劉 欣, 劉 亮, 張 旭

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科;2.心血管外科,遼寧 沈陽(yáng) 110016

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是全球范圍內(nèi)致殘致死的主要原因之一[1]。TBI所導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙等神經(jīng)功能缺損長(zhǎng)期存在,給患者造成痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。TBI發(fā)生時(shí),暴力直接作用于腦組織造成神經(jīng)元死亡。原發(fā)損傷發(fā)生后,氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等繼發(fā)病理持續(xù)蔓延,可導(dǎo)致周?chē)鷧^(qū)域神經(jīng)元凋亡等繼發(fā)損傷。盡管有大量研究闡發(fā)TBI發(fā)病機(jī)制,但臨床上目前仍缺乏減輕TBI神經(jīng)后遺癥的有效方法[2]。基于干細(xì)胞移植的治療方法有助于補(bǔ)充和替代受損的神經(jīng)元,并且能夠幫助重建受損的神經(jīng)環(huán)路,促進(jìn)TBI患者神經(jīng)功能恢復(fù)。但干細(xì)胞來(lái)源有限、免疫排斥等問(wèn)題是該療法應(yīng)用的關(guān)鍵障礙。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是骨髓來(lái)源、具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞[3]。BMSCs在骨髓中含量相對(duì)豐富且易于提取,用于自體移植可有效避免移植排斥,是理想的移植細(xì)胞。有研究報(bào)道,經(jīng)多途徑移植的BMSCs可有效向組織損傷灶歸巢遷移,并可向神經(jīng)元方向分化[4]。然而,誘導(dǎo)BMSCs分化為功能性神經(jīng)細(xì)胞的穩(wěn)定有效策略并不明確。杜仲(eucommia ulmoides,EU)是一種具有補(bǔ)肝腎、堅(jiān)筋骨,補(bǔ)中氣等作用的中藥,含有苯丙素類(如綠原酸)、黃酮類、多糖類等多種生物活性成分[5]。藥理學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn),EU可產(chǎn)生持久的中樞性降壓效應(yīng),并能有效改善脊髓灰質(zhì)炎后遺癥[5-6],提示EU可能具有神經(jīng)功能調(diào)節(jié)和神經(jīng)損傷修復(fù)作用。但EU能否誘導(dǎo)BMSCs等干細(xì)胞神經(jīng)分化尚不清楚。本研究旨在探討EU提取物對(duì)BMSCs形態(tài)、增殖和神經(jīng)分化等生物學(xué)特性的改變,明確EU預(yù)處理對(duì)BMSCs移植治療TBI神經(jīng)功能障礙和組織損傷效能的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只3月齡(22～25 g)雄性C57BL/6小鼠(8只用于提取原代BMSCs、32只用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn))、8只3月齡(22～25 g)雄性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1O sb/J綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自南京生物醫(yī)藥研究院[合格證號(hào):201706897;許可證號(hào):SCXK(蘇)2015-0001],飼養(yǎng)于恒溫(21℃)、恒濕(50%)、12 h:12 h光照/黑暗周期的SPF級(jí)動(dòng)物室。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及保護(hù)的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行(倫理號(hào):2020-009)。

