白璐 惠志立 崔春利 史亞軍 劉紅波 劉航 劉文豪

(1.西安市第一醫(yī)院,陜西 西安 710002;2.西安醫(yī)心演繹醫(yī)療科技有限公司,陜西 西安 710301;3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 712046;4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

以水煎服的中藥湯劑,是中醫(yī)臨床用藥的主要形式,也充分體現(xiàn)出中藥水提液臨床應(yīng)用的普遍性與重要性?！叭芤涵h(huán)境”是指溶液體系所具有的黏度、pH、離子強(qiáng)度、電解質(zhì)成分等特征性質(zhì)[1-2]。中藥水提液因?yàn)槿苊剿?、極性大、溶出成分多樣,使得水提液環(huán)境復(fù)雜。正如雙黃連口服液在提取過程中,不僅提取出了對(duì)疾病有治療作用的有效成分,如黃芩苷、綠原酸等;一些易溶于水的雜質(zhì)和無效成分也隨之被提取出來,如多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。為了確保藥物有效成分的溶出度,提高藥物療效,水提醇沉法[3-4]、微濾法[5-11]、絮凝法[12-15]、高速離心法[16-17]均在中藥水提液精制中被探索研究。本文以雙黃連口服水提液為實(shí)驗(yàn)體系,基于“溶液環(huán)境”與藥物有效成分密切關(guān)系,通過研究雙黃連口服液三種不同精制工藝,比較其物化參數(shù)、指標(biāo)性成分黃芩苷的含量和其大分子去除率,從而得出雙黃連口服液的最佳精制工藝,以期為復(fù)雜“溶液環(huán)境”的中藥水提液的精制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);UPR系列超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司);Agilent 1260高效液相色譜(美國);實(shí)驗(yàn)室用LNG-CM-101膜分離機(jī)(上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司);DDS-307電導(dǎo)率儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PHSJ-4F實(shí)驗(yàn)室用pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);DV-I+黏度計(jì)(美國BROOKFIELD公司);WGZ-3.3A濁度計(jì)(上海昕瑞儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 黃芩、金銀花和連翹3味藥材飲片均購自西安興盛德中藥飲片有限責(zé)任公司,經(jīng)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定均符合《中國藥典》2020年版一部規(guī)定。黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào):110715-201318)來源于中國食品藥品檢定研究院。牛血清白蛋白(BSA);考馬斯亮藍(lán)G-250;甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1雙黃連口服液水提液的制備 按處方比例,分別取金銀花375 g,黃芩375 g,連翹750 g,稱取各味藥的1/15。黃芩煎煮3次,第一次加入14倍水,煎煮2 h;第二次加12倍水,煎煮1 h;第三次加12倍水煎煮1 h。分別用四層紗布濾過,合并濾液。金銀花、連翹先溫浸30 min,煎煮兩次,第一次14倍水,煎煮1.5 h;第二次12倍水,煎煮1.5 h。四層紗布濾過,合并濾液。將兩次濾液合并,調(diào)整成濃度為0.04 g·mL-1(以生藥量計(jì),下同)的水提液,待用。

2.2精制操作工藝

2.2.1微濾法 取雙黃連水提液500 mL,過孔徑為0.08 μm的無機(jī)陶瓷膜,收集濾液,調(diào)整成0.04 g·mL-1,待用。

2.2.2醇沉法 取1 L雙黃連水提液平均分成四等份,不斷攪拌并緩慢加入250 mL、375 mL、583 mL、1000 mL的95%分析乙醇(慢加快攪),分別使含醇量達(dá)到50%、60%、70%、80%,靜置24 h,濾過,揮至無醇味后,調(diào)整成0.04生藥g·mL-1,待用。

2.2.3絮凝法 取三等份雙黃連水提液,每份500 mL,加入配置好的殼聚糖絮凝液,使殼聚糖含量達(dá)10%、20%、30%,靜置24 h,濾過,揮至無酸味后,調(diào)整成0.04生藥g·mL-1,待用。

