王若亞 張鴛 張繼虹 俞飛

（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

p53蛋白是由TP53基因編碼的53 ku蛋白，與p63蛋白和p73蛋白同屬于p53樣轉(zhuǎn)錄因子家族，其活性對(duì)于預(yù)防腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要［1］。自1979年p53蛋白首次以癌蛋白抗原被報(bào)道以來，經(jīng)過40多年的研究，人們不僅重新發(fā)現(xiàn)了p53蛋白的抑癌功能，而且認(rèn)識(shí)到TP53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)度最高的基因。p53蛋白在生物體內(nèi)可以暫停細(xì)胞周期進(jìn)程，啟動(dòng)分子應(yīng)答機(jī)制對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，并參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等多種途徑［2-3］。同時(shí)，野生型p53蛋白調(diào)控著生物三大物質(zhì)的代謝［4］，通過限制細(xì)胞核酸物質(zhì)的合成與對(duì)葡萄糖的攝取等作用抑制細(xì)胞生長?？傊?，p53蛋白可以看作是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)復(fù)雜而龐大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐，在使細(xì)胞能夠各司其職發(fā)揮正常功能方面起著重要的作用。在無應(yīng)激的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，p53蛋白通過不斷的泛素化和26S蛋白酶體系的降解維持在較低水平，在應(yīng)激狀態(tài)下，p53蛋白可經(jīng)過一系列如磷酸化、乙?；⒓谆鹊鞍踪|(zhì)加工過程后被激活［5-6］。

正因?yàn)閜53蛋白有著難以取代的重要作用，因此它一旦發(fā)生突變對(duì)細(xì)胞正常功能的影響是巨大的。突變后的p53蛋白不僅會(huì)喪失原本抑癌功能，同時(shí)還會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7-8］。研究表明，約50%的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了突變p53蛋白，其主要突變類型為錯(cuò)義突變?？茖W(xué)家們嘗試了多種靶向突變p53蛋白治療癌癥的策略，目前以恢復(fù)突變p53蛋白野生型構(gòu)象及MDM2與p53蛋白相互作用抑制劑為代表的藥物研究取得了較大突破。

1 p53蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 p53蛋白的結(jié)構(gòu)

p53蛋白在人體內(nèi)以四聚體的形式發(fā)揮作用，單體間通過反向α螺旋和反向β折疊相互作用形成二聚體，二聚體借助平行的螺旋-螺旋接觸面形成四聚體，其結(jié)構(gòu)類似一個(gè)十字架。每個(gè)單體由393個(gè)氨基酸殘基組成，從N端到C端依次可分為反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD）（1~61）、富脯氨酸結(jié)構(gòu)域（PXXP）（62~94）、DNA結(jié)合域（DBD）（95~292）、低聚結(jié)構(gòu)域（OD）（326~356）、羧基端結(jié)構(gòu)域（CRD）（357~393）［9］（圖1）。TAD區(qū)包含TAD1（1~40）和TAD2（41~61），介導(dǎo)p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。TAD1和TAD2不僅可以共同調(diào)節(jié)一些常見基因的轉(zhuǎn)錄，也可以相互獨(dú)立介導(dǎo)不同基因的反式激活［10］。此外，p53蛋白N端還包含泛素連接酶MDM2的結(jié)合位點(diǎn)，MDM2可以與p53蛋白相結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行泛素化標(biāo)記，進(jìn)而使p53蛋白被蛋白酶體降解。富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域（62~94）以PXXP序列重復(fù)多次（P，脯氨酸；X可以是任何氨基酸），該區(qū)域與p53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和生長抑制有關(guān)。DBD可以與DNA進(jìn)行序列特異性結(jié)合（95~292），它包含1個(gè)中央樣免疫球蛋白β夾層支架、環(huán)狀片螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)大環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該區(qū)域在整個(gè)進(jìn)化過程中高度保守，大約80%的TP53基因突變都發(fā)生在該區(qū)域。DBD后面是連接區(qū)域（293~325）以及OD（326~356），其中OD是p53蛋白四聚體化從而發(fā)揮功能所必需的，此外OD還包含一個(gè)核輸出信號(hào)序列。CRD（357~393）是高度非結(jié)構(gòu)化的，涉及多個(gè)不同的作用，如DNA結(jié)合、賦予蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、輔助因子招募等［9］。