1.1.2 主要試劑 EU提取物(規(guī)格:杜仲綠原酸5%;恒興生物,張家界)、CCK-8試劑盒(貨號(hào):C0037;碧云天,上海)、兔抗神經(jīng)原纖維輕鏈(neurofilament light chain,Nefl)多克隆抗體(貨號(hào):12998-1-AP;Proteintech,武漢)、兔抗微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)多克隆抗體(貨號(hào):17490-1-AP;Proteintech,武漢)、小鼠抗GFP單克隆抗體(貨號(hào):66002-1-Ig;Proteintech,武漢)、TRIzol試劑(貨號(hào):15596026;Thermo Fisher,上海)、TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0(貨號(hào):RR019A,TaKaRa,日本)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(貨號(hào):RR820A,TaKaRa)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 體外實(shí)驗(yàn):將原代培養(yǎng)C57BL/6小鼠來(lái)源BMSCs接種于6孔板,分為EU組、Control組(每組8復(fù)孔),分別以添加EU提取物(100 μg/ml)和等量溶劑(0.9%生理鹽水)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d或70 d。通過(guò)相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。通過(guò)細(xì)胞融合度分析和CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖。通過(guò)NEFL和MAP2的免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色及Oct4、Nefl、神經(jīng)分化因子(neuro differentiation factor 1,Neurod1)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,Ngf)的定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞神經(jīng)分化。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將3月齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為Sham surgery組、TBI組、TBI+BMSCs組和TBI+EU_BMSCs組(每組各8只)。對(duì)TBI組、TBI+BMSCs組和TBI+EU_BMSCs組進(jìn)行TBI手術(shù)。術(shù)后7 d,TBI組給予100 μl PBS,TBI+BMSCs組經(jīng)眶內(nèi)靜脈注射1×106無(wú)特殊處理的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源BMSCs(100 μl PBS懸液),TBI+EU_BMSCs組經(jīng)眶內(nèi)靜脈注射等量EU提取物(100 ng/ml)預(yù)處理14 d的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源BMSCs。Sham surgery組接受除TBI手術(shù)及細(xì)胞注射移植以外的其他操作。TBI術(shù)前1 d和術(shù)后1、3、7、10、14、17、21、24、28 d通過(guò)轉(zhuǎn)棒式疲勞儀和平衡木行走試驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)全部完畢后處死動(dòng)物,取材腦組織進(jìn)行IF染色(GFP和MAP2)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 自3月齡C57BL/6小鼠或GFP轉(zhuǎn)基因小鼠股骨和脛骨髓腔吸取骨髓,在PBS中制成單細(xì)胞懸液,經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾、離心[TD-6M離心機(jī),百典(上海)儀器設(shè)備,離心半徑16 cm,1 500 r/min,5 min]、棄上清、紅細(xì)胞裂解液孵育(2×106個(gè)細(xì)胞/ml,5 min)后,加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12)終止裂解,離心(1 500 r/min,5 min)、棄上清,以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)于T75培養(yǎng)瓶(2×106個(gè)細(xì)胞/ml)。原代培養(yǎng)第4代細(xì)胞用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞生長(zhǎng)融合度=待測(cè)細(xì)胞覆蓋率×100%

1.2.3 CCK-8檢測(cè) 細(xì)胞以原培養(yǎng)基接種于96孔板(2×105個(gè)細(xì)胞/ml,200 μl/孔,每組8孔)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μl CCK-8試劑,37℃孵育1 h,酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度值(A450)。

相對(duì)細(xì)胞存活率=待測(cè)孔A450/Control組A450均值×100%

1.2.4 IF染色 檢測(cè)前將細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被蓋玻片(1×105個(gè)細(xì)胞/ml,每組8復(fù)孔)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細(xì)胞樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min、0.5% Triton X-100透化處理5 min、5% BSA-PBS封閉1 h后,以一抗(兔抗NEFL多克隆抗體或兔抗MAP2多克隆抗體)工作液(5% BSA-PBS 1:100稀釋)4℃孵育過(guò)夜。樣本經(jīng)0.1% BSA-PBS洗滌、在暗室中依次孵育二抗(山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 488)工作液(5% BSA-PBS 1:500稀釋)1 h和DAPI工作液(1 μg/ml)5 min、封固于50%甘油-PBS后,以BX51熒光顯微鏡(Olympus,日本)采集圖像。

將腦組織樣本制備為5 μm冰凍切片。切片經(jīng)甲醇固定10 min、5% BSA-PBS封閉1 h后,以一抗(兔抗MAP2多克隆抗體和小鼠抗GFP單克隆抗體)工作液(5% BSA-PBS 1∶100稀釋)4℃孵育過(guò)夜。切片經(jīng)PBS洗滌、在暗室中依次孵育二抗(山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 594和山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor 488)工作液(均以5% BSA-PBS 1∶500稀釋)1 h和DAPI工作液(1 μg/ml)5 min、封固于50%甘油-PBS后,以BX51熒光顯微鏡(Olympus,日本)采集圖像。

1.2.5 qRT-PCR 以TRIzol試劑提取細(xì)胞樣本總RNA。每樣本取500 ng RNA以TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒在LightCycler?96 System(Roche,上海)中擴(kuò)增cDNAs(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū);引物序列見(jiàn)表1)。以2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)[7]。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

表1 引物序列

1.2.6 TBI模型手術(shù) 在10%水合氯醛麻醉(400 mg/kg)、腦立體定位儀固定下,對(duì)C57BL/6小鼠左側(cè)皮層上方開(kāi)5 mm骨窗,采用改良Allen重物墜落打擊法制備中度TBI模型(重錘質(zhì)量:10 g,下落高度:3 cm)。小鼠均損傷對(duì)側(cè)肢體癱瘓、不能直線爬行,即表明TBI造模成功[8]。