2.3物化參數(shù)的測(cè)定 分別取雙黃連口服液水提液及精制液適量,均通過恒溫水浴恒溫至25 ℃,分別以已校正精密pH計(jì)測(cè)定pH值;以電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率值;以濁度計(jì)測(cè)定濁度;依據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則0633黏度測(cè)定法第三法中(3)轉(zhuǎn)子型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)以BROOKFIELD黏度計(jì)測(cè)定水提液及各純化法所得精制液流體的相對(duì)黏度。

2.4高分子物質(zhì)的測(cè)定 分取2.1項(xiàng)下雙黃連口服液水提液及2.2項(xiàng)下各精制液適量,采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[18];采用《中國藥典》2020年版四部通則2202鞣質(zhì)含量測(cè)定法測(cè)定鞣質(zhì)含量[19];采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定酶解前的還原糖量及酶水解和酸水解后還原糖量,依據(jù)公式計(jì)算:淀粉含量=酶水解和酸水解后還原糖量-酶解前的還原糖量[20];果膠含量測(cè)定利用果膠酸鈣不溶于水的特性,向含果膠溶液中加入沉淀劑,使果膠形成果膠酸鈣沉淀,測(cè)定果膠酸鈣量并換算成果膠量[21]。

2.5黃芩苷含量測(cè)定[22-25]

2.5.1色譜條件 以十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑;甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.1)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長為280 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.5.2對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含0.064 mg黃芩苷的溶液,即得。

2.5.3供試品溶液的制備 分別取各方法精制樣液25 mL,搖勻,精密吸取1 mL,置于50 mL量瓶中,加70%乙醇約45 mL,超聲處理30 min,放至室溫,加70%乙醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,精密量取5 mL,加甲醇稀釋至10 mL,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,備用。

2.6相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析方法 采用R語言3.4.3軟件和IBM SPSS Statistics 19.0軟件分別進(jìn)行性分析,分別對(duì)pH、濁度、黏度、電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)含量、鞣質(zhì)含量、淀粉含量、果膠含量及黃芩苷含量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。R語言構(gòu)建目標(biāo)數(shù)據(jù)集,然后批量求解,*表示P<0.1,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

3 結(jié)果

3.1物化參數(shù)測(cè)定 結(jié)果與原液相比較,唯獨(dú)微濾液pH顯著上升,醇沉液的pH隨著加入醇量的增大變化不明顯,絮凝液的pH隨著絮凝劑濃度變化,其中20%絮凝液的pH最大,30%絮凝液次之;濁度微濾液的濁度顯著下降,醇沉液的濁度隨著醇量的增多先減小后增大,其中60%醇沉液濁度下降最多,隨絮凝液濃度增大濁度增加,10%絮凝液濁度最小;三種精制液的黏度變化不大,微濾液的黏度下降最為明顯,醇沉液的黏度基本隨加入醇量的增大而增大;電導(dǎo)率與原液相比較,微濾液的電導(dǎo)率下降最明顯,醇沉液的電導(dǎo)率隨加入醇量的增多而減小,絮凝液的電導(dǎo)率隨加入絮凝劑的增多而增大。結(jié)果見表1。

表1 物化參數(shù)測(cè)定結(jié)果

3.2高分子測(cè)定結(jié)果 通過數(shù)據(jù)比較分析,從四種高分子去除總體70%醇沉液>微濾液>50%醇沉液>80%醇沉液>10%絮凝液>30%絮凝液>60%醇沉液>20%絮凝液,結(jié)果見表2。

表2 高分子含量測(cè)定結(jié)果

3.3黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

3.3.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取3.4.1對(duì)照品溶液2、4、6、8、10μL注入高效液相色譜儀,按選定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖及峰面積。以峰面積的積分值定量,以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行回歸分析,黃芩苷的回歸方程為:Y=301.1X+27.678,r=0.9997。結(jié)果表明,黃芩苷的進(jìn)樣量在0.128～0.64 mg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 mL,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)得黃芩苷峰面積積分值的RSD值為0.38%,結(jié)果表明該儀器精密度良好。