Fig. 1 Schematic diagram of p53 protein structure圖1 p53蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 p53蛋白的功能

p53蛋白是人體內(nèi)十分重要的抑癌轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，細(xì)胞中的p53蛋白維持在一個(gè)較低的水平，這主要是由體內(nèi)E3泛素連接酶MDM2介導(dǎo)完成的。p53蛋白與MDM2形成的反饋調(diào)節(jié)通路［11］，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的半衰期為6~20 min。各種各樣的細(xì)胞應(yīng)激如DNA損傷、端粒侵蝕、代謝改變、缺氧、有絲分裂紡錘體功能異常以及幾種不同的致癌基因如Ras、Myc和Ets的突變激活等均可以引起機(jī)體針對(duì)MDM2和p53蛋白的修飾，這些修飾抑制了MDM2的活性，導(dǎo)致p53蛋白水平升高并激活，啟動(dòng)了一系列不同的轉(zhuǎn)錄程序［12］。每一種應(yīng)激壓力都由一組不同的蛋白質(zhì)檢測(cè)，這些蛋白質(zhì)向MDM2和/或p53蛋白發(fā)出信號(hào)并對(duì)其進(jìn)行修飾。根據(jù)修飾（磷酸化、乙?；?、甲基化等）和細(xì)胞類型（如分化狀態(tài)、細(xì)胞是否轉(zhuǎn)化或正常、細(xì)胞是否正在分裂或休眠），啟動(dòng)一個(gè)p53蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路（圖2）。

Fig. 2 Function of p53 protein圖2 p53蛋白的功能

激活狀態(tài)下的p53蛋白通過與DNA序列（稱為p53反應(yīng)元件或p53結(jié)合位點(diǎn)）特異性結(jié)合誘導(dǎo)下游靶基因p21、PUMA、NOXA的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、衰老、細(xì)胞周期阻滯、代謝改變、血管生成等多種作用，此外p53蛋白并非所有功能都是通過充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子來實(shí)現(xiàn)的，比如細(xì)胞質(zhì)中（尤其是定位于線粒體）的p53蛋白也參與調(diào)節(jié)糖酵解、氧化磷酸化、活性氧和自噬等［13］。除了直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝外，p53蛋白還可以通過影響腫瘤微環(huán)境抑制腫瘤的發(fā)生，其中很重要的一點(diǎn)是調(diào)節(jié)微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，目前大量證據(jù)表明，p53蛋白可以影響免疫系統(tǒng)功能，通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的代謝活動(dòng)進(jìn)而影響腫瘤發(fā)展［14］。

2 p53蛋白主要突變類型與特征

自從在人類結(jié)腸癌中首次發(fā)現(xiàn)TP53突變基因以來，大量DNA測(cè)序項(xiàng)目已經(jīng)檢測(cè)了所有人類癌癥中TP53基因的突變頻率?？偟膩碚f，TP53基因突變的頻率通常取決于癌癥的類型［15-16］，睪丸畸形癌中突變最少（1%~3%），漿液性卵巢癌中突變最多（100%）。組織和細(xì)胞類型都影響TP53基因突變的頻率，多種突變類型導(dǎo)致p53蛋白原本功能的喪失。在整個(gè)TP53基因突變類型中，缺失、插入、移碼和無義突變的發(fā)生率為10%，大多數(shù)情況下導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能產(chǎn)生或迅速被降解。其余90%的突變類型為錯(cuò)義突變［17］，在這些突變中，90%定位于DBD，其中175、245、248、249、273和282氨基酸位點(diǎn)是其熱點(diǎn)突變［18］，p53R175H與p53R273H分別為p53蛋白錯(cuò)義突變的第一和第三大類型，其β片層結(jié)構(gòu)都被很好地保存了下來，疏水表面變大，環(huán)的靈活性變高，從而易于在細(xì)胞內(nèi)積聚［19］。其次作為p53蛋白第二大錯(cuò)義突變類型的p53R248Q，熱穩(wěn)定性較低，可通過與STAT3結(jié)合并使其磷酸化，從而持續(xù)激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移［20］。事實(shí)上與野生型p53蛋白相比，大多數(shù)突變p53蛋白除喪失與DNA結(jié)合及調(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力最終導(dǎo)致抑癌功能喪失外，還會(huì)獲得新的致癌活性以促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，稱為功能獲得性效應(yīng)（gain of function，GOF），突變p53蛋白的GOF活性在1993年首次得到證實(shí)，當(dāng)時(shí)Dittmer等［21］報(bào)道了p53R175H和p53R273H的異位表達(dá)賦予了p53蛋白缺失細(xì)胞在軟瓊脂中形成集落和在裸鼠中形成異種移植瘤的能力，此后，包括使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小鼠模型以及臨床研究在內(nèi)的大量證據(jù)表明，許多p53蛋白錯(cuò)義突變均具有GOF活性以促進(jìn)癌癥的發(fā)生。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了多種突變p53蛋白GOF活性，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、基因組不穩(wěn)定性、代謝重編程、腫瘤微環(huán)境重塑、免疫抑制和癌癥治療抵抗［5，22］。

