豆小衛(wèi) 田彩虹 耿娜 梁曉莉 李惠

(1.陜西馮武臣大藥堂有限公司,陜西 咸陽(yáng) 712000;2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司,陜西 咸陽(yáng) 712000)

乳香為橄欖科植物乳香樹(shù)及同屬植物的樹(shù)干切口中滲出的堅(jiān)硬膠狀樹(shù)脂。分為索馬里乳香和埃塞俄比亞乳香[1]。辛、苦、溫,歸心、肝、脾經(jīng),具有活血行氣止痛,消腫生肌之功效。主要用于痛經(jīng)、經(jīng)閉、胃痛、心腹諸痛、風(fēng)濕痹痛;跌打傷痛、癰疽腫痛、腸癰;瘡瘍腫痛或潰久不收口等[2-7]。在院方和成方制劑中應(yīng)用廣泛[8-10],而且為進(jìn)口名貴藥材。近年來(lái),特別是進(jìn)口名貴藥材的摻假比較普遍[11-15],質(zhì)量控制尤為重要。在2020年版《中國(guó)藥典》一部中乳香藥材的含量測(cè)定為揮發(fā)油測(cè)定。此方法專屬性不強(qiáng),可能給企業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失和失信風(fēng)險(xiǎn)。而且現(xiàn)有含量測(cè)定文獻(xiàn)不多,大多基于揮發(fā)油研究,個(gè)別僅針對(duì)一種成分,不夠科學(xué)[16-20]。因此,為了解決這一問(wèn)題,對(duì)乳香藥材的代表性成分[21-27]進(jìn)行分析研究,建立代表性成分乳香酸多組分含量測(cè)定的高效液相色譜法,為乳香藥材質(zhì)量控制和用藥安全提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器),UV 2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司),MSA6.6S-OCE百萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司),KQ-500VDE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司),數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2試劑與試藥 對(duì)照品α-乳香酸(批號(hào)M14GB14667,純度99.3%)、β-乳香酸(批號(hào)M14GB14668,純度98.4746%)、11-羰基-β-乙酰乳香酸(批號(hào)111760-201502,純度99.3%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純(賽默飛世爾科技公司),其余試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),3批乳香藥材(批號(hào)0216321002、0216321003、0216321004)均購(gòu)自陜西地道藥材有限公司。

2 方法

2.1系統(tǒng)色譜條件 采用Agilent1260-C8(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,柱溫35 ℃,乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相,80∶20(測(cè)定α-乳香酸,β-乳香酸;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm),70∶30(測(cè)定11-羰基-β-乙酰乳香酸;檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm),流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量10 μL。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 分別取α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品適量,精密稱定,分別加甲醇溶液制成42.34 μg·mL-1、50.81 μg·mL-1、41.15 μg·mL-1的對(duì)照溶液。

2.2.2供試品溶液制備 取各批乳香藥材適量,分別研細(xì)混勻的粉末過(guò)4號(hào)篩,取0.2 g精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,超聲處理30 min,過(guò)濾,即得。

2.2.3陰性樣品溶液制備 取桃膠適量,按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

3 結(jié)果

3.1方法學(xué)考察

3.1.1專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液,按系統(tǒng)色譜條件分別進(jìn)樣10 μL,結(jié)果見(jiàn)圖1。α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品與樣品相同保留時(shí)間峰重合,陰性樣品在對(duì)照品峰和樣品峰相同保留時(shí)間無(wú)干擾峰。檢測(cè)峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5,理論塔板數(shù)大于10000。說(shuō)明該方法專屬性強(qiáng),系統(tǒng)適用性好。

A.對(duì)照品1;B.對(duì)照品2;C.樣品1;D.樣品2;E.陰性樣品;Ⅰ.α-乳香酸;Ⅱ.β-乳香酸;Ⅲ.11-羰基-β-乙酰乳香酸

3.1.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品溶液各2、5、10、15、20、25 μL,分別注入高效液相色譜儀中,按確定的色譜條件測(cè)定各對(duì)照品的峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X,色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1,可知各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

3.1.3精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液分別按對(duì)應(yīng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸的峰面積RSD(n=6)分別為0.31%、0.29%、0.35%,表明儀器具有良好的精密度。

3.1.4重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取供試品0.2 g,平行制備6份,按供試品溶液制備方法制備,分別測(cè)定含量。結(jié)果α-乳香酸平均含量為2.15%,RSD為1.81%;β-乳香酸平均含量為3.94%,RSD為2.47%;11-羰基-β-乙酰乳香酸平均含量為3.33%,RSD為2.26%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào):20210102)分別于室溫下放置0、2、8、16、24 h按系統(tǒng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定、記錄峰面積,結(jié)果α-乳香酸含量為2.21%,RSD為1.32%,β-乳香酸含量為3.94%,RSD為0.73%,11-羰基-β-乙酰乳香酸含量為3.36%,RSD為1.83%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.6加樣回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下已知平均含量(α-乳香酸:10.24 mg·g-1、β-乳香酸:35.24 mg·g-1、11-羰基-β-乙酰乳香酸31.32 mg·g-1)的樣品0.1 g精密稱定,按對(duì)照品含量1∶1,精密加入稱定的對(duì)照品,按供試品溶液方法制備6份,測(cè)定含量。計(jì)算各成分的平均回收率和RSD。結(jié)果α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸的平均回收率(n=6)分別為94.76%,RSD為1.61%;99.40%,RSD為0.84%;100.55%,RSD為1.30%。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

3.2樣品測(cè)定 取3批乳香藥材樣品,按供試品溶液方法制品,在系統(tǒng)色譜條件下測(cè)定,依據(jù)線性方程計(jì)算樣品中α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1)

4 討論

4.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將對(duì)照品溶液及供試品溶液分別置于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中,從200～450 nm波段進(jìn)行全波段掃描,考慮到末端吸收和排除其他干擾,為獲得理想的色譜效果,最終確定α-乳香酸和β-乳香酸的檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;11-羰基-β-乙酰乳香酸的檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

4.2色譜條件的選擇 通過(guò)參考文獻(xiàn)[28],流動(dòng)相選擇酚酸類成分常用比較理想的相系乙腈:0.1%磷酸溶液。為了簡(jiǎn)化試驗(yàn)流動(dòng)相比例選擇了20∶80和30∶70兩個(gè)比例分別測(cè)定。此法雖然簡(jiǎn)便一些,但也可以進(jìn)一步完善成梯度洗脫。經(jīng)考察0～15 min(20∶80),16～35 min(30∶70)較為理想。

4.3供試品溶液制備方法 采用加熱回流和超聲提取方式,設(shè)計(jì)0.5 h、1 h、2 h分別考察,結(jié)果兩種方式?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為了簡(jiǎn)便安全,最終確定供試品溶液的制備方法。

通過(guò)試驗(yàn)本文確立了高效液相法對(duì)乳香藥材中乳香酸多組分的含量測(cè)定方法,彌補(bǔ)了現(xiàn)行藥典的不足,能客觀地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。說(shuō)明該方法簡(jiǎn)便、可行、專屬性強(qiáng)。為乳香藥材優(yōu)劣判定提供科學(xué)的依據(jù)。