3.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液,依法分別于0、2、4、6、8、12 h測(cè)定,測(cè)得黃芩苷峰面積積分值的RSD值為1.99%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取微濾液5份,分別按2.5.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成5份供試品溶液,以2.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)得黃芩苷質(zhì)量濃度分別為1.145、1.138、1.147、1.135、1.142 mg·mL-1,RSD值為0.43%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.5回收率實(shí)驗(yàn) 取微濾液10 mL,6份,分別加入一定量的黃芩苷對(duì)照品,按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,按上述色譜條件及測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率,平均回收率為96.51%,RSD值為1.42%。表明黃芩苷回收率良好,結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=6)

3.3.6樣品含量測(cè)定 分別取供試品溶液,進(jìn)樣10 μL,在給定的色譜條件下,測(cè)定黃芩苷的峰面積,由對(duì)應(yīng)的線性方程計(jì)算其含量,結(jié)果見表4。

表4 黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

由表4結(jié)果顯示,膜過濾液黃芩苷含量略有下降,可能是過濾時(shí)黃芩苷隨雜質(zhì)一起被濾過所致;醇沉液黃芩苷含量反而略有上升,這可能與黃芩苷的溶解度密切相關(guān),表明黃芩苷在50%～80%的醇液中溶解度會(huì)增大,其中50%醇沉液黃芩苷含量最高,60%醇沉液、70%醇沉液、80%醇沉液的黃芩苷含量相近。絮凝液黃芩苷含量大幅下降,其中20%絮凝液黃芩苷含量較10%絮凝液、30%絮凝液高。由此可見,對(duì)于雙黃連口服液最不理想的精制方法為絮凝法。

3.6相關(guān)性分析結(jié)果

3.6.1不同精制工藝“高分子含量-物化參數(shù)”“物化參數(shù)之間”“高分子含量之間”相關(guān)性分析結(jié)果 通過分析,物化參數(shù)與高分子含量之間均沒有相關(guān)性。物化參數(shù)之間結(jié)果顯示:pH與濁度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);pH與電導(dǎo)率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);濁度與電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。高分子之間相關(guān)結(jié)果顯示:蛋白質(zhì)含量與淀粉含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)。見圖1。

注:圖中方框中數(shù)字表示兩個(gè)比較樣本相關(guān)值;*表示顯著程度(*P<0.05,***P<0.001);Turbidity表示濁度;Viscosity表示黏度;EL為 electrical conductivity縮寫,表示電導(dǎo)率;Protein表示蛋白質(zhì);Tannins表示鞣質(zhì);Starch表示淀粉;Pectin表示果膠

3.6.2不同精制工藝“黃芩苷含量-物化參數(shù)”相關(guān)性分析結(jié)果 相關(guān)性結(jié)果顯示:pH與黃芩苷含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05);濁度與黃芩苷含量呈負(fù)相關(guān)(P<0.1),黏度與黃芩苷含量沒有相關(guān)性;電導(dǎo)率與黃芩苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖2。

注:圖中方框中數(shù)字表示兩個(gè)比較樣本相關(guān)值;*與#表示顯著程度(*P<0.05,#P<0.1);Turbidity表示濁度;Viscosity表示黏度;EL為 electrical conductivity縮寫,表示電導(dǎo)率;Baicalin表示黃芩苷

3.6.3不同精制工藝“黃芩苷含量-高分子含量”相關(guān)性分析結(jié)果 高分子含量中僅鞣質(zhì)含量與黃芩苷含量呈顯著相關(guān)(*P<0.05),蛋白質(zhì)含量、淀粉含量、果膠含量均與黃芩苷含量沒有相關(guān)性。見圖3。