3 靶向突變p53蛋白治療腫瘤的策略

尋找靶向突變p53蛋白的藥物一直是治療癌癥的研究熱點(diǎn)。然而，野生型p53蛋白和大多數(shù)突變p53蛋白缺乏結(jié)合口袋或變構(gòu)位點(diǎn)，阻礙了常規(guī)的藥物設(shè)計(jì)，因此經(jīng)常被認(rèn)為是“不可成藥的”靶點(diǎn)。更重要的是，在人類腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2 000多種p53蛋白的突變形式，它們的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物學(xué)功能各不相同，幾乎不可能用單一藥物靶向所有p53蛋白的突變形式，對(duì)于每一種p53蛋白突變體，可能需要專門的藥物治療［23-24］。

本文主要梳理了兩種靶向突變p53蛋白以治療癌癥的策略：a. 恢復(fù)突變p53蛋白野生型構(gòu)象；b. 降解突變p53蛋白（圖3）。并簡要介紹了3種間接靶向突變p53蛋白治療癌癥的策略。盡管幾十年來科學(xué)家們提出了各種各樣針對(duì)突變p53蛋白治療癌癥的方式，但截至目前仍沒有開發(fā)出一款療效較為理想的藥物，也正因如此，科學(xué)家們對(duì)p53蛋白的研究熱情持續(xù)未減，未來無論哪種治療策略及藥物，若可以有效靶向突變p53蛋白治療癌癥，都將對(duì)人類醫(yī)學(xué)產(chǎn)生劃時(shí)代意義。

Fig. 3 Strategies for cancer therapy targeting degradation or restoration of wild-type conformation of mutated p53 protein圖3 恢復(fù)或降解突變p53蛋白治療癌癥的策略

3.1 恢復(fù)突變p53蛋白野生型構(gòu)象

p53蛋白屬于熱敏蛋白，突變后具有折疊與去折疊兩種狀態(tài)轉(zhuǎn)換的能力，因此是否可以利用一些小分子化合物逆轉(zhuǎn)突變構(gòu)象，使突變p53蛋白重新恢復(fù)其野生型構(gòu)象或功能呢？通過計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)千種化合物進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)極少數(shù)化合物似乎有這一能力，通過恢復(fù)突變p53蛋白的特定野生型功能，如誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和抑制癌細(xì)胞增殖，證實(shí)了這種“突變體再激活”。

3.1.1 COTⅠ-2

COTⅠ-2是通過計(jì)算機(jī)高通量篩選發(fā)現(xiàn)的一種具有口服活性的第三代胺苯硫脲化合物［25］（圖4）。已被證明能與突變p53蛋白結(jié)合，恢復(fù)突變p53蛋白野生型活性，并使野生型p53蛋白靶基因表達(dá)正常化［26-28］。除此之外，COTⅠ-2似乎也能獨(dú)立于p53蛋白發(fā)揮作用，該化合物可激活A(yù)MPK、抑制mTOR通路、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷引起復(fù)制應(yīng)激。COTⅠ-2的這些不依賴p53蛋白發(fā)揮的效應(yīng)可能進(jìn)一步促進(jìn)其抗癌作用，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)DNA損傷和復(fù)制應(yīng)激會(huì)引起細(xì)胞凋亡，而抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo)是一種成熟的治療癌癥的策略。

