郭玲玲, 韓 曉, 陳哲遠(yuǎn), 程 鳳, 王卓君, 田孝野, 金紅旭

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科,遼寧 沈陽(yáng) 110016

腦創(chuàng)傷是由突然的外力作用導(dǎo)致的急性神經(jīng)損傷性疾病,其病死率和致殘率位居創(chuàng)傷首位[1]。盡管臨床診療水平在不斷提高,但部分腦創(chuàng)傷患者常表現(xiàn)出神經(jīng)功能障礙,導(dǎo)致患者勞動(dòng)能力喪失,生活質(zhì)量下降,嚴(yán)重危害患者的身心健康。有研究報(bào)道,腦創(chuàng)傷導(dǎo)致的死亡患者占所有外傷致死性患者的30%～40%,且是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙最重要的原因之一。但臨床上仍缺少創(chuàng)傷后記憶障礙便捷有效的治療方法[2-3]。外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑為30～100 nm的微粒,具有磷脂包膜且富含蛋白質(zhì)、磷脂、mRNAs和miRNAs等生物活性分子[4-6]。有研究報(bào)道,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可用于腦創(chuàng)傷,其優(yōu)勢(shì)在于取材方便、體積微小、低免疫原性,具有跨血腦屏障和有效轉(zhuǎn)運(yùn)生物分子及與靶細(xì)胞相互作用的能力[7-9]。外泌體可以經(jīng)過尾靜脈輸送至大腦,對(duì)腦創(chuàng)傷后的病理生理過程發(fā)揮調(diào)控作用[10-11]。但脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平減輕腦創(chuàng)傷認(rèn)知障礙的機(jī)制仍未明確。本研究旨在探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)腦創(chuàng)傷記憶障礙的作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體提取及鑒定 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司,待細(xì)胞密度約80%時(shí),采用無外泌體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清。通過差速離心法分離外泌體,透射電鏡觀察、NTA檢測(cè)和蛋白免疫印跡法檢測(cè)CD63、TSG101表達(dá)進(jìn)行外泌體鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取24只雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量180～220 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司。大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,溫度維持(22±3)℃,濕度維持45%～65%,自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、腦創(chuàng)傷組、外泌體組,每組各8只。對(duì)照組大鼠不作處理,腦創(chuàng)傷組、外泌體大鼠采用落體撞擊法建立腦創(chuàng)傷模型。對(duì)照組和腦創(chuàng)傷組分別靜脈給予等體積生理鹽水,外泌體組靜脈給予脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體300 μg。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 7 d后采用水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠記憶能力。實(shí)驗(yàn)開始后第1～5天,將各組大鼠頭朝向水池壁的方向放入水中,通過分析跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間。在訓(xùn)練過程中,若在1 min后大鼠仍未尋找到站臺(tái),則人為引導(dǎo)大鼠到平臺(tái)停留10 s;記錄不同訓(xùn)練時(shí)間逃避潛伏期。實(shí)驗(yàn)開始后第6天,開始隱蔽站臺(tái)測(cè)試,記錄穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限時(shí)間。

1.4 濕干重檢測(cè) 通過10%水合氯醛麻醉大鼠,快速取得腦組織,使用濾紙擦去表面水分,置于已烤干并稱重(重量為W)的載玻片上稱重并記錄(W1),然后置于60℃烘箱內(nèi)烘烤24 h,間隔15 min重復(fù)稱重以取得恒重并記錄(W2)。

組織含水量=(W1-W)/(W2-W)×100%

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠腦組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factors,BDNF)表達(dá)。將組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白提取后,從已平衡至室溫的密封袋中取出板條和試劑。標(biāo)準(zhǔn)品孔和加樣孔均按照說明書操作。按順序加入工作液并孵育,顯色并終止后450 nm下測(cè)量吸光度。

1.6 蛋白免疫印跡法 采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)Tau、S100β、TrkA、TrkB蛋白表達(dá)情況。進(jìn)行組織蛋白的提取和總蛋白測(cè)定后,將蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫封閉1 h,分別用一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次,加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次,采用ECL Western印跡試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體提取結(jié)果 NTA檢測(cè)結(jié)果顯示,外泌體基本處于30～200 nm的分布范圍(圖1a);透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,能夠觀察到nm級(jí)膜泡形態(tài)外泌體的典型結(jié)構(gòu)(圖1b);蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示,在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液中提取的外泌體存在特異性蛋白-膜蛋白CD63和膜結(jié)合蛋白TSG101表達(dá)(圖1c)。本研究采用差速離心法成功提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。