注:圖中方框中數(shù)字表示兩個(gè)比較樣本相關(guān)值;*表示顯著程度(*P<0.05);Protein表示蛋白質(zhì);Tannins表示鞣質(zhì);Starch表示淀粉;Pectin表示果膠

從以上相關(guān)性結(jié)果可以看出,采用不同精制工藝測(cè)得的黃芩苷含量與pH、鞣質(zhì)含量呈正相關(guān);與濁度、電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)。相關(guān)性較好,說明不同精制工藝對(duì)雙黃連口服液有效成分黃芩苷含量有顯著影響。

4 討論

中藥復(fù)方水提液是一個(gè)極其復(fù)雜的化學(xué)體系,對(duì)水提液精制方法應(yīng)建立在能去除雜質(zhì),最大程度的保留有效成分,同時(shí)還要考慮其經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性?；谥兴帍?fù)方水提液的特點(diǎn),膜分離技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用彰顯優(yōu)勢(shì)。郭立瑋等[26]在20多年前分析論證了21世紀(jì)中藥植物藥深加工與現(xiàn)代膜分離技術(shù)相結(jié)合的研究開發(fā)思路,之后很多研究者開展了符合國際規(guī)范的中藥或復(fù)方的膜分離技術(shù)探究。孫立霞等[27]采用KBT-ZTC絮凝澄清法、酶解法、微濾法、酶解-微濾法及絮凝澄清-微濾法澄清參玉口服液,研究結(jié)果證實(shí)絮凝澄清-微濾法為最佳方法。高紅寧等[28]通過比較分析枳實(shí)、苦參和金銀花澄清前后固形物、性狀、膜通量、指標(biāo)成分等指標(biāo),研究證實(shí)微濾法對(duì)中藥水提液起到較好的澄清除雜效果。不僅如此,微濾法也被應(yīng)用到中藥揮發(fā)油的分離,韓志峰[29]以常見的九種含油水體進(jìn)行優(yōu)化探究,旨在推進(jìn)微濾在揮發(fā)油淋領(lǐng)域的應(yīng)用。朱華旭等[30]探討了膜分離技術(shù)在中藥廢棄物有效組分資源化的原理、方法與應(yīng)用實(shí)踐,比較系統(tǒng)描述了膜技術(shù)在中藥廢棄物的提取、分離、濃縮、純化工程的應(yīng)用前景,論述了膜技術(shù)在中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程中的適宜性和可行性。

本文以雙黃連口服液為例,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,采用醇沉法略高保留了有效成分,但其存在耗醇量大、乙醇回收率低、耗能大、醇沉后的藥液進(jìn)行濃縮相對(duì)較慢、成本較高、危險(xiǎn)性較大的缺點(diǎn)。絮凝法中絮凝劑在凝結(jié)過程中不僅去除了雜質(zhì),還去除了一些小分子有效成分,導(dǎo)致其有效成分大幅含量降低。膜過濾法其有效成分含量介于醇沉法和絮凝法之間,但物化參數(shù)結(jié)果顯示膜過濾法能更大程度的去除雜質(zhì),保證藥液澄明度和穩(wěn)定性。綜合考慮,膜微濾法應(yīng)用于中藥復(fù)方水提液的精制效果最佳。

雙黃連口服液不同精制工藝研究中,從相關(guān)分析性結(jié)果看,在物化參數(shù)相關(guān)性結(jié)果中提示pH值濁度、電導(dǎo)率測(cè)定具有較大意義,而黏度測(cè)定意義不大。高分子含量相關(guān)性分析結(jié)果提示,鞣質(zhì)測(cè)定對(duì)處方中黃芩苷含量具有顯著影響,果膠測(cè)定意義不大,處方中蛋白質(zhì)含量與淀粉含量具極顯著正相關(guān)性,今后評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)予以重點(diǎn)關(guān)注。