Fig. 4 Schematic diagram of reactivator structure of mutated p53 protein圖4 突變p53蛋白重激活劑結(jié)構(gòu)示意圖

與上述活性一致，Synnott等［26］發(fā)現(xiàn)COTⅠ-2可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型中腫瘤的生長，并且在研究的動(dòng)物模型中具有良好的耐受性，沒有發(fā)病或體重減輕的不良現(xiàn)象出現(xiàn)［26-27］。Salim等［25］發(fā)現(xiàn)，COTⅠ-2可作為單一藥物通過兩種途徑對(duì)多種頭頸部癌細(xì)胞發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用，一方面COTⅠ-2顯著增強(qiáng)了對(duì)順鉑和/或輻射出現(xiàn)耐藥性的頭頸部癌腫瘤細(xì)胞對(duì)這些治療的敏感性，另一方面COTⅠ-2可在TP53基因缺失或突變的頭頸部癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，而在含野生型p53蛋白的頭頸部癌細(xì)胞中，COTⅠ-2誘導(dǎo)衰老而非凋亡，這可能是由于COTⅠ-2可增強(qiáng)含野生型p53蛋白的細(xì)胞中p21表達(dá)，而p21是這些細(xì)胞中已知的衰老誘導(dǎo)物［29］。除此之外，Maleki等［30］還發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)突變p53蛋白的細(xì)胞系比含有野生型p53蛋白的細(xì)胞對(duì)COTⅠ-2更敏感。目前，COTⅠ-2正在進(jìn)行一項(xiàng)針對(duì)復(fù)發(fā)性婦科癌癥治療的臨床Ⅰ期試驗(yàn)，初步藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)顯示，口服該化合物的藥峰時(shí)間（Tmax）在15~90 min之間，半衰期為8~10 h，并且其耐受性良好，最常見的不良反應(yīng)為惡心、嘔吐、疲勞和腹痛。在接受治療的24名患者中，只有2名（8%）需要減少劑量。然而，到目前為止在參與試驗(yàn)的婦科癌癥患者中，還沒有腫瘤消退的證據(jù)［31］。

總之，COTⅠ-2在多種含突變p53蛋白的腫瘤細(xì)胞中具有非常有效的治療效果，即使這些腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑和輻射具有固有的耐藥性，此外，該藥物似乎以一種新穎的方式發(fā)揮其作用，包括重新激活野生型p53蛋白靶基因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等。事實(shí)上，COTⅠ-2在含野生型TP53基因的腫瘤細(xì)胞中同樣誘導(dǎo)許多凋亡基因上調(diào)，但細(xì)胞凋亡并不明顯，很可能是因?yàn)檫@些促凋亡基因并沒有在蛋白質(zhì)水平上被COTⅠ-2誘導(dǎo)［26］。

3.1.2 2-磺酰嘧啶

p53Y220C突變是p53蛋白第9大突變類型，位于p53蛋白S3/S4環(huán)和S7/S8 環(huán)之間的220位酪氨酸突變成為半胱氨酸。p53Y220C突變不僅直接破壞突變氨基酸與周圍氨基酸Leu145和Thr155之間的氫鍵，而且降低了p53Y220Ccluster區(qū)域的折疊片S3和S8之間的氫鍵數(shù)量，使p53Y220C突變所形成的親水性空腔變大，加速了水分子進(jìn)入該蛋白質(zhì)內(nèi)部，大大降低p53蛋白的熱穩(wěn)定性［32］。為了能夠找到具有較好靶向這種特殊突變活性的小分子化合物，Bauer等［33］通過差示掃描熒光法（DSF）篩選了一個(gè)旨在結(jié)合p53Y220C突變誘導(dǎo)產(chǎn)生的空腔配體文庫，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)2-磺酰嘧啶小分子PK11000（5-氯-2-甲磺酰吡啶-4-羧酸）（圖4），它可將突變p53Y220C蛋白融化溫度明顯提高（ΔTm>1.2K）［34］，并且根據(jù)光散射法測(cè)定蛋白質(zhì)聚合動(dòng)力學(xué)懷疑PK11000與突變p53蛋白屬于共價(jià)結(jié)合。然而后期發(fā)現(xiàn)PK11000還可以使細(xì)胞內(nèi)其他突變類型的p53蛋白融化溫度升高，證實(shí)其穩(wěn)定突變p53蛋白活性不是通過與p53Y220C突變腔結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。

