李鳳，孟然然，張含智，屈穎娟，康經(jīng)武,＊

1 西安文理學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，西安市食品安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710065

2 中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，生命過(guò)程小分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

3 弈柯萊生物科技(上海)股份有限公司，上海 200241

手性是自然界的基本屬性之一。目前上市的藥物中，56%的藥物含有手性中心，其中88%的手性藥物是以外消旋物(racemate)的形式存在的。盡管手性藥物對(duì)映體具有相同的物理化學(xué)性質(zhì)，但它們?cè)谒幚怼⒍纠韺W(xué)、藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)方面卻有著明顯的差異。因此與外消旋體的藥物相比，單一構(gòu)型的手性藥物在療效和安全性方面更有優(yōu)勢(shì)[1]。如20世紀(jì)50年代著名的反應(yīng)停事件，(R)-構(gòu)型沙利度胺具有鎮(zhèn)靜及止吐作用能夠有效減緩妊娠反應(yīng)；而(S)-構(gòu)型對(duì)映體卻有較強(qiáng)的致畸作用。21世紀(jì)初的“手性轉(zhuǎn)換”政策極大地鼓勵(lì)了制藥公司發(fā)展單一手性藥物。這一政策規(guī)定，原來(lái)按消旋體形式銷售的手性藥物如果發(fā)展成單一手性化合物，就可以按新藥申報(bào)而重新獲得專利保護(hù)期限[2]。隨著單一構(gòu)型的手性藥物數(shù)量的不斷攀升，為了提高手性藥物的質(zhì)量控制水平，發(fā)展用于手性藥物的分析方法和技術(shù)具有十分重要的意義。

色譜技術(shù)是最主要的也是最重要的一類手性化合物的分析技術(shù)。在色譜技術(shù)中，高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、超臨界流體色譜(SFC)以及毛細(xì)管電泳(CE)是應(yīng)用最多的幾種技術(shù)[3–5]。HPLC技術(shù)應(yīng)用比較普遍，方法通用性強(qiáng)、精確、靈敏、快速并且可重復(fù)性好，其主要缺點(diǎn)是色譜柱昂貴并且需要消耗大量的有機(jī)溶劑。毛細(xì)管電泳是一種與HPLC互補(bǔ)的手性分離技術(shù)，特別適合可電離的高極性手性化合物的分離分析。CE具有多種分離模式，包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動(dòng)色譜(MEKC)、非水相毛細(xì)管電泳(NACE)、毛細(xì)管等速電泳(ITP)、毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦(IEF)等，大大擴(kuò)大了毛細(xì)管電泳手性分離方法的適用范圍[6–8]。相對(duì)于其他色譜技術(shù)，毛細(xì)管電泳突出的優(yōu)點(diǎn)是樣品需要量少(可以分析單細(xì)胞)、分離時(shí)間短及分離效率高。毛細(xì)管電泳在生物大分子、藥物及其代謝物、陰/陽(yáng)離子及手性化合物的分離等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的分離性能。20世紀(jì)備受關(guān)注的人類基因組計(jì)劃能夠提前完成，毛細(xì)管電泳技術(shù)做出了巨大的貢獻(xiàn)。近年來(lái)，芯片毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等新技術(shù)的不斷發(fā)展，使CE在生命科學(xué)、醫(yī)藥研究、天然產(chǎn)物及食品分析等領(lǐng)域仍有廣泛的應(yīng)用前景[9,10]。

本論文從藥物分析實(shí)驗(yàn)的角度，介紹了毛細(xì)管電泳方法測(cè)定抗膽堿類藥物格隆溴銨對(duì)映體的含量分析方法，側(cè)重點(diǎn)在于介紹毛細(xì)管電泳分析方法及手性分離機(jī)理，以及將毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用于手性藥物對(duì)映體分離分析的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

熟悉毛細(xì)管電泳儀的工作原理及基本操作；了解不同類型環(huán)糊精的理化性質(zhì)，及其作為手性選擇劑實(shí)現(xiàn)手性分離的機(jī)理；掌握毛細(xì)管電泳用于藥物格隆溴銨對(duì)映體分離的方法。

2 實(shí)驗(yàn)原理

手性化合物立體異構(gòu)體的色譜分離需要采用手性選擇劑作為手性固定相。與HPLC的手性固定相不同，毛細(xì)管電泳的手性分離是將手性選擇劑加入到緩沖溶液中，使對(duì)映體與手性選擇劑之間形成可逆的非對(duì)映的復(fù)合物，具有不同的電泳淌度從而實(shí)現(xiàn)分離。Stephen等曾提出一個(gè)理論模型來(lái)解釋毛細(xì)管電泳中實(shí)現(xiàn)手性分離的原理[11]。一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體A、B與手性選擇劑C之間可以存在以下兩個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡：