1.2.7 運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè) 在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀試驗(yàn)中,記錄每只小鼠在旋轉(zhuǎn)軸(40 r/min)上停留時(shí)間。在平衡木行走試驗(yàn)中,記錄小鼠通過(guò)平衡木(寬6.0 mm、長(zhǎng)1.2 m、離地30.0 cm)時(shí)右后肢足失誤次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 EU提取物對(duì)BMSCs形態(tài)與增殖的影響 BMSCs貼壁生長(zhǎng),大多呈梭形、星形或多角形(圖1a)。EU提取物處理14 d后,細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。暴露于EU提取物70 d后,細(xì)胞形態(tài)明顯改變,多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞突起明顯增多、延長(zhǎng),相鄰細(xì)胞突起交互連接形成網(wǎng)絡(luò),部分細(xì)胞呈神經(jīng)元樣形態(tài)。EU提取物處理14 d后,相差顯微鏡圖片量化分析顯示,EU組細(xì)胞生長(zhǎng)融合度顯著高于Control組(P<0.001,圖1a、b);CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,EU組細(xì)胞存活率較Control組增加約50%(P<0.001,圖1c)。

圖1 EU提取物對(duì)BMSCs形態(tài)與增殖的影響[a.相差顯微鏡圖片;b.細(xì)胞融合度分析,①P<0.001;c.細(xì)胞增殖CCK-8試驗(yàn),①P<0.001]

2.2 EU提取物對(duì)BMSCs神經(jīng)分化的影響 IF染色結(jié)果顯示,EU提取物處理70 d后,EU組(65.05%±5.79%)細(xì)胞分化呈NEFL+(P<0.001,圖2a、b),(70.31%±5.46%)細(xì)胞呈MAP2+(P<0.001,圖2c、d),而Control組未檢出NEFL+和MAP2+細(xì)胞。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,EU提取物處理14 d后,EU組未分化干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4和成熟神經(jīng)元標(biāo)記物Nefl轉(zhuǎn)錄水平較Control組未發(fā)生明顯改變,而神經(jīng)譜系分化特異性轉(zhuǎn)錄因子Neurod1和Ngf的表達(dá)量則明顯高于Control組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖2e)。EU提取物處理70 d后,EU組Oct4 mRNA表達(dá)量低于Control組,而Nefl、Neurod1和Ngf轉(zhuǎn)錄水平高于Control組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖2f)。

圖2 EU提取物對(duì)BMSCs神經(jīng)分化的影響[a.NEFL的IF染色圖像;b.NEFL+細(xì)胞比例定量分析,①P<0.001;c.MAP2的IF染色圖像;d.MAP2+細(xì)胞比例定量分析,①P<0.001;e.EU提取物處理14 d后Oct4、Nefl、Neurod1及Ngf mRNA表達(dá)量qRT-PCR分析,①P<0.001;f.EU提取物處理70 d后Oct4、Nefl、Neurod1及Ngf mRNA表達(dá)量qRT-PCR分析,①P<0.001]

2.3 EU提取物對(duì)BMSCs移植治療TBI小鼠運(yùn)動(dòng)障礙效能的影響 轉(zhuǎn)棒式疲勞儀試驗(yàn)顯示,與Sham surgery組小鼠比較,行TBI手術(shù)各組小鼠術(shù)后1 d轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間降至術(shù)前1/3,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與TBI組比較,TBI+BMSCs組小鼠術(shù)后14～28 d轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。TBI+EU_BMSCs組術(shù)后17～28 d轉(zhuǎn)棒保持能力較TBI+BMSCs組進(jìn)一步顯著增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖3a。平衡木行走試驗(yàn)顯示,TBI+BMSCs組右后肢足失誤次數(shù)在術(shù)后10～28 d顯著少于TBI組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);TBI+EU_BMSCs組術(shù)后10～28 d通過(guò)平衡木時(shí)的足失誤次數(shù)則較TBI+BMSCs組進(jìn)一步減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖3b。

圖3 EU提取物對(duì)移植BMSCs治療TBI小鼠運(yùn)動(dòng)障礙效能的影響(a.轉(zhuǎn)棒式疲勞儀試驗(yàn);b.平衡木行走試驗(yàn))

