),相當(dāng)于進(jìn)行了一次半同種異體移植,母體會(huì)將來(lái)自父親的基因抗原視為外來(lái)異物而進(jìn)行排斥,因此,胚胎會(huì)在母體內(nèi)被免疫清除。如果母體的免疫系統(tǒng)與胚胎源性抗原形成了免疫平衡狀態(tài),那么胚胎就可以得以存活;而一旦這種免疫平衡狀態(tài)被破壞了,就會(huì)導(dǎo)致母胎免疫失衡,從而可能導(dǎo)致反復(fù)胚胎種植失敗或流產(chǎn)的發(fā)生[16]。在這個(gè)過(guò)程中,免疫學(xué)調(diào)控起著重要的作用。在正常的妊娠中,人類白細(xì)胞抗原被互相排斥,胚胎所攜帶的父源性人類白細(xì)胞抗原就可以刺激母體免疫系統(tǒng),從而產(chǎn)生IgG型封閉抗體。這個(gè)抗體不僅可以與母體淋巴細(xì)胞表面抗原結(jié)合,還可以與胚胎自身的滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合,從而阻斷母體對(duì)胎兒的免疫識(shí)別和免疫反應(yīng)[17]。目前,臨床可以應(yīng)用LIT技術(shù)對(duì)缺乏封閉抗體的反復(fù)種植失敗患者進(jìn)行免疫治療,主要是通過(guò)引入患者配偶(或第三方)的淋巴細(xì)胞來(lái)刺激患者的免疫系統(tǒng),從而產(chǎn)生具有免疫保護(hù)作用的封閉抗體[18]。當(dāng)患者再次妊娠時(shí),這些封閉抗體就可以識(shí)別胚胎上來(lái)自丈夫的抗原,并與之結(jié)合,從而產(chǎn)生封閉作用,防止胚胎或胎兒父系抗原被母體免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷,從而讓胚胎得到保護(hù)并且進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育。本研究結(jié)果顯示:LIT組輔助生殖成功率高于非LIT組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);接受LIT是反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者助孕成功的影響因素(P<0.05)。LIT用于不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者時(shí),主要機(jī)制是淋巴細(xì)胞免疫可提高患者的免疫反應(yīng)性,從而使其獲得封閉抗體,同時(shí)也可提高患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量,并且誘導(dǎo)患者體內(nèi)Th1/Th2平衡向Th2偏離,從而防止胚胎或胎兒父系抗原被母體免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷,產(chǎn)生免疫保護(hù),從而幫助維持正常妊娠[19-21]。

綜上所述,反復(fù)種植失敗的封閉抗體陰性患者接受LIT可有效使封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),提高輔助生殖的助孕效果。