其中，μ1、μ2、μA、μB分別為游離的異構(gòu)體A、B以及異構(gòu)體與手性選擇劑C形成的復(fù)合物的電泳淌度。K1、K2分別為對(duì)映異構(gòu)體A、B與手性選擇劑C之間的結(jié)合常數(shù)。如果A、B與手性選擇劑C形成的瞬時(shí)非對(duì)映異構(gòu)體復(fù)合物穩(wěn)定常數(shù)K1、K2不同，對(duì)映體自身的電泳淌度與形成復(fù)合物的淌度也不同，將會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)異構(gòu)體的表觀電泳淌度不同(如公式1、2)。其中非對(duì)映異構(gòu)體之間的電泳淌度差越大，越易實(shí)現(xiàn)手性分離。

環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)是一類超分子主客體化合物，也是毛細(xì)管電泳中常用的手性選擇劑。它是由直鏈淀粉在芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列寡糖大環(huán)化合物[12,13]。通常CD含有6–12個(gè)D-吡喃葡萄糖單元，其中研究的較多的是含有6、7、8個(gè)葡萄糖單元的分子，分別稱為α、β、γ-環(huán)糊精(圖1)。環(huán)糊精的立體結(jié)構(gòu)近似于去頂圓錐，具有疏水的空腔及親水的外表面。其疏水的空腔可以與手性小分子或基團(tuán)發(fā)生包結(jié)作用，從而實(shí)現(xiàn)手性分離。環(huán)糊精表面存在大量羥基，通過(guò)對(duì)這些羥基進(jìn)行修飾可以得到不同類型的中性環(huán)糊精、負(fù)電環(huán)糊精以及正電環(huán)糊精。目前在手性分離中應(yīng)用較多的環(huán)糊精衍生物，包括羥丙基修飾的β-CD(HP-β-CD)、硫酸化的環(huán)糊精、磺丁基修飾的環(huán)糊精等。

圖1 α、β、γ-三種環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)圖

格隆溴銨是一種季銨類抗膽堿藥物，作為蕈毒堿受體M3拮抗劑，可以抑制乙酰膽堿與受體的相互作用[14,15]。它具有抑制胃液分泌及調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)的作用，適用于胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎、胃酸分泌過(guò)多等[16]。格隆溴銨的四級(jí)季銨鹽結(jié)構(gòu)可以限制其穿過(guò)血腦屏障，因此引起的副作用比非極性抗膽堿藥如山莨菪堿、硫酸阿托品要小的多。格隆溴銨結(jié)構(gòu)中具有兩個(gè)手性中心，因此共存在4個(gè)立體異構(gòu)體(圖2)。目前在售的格隆溴銨藥物為R,S-構(gòu)型以及S,R-構(gòu)型的混合物(優(yōu)映體，有活性的異構(gòu)體)，因此其異構(gòu)體雜質(zhì)主要包括S,S-構(gòu)型以及R,R-構(gòu)型的異構(gòu)體。

圖2 格隆溴銨及其立體異構(gòu)體的絕對(duì)構(gòu)型

本實(shí)驗(yàn)中采用以硫酸化-β-環(huán)糊精(HS-β-CD)作為手性選擇劑的毛細(xì)管電泳手性分析方法，實(shí)現(xiàn)了格隆溴銨四種立體異構(gòu)體的高效分離。研究表明，手性毛細(xì)管電泳法是測(cè)定藥物手性異構(gòu)體雜質(zhì)的有效方法。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、羥丙基-γ-環(huán)糊精(HP-γ-CD)、硫酸化-β-環(huán)糊精(HS-β-CD)以及硫酸化-γ-環(huán)糊精(HS-γ-CD)購(gòu)于Fluka公司；γ-環(huán)糊精(γ-CD)、β-環(huán)糊精(β-CD)以及α-環(huán)糊精(α-CD)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。格隆溴銨光學(xué)異構(gòu)體由中國(guó)藥品檢驗(yàn)所提供，磷酸購(gòu)于上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉購(gòu)于上海大合化學(xué)品試劑有限公司；磷酸氫二鈉購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司。所用試劑除注明外均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(Beckman Coulter,CA,USA)配有PDA檢測(cè)器，數(shù)據(jù)通過(guò)裝有32 Karat Software的惠普計(jì)算機(jī)采集；熔融石英毛細(xì)管柱(50 μm×60 cm，有效長(zhǎng)度49.5 cm，河北鑫諾科技有限公司)。