2.4 EU提取物對(duì)移植BMSCs在TBI小鼠腦組織損傷灶內(nèi)遷移及分化的影響 IF染色顯示,損傷28 d后,TBI組小鼠左側(cè)運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)皮層損傷灶內(nèi)MAP2表達(dá)量顯著低于Sham Surgery組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。TBI+BMSCs組MAP2表達(dá)水平高于TBI組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);TBI+EU_BMSCs組MAP2表達(dá)量高于TBI+BMSCs組,但仍低于Sham Surgery組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。此外,TBI+EU_BMSCs組小鼠損傷灶內(nèi)GFP+移植細(xì)胞含量及分化為MAP2+細(xì)胞的GFP+移植細(xì)胞比例均顯著高于TBI+BMSCs組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖4。

圖4 EU提取物對(duì)移植BMSCs在TBI小鼠腦組織損傷灶內(nèi)遷移及分化的影響[a.GFP與MAP2的IF雙重染色圖像;b.MAP2熒光強(qiáng)度定量分析;c.損傷灶內(nèi)GFP+細(xì)胞含量定量分析;d.損傷灶內(nèi)GFP+MAP2+細(xì)胞比例定量分析;①P<0.001]

3 討論

神經(jīng)元損失是TBI導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能障礙的重要病理基礎(chǔ)[9]。來(lái)源豐富、易于提取且具有神經(jīng)分化潛能的BMSCs為T(mén)BI的自體移植細(xì)胞替代療法帶來(lái)希望[4,10]。然而,缺乏穩(wěn)定高效的神經(jīng)分化誘導(dǎo)方案是BMSCs移植治療TBI的關(guān)鍵限制因素。有研究報(bào)道,EU具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷修復(fù)的作用[5-6]。

既往研究表明,EU活性成分可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,本研究也發(fā)現(xiàn)EU提取物可以使BMSCs生長(zhǎng)和增殖代謝活性顯著提高[11]。同時(shí),當(dāng)EU提取物持續(xù)作用70 d后,原代BMSCs呈現(xiàn)確切的向神經(jīng)元分化的跡象。這一變化說(shuō)明,在EU提取物作用早期階段,BMSCs表達(dá)譜即出現(xiàn)向神經(jīng)分化發(fā)育轉(zhuǎn)變的趨勢(shì),此時(shí)BMSCs可能已具備合成分泌Ngf等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)、調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)再生微環(huán)境的潛能[12-15]。因此,本研究選取EU提取物預(yù)處理14 d、具有旺盛增殖活性并在轉(zhuǎn)錄本水平呈現(xiàn)神經(jīng)分化傾向和神經(jīng)損傷修復(fù)潛能的BMSCs作為主要移植細(xì)胞。

在體實(shí)驗(yàn)中,本研究采用了轉(zhuǎn)棒式疲勞儀和平衡木行走試驗(yàn)綜合評(píng)估一側(cè)皮層受損的TBI模型小鼠對(duì)側(cè)肢體肌力和整體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的損傷和恢復(fù)情況[16-17]。結(jié)果顯示,EU提取物預(yù)處理BMSCs治療小鼠在兩種運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)功能的改善程度明顯高于一般BMSCs移植治療小鼠。既往研究表明,損傷灶局部可能存在神經(jīng)分化再生誘導(dǎo)微環(huán)境[18-19],本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)眶內(nèi)靜脈注射移植的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源BMSCs可向TBI小鼠皮層損傷灶內(nèi)歸巢遷移,并可在損傷灶內(nèi)分化為MAP2+神經(jīng)細(xì)胞。由于未治療小鼠損傷灶內(nèi)僅存一定數(shù)量的MAP2,治療后TBI小鼠損傷灶內(nèi)MAP2+神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)可能主要依賴于移植細(xì)胞分化。相較于一般BMSCs移植治療小鼠[20-23],接受EU提取物預(yù)處理BMSCs移植治療的TBI小鼠損傷灶內(nèi)GFP+移植來(lái)源細(xì)胞明顯增多,可能與移植細(xì)胞遷移歸巢能力增強(qiáng)有關(guān),另外也有可能得益于EU提取物的神經(jīng)保護(hù)作用[24-25]。

綜上所述,EU提取物處理可促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元分化,并顯著提高BMSCs移植治療TBI的效能。本研究結(jié)果可為基于BMSCs移植的TBI細(xì)胞移植治療方案提供新思路和可靠的臨床前研究依據(jù)。EU何種活性成分發(fā)揮誘導(dǎo)BMSCs神經(jīng)分化的主導(dǎo)作用,EU預(yù)處理BMSCs移植可分化為何種遞質(zhì)類型功能性神經(jīng)元、能否完全重建神經(jīng)環(huán)路功能,仍有待進(jìn)一步研究。