Synnott等［35］發(fā)現(xiàn)，2-磺酰嘧啶在生物環(huán)境條件下僅與高度親核的半胱氨酸發(fā)生SNAr反應(yīng)，因此是選擇性化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的有用工具。通過HSQC NMR數(shù)據(jù)及ESⅠ質(zhì)譜，證實(shí)了PK11000對(duì)p53Cys182和p53Cys277的特異性烷基化作用，PK11000對(duì)Cys182和Cys277的特異性修飾可在不損害p53蛋白與DNA親和力的情況下提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

PK11007為PK11000的類似物，是溫和的硫醇烷基化劑（圖4），相對(duì)于PK11000具有更好的抗癌活性，這可能與其膜透性改善（疏水性更強(qiáng)）、巰基反應(yīng)活性提高（吸電子取代基更強(qiáng)）和烷基化選擇性增加（4-氟苯取代導(dǎo)致親核芳香族取代的空間位阻）等有關(guān)，此外PK11007還可通過兩條途徑發(fā)揮抗癌作用，即p53蛋白依賴和p53蛋白非依賴途徑［33］。PK11007可選擇性結(jié)合暴露于突變p53蛋白表面的兩個(gè)半胱氨酸即Cys182和Cys277從而穩(wěn)定突變p53蛋白，并不損害其DNA結(jié)合活性。在一些癌細(xì)胞系中，不穩(wěn)定的突變p53蛋白被PK11007重新激活，導(dǎo)致p53蛋白靶基因如p21和PUMA的上調(diào)從而引起細(xì)胞凋亡。然而更普遍的是，PK11007可獨(dú)立于p53蛋白通過消耗細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的高度升高及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激造成細(xì)胞凋亡［36］，PK11007和其他2-磺基嘧啶化合物作為抗癌藥物的先導(dǎo)具有很大的潛力。

3.1.3 異硫氰酸苯乙酯（PEⅠTC）

PEⅠTC大量存在于豆瓣菜和十字花科蔬菜中［37］（圖4），對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出生長抑制活性，尤其對(duì)表達(dá)突變p53R175蛋白的腫瘤細(xì)胞具有優(yōu)先抑制活性［38］。p53R175H突變是人類癌癥中最常見的p53蛋白錯(cuò)義突變，估計(jì)為5.6%的發(fā)生率。事實(shí)上，PEⅠTC已經(jīng)在臨床Ⅰ期和ⅠⅠ期試驗(yàn)中進(jìn)行了研究，作用機(jī)制包括恢復(fù)突變p53蛋白野生型構(gòu)象、抑制腫瘤細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)ⅠⅠ期解毒酶、細(xì)胞周期阻滯［24-25］和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進(jìn)凋亡［39］等。

此外，PEⅠTC處理還會(huì)使突變p53R175蛋白對(duì)MDM2依賴的蛋白酶體降解敏感。Lam-Ubol等［40］將蛋白酶體抑制劑MG132或特異性MDM2抑制劑Nutlin-3與PEⅠTC分別或共同處理SK-BR-3細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)PEⅠTC處理相比，MG132或Nutlin-3均可以使SK-BR-3細(xì)胞全裂解液（WCL）中突變p53蛋白顯著積累。這一結(jié)果表明，突變p53R175蛋白穩(wěn)定性降低是由于MDM2依賴的蛋白酶體的降解。這可能是由于PEⅠTC將突變p53R175蛋白恢復(fù)為野生型構(gòu)象，而野生型p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)受MDM2的調(diào)控［41］。