2.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體改善腦損傷程度 腦創(chuàng)傷組大鼠濕干比、Tau和S100β蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外泌體組大鼠濕干比、Tau和S100β蛋白表達(dá)水平低于腦創(chuàng)傷組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體改善腦損傷程度(a.濕干重檢測(cè)結(jié)果;b.腦損傷相關(guān)蛋白檢測(cè)代表圖;c.腦損傷相關(guān)蛋白相對(duì)灰度值)

2.3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體改善腦創(chuàng)傷后遠(yuǎn)期認(rèn)知功能損傷 與對(duì)照組比較,腦創(chuàng)傷組大鼠第2～5天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少,目標(biāo)象限時(shí)間明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與腦創(chuàng)傷組比較,外泌體組大鼠第2～5天逃避潛伏期縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)增加,目標(biāo)象限時(shí)間延長(zhǎng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠水迷宮檢測(cè)結(jié)果

2.4 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體增加腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平 與對(duì)照組比較,腦創(chuàng)組大鼠腦組織NGF、BDNF表達(dá)下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與腦創(chuàng)傷組比較,外泌體組大鼠腦組織NGF、BDNF表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平比較

2.5 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體調(diào)節(jié)TrkA/TrkB受體蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較,腦創(chuàng)傷組大鼠腦組織TrkA和TrkB蛋白表達(dá)下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與腦創(chuàng)傷組比較,外泌體組大鼠腦組織TrkA和TrkB蛋白表達(dá)提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體調(diào)節(jié)通路蛋白表達(dá)

3 討論

腦創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致腦細(xì)胞及腦組織變形、丟失,導(dǎo)致殘疾,其臨床表現(xiàn)個(gè)體差異性較大,一方面因?yàn)榇竽X結(jié)構(gòu)與功能比較復(fù)雜,另一方面因?yàn)橹聜?、致傷程度和致傷病理機(jī)制復(fù)雜多變[12]。盡管腦創(chuàng)傷的治療取得了明顯進(jìn)步,但腦創(chuàng)傷后記憶障礙仍經(jīng)常發(fā)生,治療手段需進(jìn)一步探索。本研究發(fā)現(xiàn),早期靜脈注射脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠有效減輕腦創(chuàng)傷大鼠記憶損傷,其作用與降低腦水腫和損傷相關(guān)蛋白表達(dá)水平有關(guān);此外,機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和其受體蛋白的表達(dá)水平。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì),廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用,且能防止神經(jīng)元受損傷后死亡,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等,在大腦學(xué)習(xí)認(rèn)知能力、記憶功能中具有重要作用,是影響突觸可塑性的蛋白質(zhì)[13-15]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族包括NGF、BDNF等。有研究報(bào)道,缺乏NGF對(duì)學(xué)習(xí)、記憶、思維、感知覺等認(rèn)知功能有顯著影響,血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降可能與NGF和BDNF減少有關(guān)[16-17],與本研究結(jié)果一致。腦創(chuàng)傷大鼠發(fā)生記憶障礙、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和相應(yīng)受體表達(dá)降低,可能與腦水腫導(dǎo)致的細(xì)胞功能異常等腦組織損傷有關(guān)。NGF通過與效應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞上的TrkA受體結(jié)合,促進(jìn)感覺和交感神經(jīng)元的存活和分化,加速損傷神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù)[18]。BDNF與TrkB結(jié)合后,可同時(shí)激活細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)的激酶瀑布效應(yīng),其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用涉及抗細(xì)胞凋亡,拮抗自由基及興奮性氨基酸,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,調(diào)節(jié)基因表達(dá)及信號(hào)傳遞等機(jī)制[19]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中富含NGF、BDNF和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞因子。此外,外泌體中miRNA等成分還能夠促進(jìn)組織中NGF和BDNF的表達(dá)[20]。本研究發(fā)現(xiàn),脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可改善大鼠記憶障礙,其可能是通過外源性補(bǔ)充及促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌而發(fā)揮作用。

綜上所述,早期靜脈給予脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可調(diào)節(jié)腦創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌及TrkA/TrkB受體,減輕大腦損傷,促進(jìn)認(rèn)知障礙恢復(fù)。