3.3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.3.1 溶液的配制

電泳運(yùn)行背景電解質(zhì)溶液用時(shí)現(xiàn)配。背景電解質(zhì)溶液為50 mmol?L-1的磷酸氫二鈉含40 mg?mL-1的HS-β-CD，最終的pH由稀釋的磷酸調(diào)至2.5。格隆溴銨用超純水配制成1 mg?mL-1的樣品溶液。

3.3.2 毛細(xì)管電泳儀的操作

優(yōu)化后的毛細(xì)管電泳儀的參數(shù)如下：進(jìn)樣方式采用壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力1.4 kPa×5 s；分離電壓-12 kV(其中C、D、E以及F分離電壓為12 kV)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。新毛細(xì)管柱在30 psi壓力條件下用0.1 mol?L-1NaOH溶液處理30 min，再分別用超純水、背景電解質(zhì)沖洗5 min。每次運(yùn)行間隔用0.1 mol?L-1NaOH、超純水、背景電解質(zhì)各沖洗5 min。

4 結(jié)果與討論

4.1 手性選擇劑的比較

實(shí)驗(yàn)嘗試了多種環(huán)糊精及其衍生物，包括5種中性的環(huán)糊精、2種帶負(fù)電的環(huán)糊精HS-β-CD和HSγ-CD作為手性選擇劑用于分離4個(gè)格隆溴銨立體異構(gòu)體。發(fā)現(xiàn)只有HS-β-CD和HS-γ-CD可以使4個(gè)立體異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)完全的基線分離(圖3)。雖然這兩種環(huán)糊精具有相近的分離選擇性，但是各異構(gòu)體的出峰順序不同?？紤]到HS-γ-CD的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HS-β-CD，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中我們選擇了HS-β-CD作為手性選擇劑，對(duì)毛細(xì)管電泳的分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。

圖3 不同類型環(huán)糊精作為手性選擇劑時(shí)的分離選擇性比較

4.2 毛細(xì)管電泳分離條件的優(yōu)化

我們首先考察了手性選擇劑HS-β-CD濃度對(duì)格隆溴銨異構(gòu)體分離的影響。從圖4中可以看出隨著HS-β-CD濃度的增加，分離度逐漸提高，同時(shí)各異構(gòu)體的遷移時(shí)間也相應(yīng)縮短。由于HS-β-CD帶有較多的負(fù)電荷，當(dāng)它的濃度過(guò)大時(shí)會(huì)導(dǎo)致電流大大增加，使基線波動(dòng)較大。因此，綜合考慮分離度和分析時(shí)間的影響，我們選擇最終環(huán)糊精的濃度為40 mg?mL-1。接下來(lái)，我們對(duì)背景電解質(zhì)緩沖鹽磷酸氫二鈉的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。我們發(fā)現(xiàn)隨磷酸氫二鈉濃度的增加，分離度略有提高(圖5)。但是當(dāng)濃度增加時(shí)溶液的粘度也會(huì)增加，導(dǎo)致化合物的電泳淌度減小，遷移時(shí)間延長(zhǎng)。因此，磷酸氫二鈉的濃度也不宜過(guò)高。綜合分析，選擇最終磷酸氫二鈉的濃度為50 mmol?L-1。

圖4 環(huán)糊精濃度對(duì)分離度(A)和遷移時(shí)間(B)的影響

圖5 磷酸氫二鈉濃度對(duì)分離度(A)和遷移時(shí)間(B)的影響

背景電解質(zhì)溶液的pH也是毛細(xì)管電泳分離中一個(gè)非常重要的參數(shù)，它不僅會(huì)影響溶液的電滲流，同時(shí)也會(huì)影響帶電化合物的解離狀態(tài)。如圖6所示，當(dāng)pH小于3.0時(shí)，無(wú)論各異構(gòu)體的分離度還是遷移時(shí)間變化均不大；當(dāng)pH超過(guò)3.0時(shí)，分離度就會(huì)顯著降低同時(shí)遷移時(shí)間開(kāi)始延長(zhǎng)，因此最終我們選擇pH為2.5。分離電壓和柱溫對(duì)分離的影響我們同樣進(jìn)行了考察。分離電壓的增大會(huì)縮短遷移時(shí)間，然而電壓增大而產(chǎn)生的焦耳熱又會(huì)導(dǎo)致分離度的降低。同樣，柱溫的升高也會(huì)導(dǎo)致遷移時(shí)間的縮短以及焦耳熱的產(chǎn)生進(jìn)而影響基線噪聲。并且當(dāng)柱溫過(guò)高時(shí)，手性化合物與環(huán)糊精的手性識(shí)別可能會(huì)受到影響，因而我們并不建議在過(guò)高的柱溫下進(jìn)行分離。