Choudhury等［42］用PEⅠTC處理SK-BR-3細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)高濃度（≥8 μmol/L）的PEⅠTC會(huì)引起突變p53R175蛋白發(fā)生聚集。由于蛋白質(zhì)聚集物會(huì)引發(fā)自噬清除，Bommareddy等［43］便研究了突變p53R175蛋白的降解是否經(jīng)歷自噬。他們將8 μmol/L PEⅠTC和氯喹（CHQ）共同處理SK-BR-3細(xì)胞，在細(xì)胞裂解液中發(fā)現(xiàn)突變p53R175蛋白水平較單獨(dú)PEⅠTC處理時(shí)明顯升高，而用4 μmol/L PEⅠTC做相同處理時(shí)突變p53R175蛋白水平并無明顯差異，這表明了高濃度PEⅠTC可能誘導(dǎo)突變p53R175蛋白發(fā)生聚集并自噬。PEⅠTC誘導(dǎo)的自噬，突變p53R175蛋白的再活化及其隨后對(duì)降解途徑的敏感性均有助于其依賴突變p53蛋白發(fā)揮抗癌活性。

近年來科學(xué)家們的研究方向主要集中于從化學(xué)文庫中尋找能重新激活突變p53蛋白的小分子化合物。然而，以膳食為基礎(chǔ)預(yù)防或治療突變p53蛋白的研究仍然很少。PEⅠTC的發(fā)現(xiàn)提供了第一個(gè)突變p53蛋白被飲食中化合物激活的例子［44］，對(duì)癌癥預(yù)防和治療具有重要意義。

3.1.4 三氧化二砷（ATO）

p53蛋白突變類型高達(dá)數(shù)千種，多為錯(cuò)義突變［15］，由于在其DBD缺乏廣泛適用的變構(gòu)調(diào)控位點(diǎn)，這就使得針對(duì)突變p53蛋白的治療顯得尤為棘手。盡管Zinc（NSC319726）靶向鋅配合位點(diǎn)已經(jīng)顯示了具有拯救突變p53蛋白的活性，但其對(duì)突變p53R175蛋白具有高度特異性并影響p53蛋白DNA結(jié)合活性［45］。還有一個(gè)值得注意的結(jié)合位點(diǎn)，涉及到一個(gè)遠(yuǎn)離DNA結(jié)合表面的裂縫，目前已經(jīng)開發(fā)出多種可插入這個(gè)縫隙的小分子如PK083、PK15796等，從而穩(wěn)定突變p53蛋白。然而遺憾的是，這種結(jié)合裂隙是p53Y220C突變所特有的，并不適用于其他p53蛋白突變體。因此還需不斷尋找靶向突變p53蛋白新的變構(gòu)位點(diǎn)化合物。

ATO是一種治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物，可通過與半胱氨酸反應(yīng)拯救結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白。砷結(jié)合突變p53蛋白的晶體結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)隱藏的變構(gòu)位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于遠(yuǎn)離突變p53蛋白DBD區(qū)的ABP口袋，涉及三個(gè)砷配位半胱氨酸。砷結(jié)合并穩(wěn)定了突變p53蛋白DBD區(qū)的環(huán)-片-螺旋基序和整個(gè)β夾層結(jié)構(gòu)，賦予結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白熱穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性［46］，值得注意的是，砷與ABP口袋中的半胱氨酸三聯(lián)體的特異性結(jié)合不同于其他作用于突變p53蛋白半胱氨酸的小分子化合物，如APR-246，后者雜亂地結(jié)合暴露于蛋白質(zhì)表面的半胱氨酸［47］。但砷結(jié)合的半胱氨酸三聯(lián)體同樣可能存在于其他蛋白質(zhì)中，從而使ATO產(chǎn)生獨(dú)立于突變p53蛋白的抗癌活性或細(xì)胞毒性［48］。在細(xì)胞和小鼠異種移植模型中，ATO重新激活了突變p53蛋白野生型活性并抑制腫瘤的發(fā)生。在對(duì)ATO介導(dǎo)拯救的25個(gè)人類癌癥中最常見突變p53蛋白實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，所有的結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白都可以被拯救，盡管程度不同。有趣的是，接觸突變型p53蛋白p53S241F、p53R248W也顯示出被拯救的跡象，這說明某些接觸突變型p53蛋白活性喪失也是由于構(gòu)象改變引起的。盡管ATO對(duì)結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白具有普遍的拯救作用，但它們的野生型活性并不總是被有效地恢復(fù)，因?yàn)槌苏w折疊外，局部p53蛋白DNA結(jié)合表面的完整性也決定了ATO拯救轉(zhuǎn)錄活性的效率［49］。