圖6 緩沖溶液pH對(duì)分離度(A)和遷移時(shí)間(B)的影響

綜合考慮分離度和遷移時(shí)間，我們選擇-12 kV的分離電壓和20 °C的柱溫。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的毛細(xì)管電泳分離圖如圖7所示，可以看出各異構(gòu)體完全實(shí)現(xiàn)了基線分離。實(shí)驗(yàn)條件：背景電解質(zhì)為50 mmol?L-1的磷酸氫二鈉(調(diào)至pH 2.5)含40 mg?mL-1的HS-β-CD；柱溫20 °C，-12 kV的分離電壓；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；峰1：Glycopyrrolate(R,S)，峰2：雜質(zhì)A(S,S)，峰3：Enantiomer(S,R)，峰4：雜質(zhì)B(R,R)

圖7 格隆溴銨及其立體異構(gòu)體的電泳分離圖

4.3 毛細(xì)管電泳分離條件的驗(yàn)證

在優(yōu)化的條件下，考察了該方法的線性范圍、精密度、定量限以及檢測(cè)限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。方法的檢測(cè)限為0.005 mg?mL-1，定量限為0.015 mg?mL-1，線性范圍為0.015–2.0 mg?mL-1。方法的精密度主要從峰面積以及遷移時(shí)間的重復(fù)性來(lái)考察。峰面積日內(nèi)重復(fù)性6.92%–10.77%，日間重復(fù)性0.63%–11.69%。遷移時(shí)間日內(nèi)重復(fù)性0.03%–0.16%，日間重復(fù)性1.60%–1.84%。該方法具有較好的重復(fù)性，能夠滿足日常藥物分析的需要。

表1 方法確證數(shù)據(jù)

5 數(shù)據(jù)處理

5.1 記錄毛細(xì)管電泳分離條件

包括：儀器型號(hào)、柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑、進(jìn)樣方式、進(jìn)樣量、溫度、分離電壓、檢測(cè)波長(zhǎng)等。

5.2 定性分析

分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，讀取保留時(shí)間。

5.3 定量分析

采用歸一化或標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法。

6 注意事項(xiàng)

電極和毛細(xì)管柱不能接觸，樣品溶液的樣品瓶與緩沖溶液的液面要保持平衡。每次分析前毛細(xì)管柱需要進(jìn)行沖洗和平衡，溫度的變化也會(huì)影響分離結(jié)果，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)的可靠性和重現(xiàn)性特別重要。

7 實(shí)驗(yàn)組織

本實(shí)驗(yàn)共用時(shí)4–6 h，在平衡毛細(xì)管柱期間，可以穿插講授和討論藥典四部通則中0542毛細(xì)管電泳法、學(xué)習(xí)毛細(xì)管電泳儀的使用方法以及配制標(biāo)準(zhǔn)溶液等。同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)性試驗(yàn)的考察，學(xué)生分組計(jì)算和討論重復(fù)性(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD)、毛細(xì)管理論板數(shù)(n)、分離度(R)、拖尾因子(T)、線性范圍、檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)等。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)展過(guò)程中涉及到毛細(xì)管電泳儀的使用及手性分離技術(shù)，建議本實(shí)驗(yàn)向大學(xué)二年級(jí)下學(xué)期或三年級(jí)上學(xué)期的學(xué)生開(kāi)設(shè)。該實(shí)驗(yàn)的考核內(nèi)容由預(yù)習(xí)報(bào)告、課堂表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)報(bào)告組成，各部分占比分別為20%、20%、30%和30%。

8 結(jié)語(yǔ)

藥物分析是一門(mén)發(fā)展藥物分析方法、研究藥物質(zhì)量規(guī)律的科學(xué)。而藥品質(zhì)量直接影響藥品的安全性和有效性，與人類健康與生命安全密切相關(guān)。而以“反應(yīng)?！笔录榇淼氖中运幬锇踩絹?lái)受到重視，將本實(shí)驗(yàn)引入教學(xué)中，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，啟發(fā)學(xué)生思考，增強(qiáng)學(xué)生的專業(yè)責(zé)任感和認(rèn)同感。同時(shí)，也提升了教學(xué)的學(xué)術(shù)深度，有助于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和綜合實(shí)踐能力。