ATO聯(lián)合維甲酸治療APL為癌癥治療提供了新思路［50］。令人鼓舞的是，ATO的治療潛力在血液［51］和一些實(shí)體腫瘤［52］的臨床實(shí)驗(yàn)中已有報(bào)道。目前一項(xiàng)針對(duì)含有突變p53蛋白的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。

3.2 降解突變p53蛋白

TP53基因的錯(cuò)義突變產(chǎn)生異常蛋白質(zhì)，其抑癌功能被取消的同時(shí)也可獲得促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的能力（GOF）［53］，最近的研究結(jié)果表明，突變p53蛋白的敲除降低了攜帶突變p53蛋白的腫瘤細(xì)胞的致癌特性。因此，確定突變p53蛋白穩(wěn)定/降解的特異機(jī)制以及識(shí)別不改變野生型p53蛋白水平而使突變p53蛋白降解的化合物是至關(guān)重要的。靶向降解突變p53蛋白可能是開發(fā)新型抗癌藥物的一種有前景的方法。

3.2.1 藤黃酸（GA）

GA是從甘草干乳膠中分離出來的一種黃酮（圖5），在體內(nèi)外均表現(xiàn)出強(qiáng)大的生物活性，如激活凋亡途徑、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、抑制端粒酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅠⅠ活性以及抑制血管生成等［54-55］。迄今為止的所有研究都表明，GA是一種有效的抗癌劑，通過不同的機(jī)制具有不同的分子靶點(diǎn)。作為抗腫瘤候選藥物，GA目前正在進(jìn)行中國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的ⅠⅠ期臨床試驗(yàn)。

Fig. 5 Schematic diagram of small molecular compounds degrading mutated p53 protein圖5 降解突變p53蛋白的小分子化合物結(jié)構(gòu)示意圖

GA可以抑制含有野生型p53蛋白的腫瘤細(xì)胞生長，這是由于其可以抑制MDM2表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)野生型p53蛋白水平，從而發(fā)揮抑癌作用［56］。然而，半數(shù)以上的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了突變型p53蛋白，有趣的是，GA對(duì)MDM2的影響在含有突變型p53蛋白的細(xì)胞中是不同的，Qin等［56］發(fā)現(xiàn)在GA處理后的MDA-MB-435細(xì)胞中，MDM2蛋白水平和p53-MDM2相互作用均未受到顯著影響，盡管已有報(bào)道MDM2可促進(jìn)突變型和野生型p53蛋白的降解，但越來越多的研究表明，作為E3泛素連接酶的MDM2在突變型p53蛋白的降解中并不那么重要。而另一種突變p53蛋白降解途徑，涉及分子伴侶Hsc70和Hsp90以及泛素/蛋白酶體系統(tǒng)的密切合作，這種降解途徑的重要點(diǎn)在于伴侶相關(guān)泛素連接酶CHⅠP，CHⅠP通過與Hsc70和Hsp90的羧基端結(jié)合，與E2酶一起介導(dǎo)分子伴侶結(jié)合目標(biāo)蛋白的泛素化，并誘導(dǎo)蛋白酶體降解目標(biāo)蛋白。Hsc70和Hsp90在內(nèi)的多種分子伴侶可特異性識(shí)別突變型p53蛋白［57］，并在增強(qiáng)突變p53蛋白的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。Liu等［58］發(fā)現(xiàn)，GA可以通過調(diào)節(jié)這些分子伴侶進(jìn)而達(dá)到降解突變p53蛋白的目的，GA可以上調(diào)Hsc70，下調(diào)Hsp90的表達(dá)，而對(duì)CHⅠP的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有顯著影響，進(jìn)一步的免疫沉淀表明，GA改變了突變p53蛋白和分子伴侶之間的相互作用，呈濃度依賴性地破壞Hsp90與突變p53蛋白相互作用，并促進(jìn)Hsc70/突變p53蛋白和CHⅠP/Hsc70/突變p53蛋白復(fù)合物的形成。隨后Wang等［59］在MDA-MB-435細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CHⅠP siRNA后，用GA處理相關(guān)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)伴侶相關(guān)泛素連接酶的消失導(dǎo)致突變p53蛋白水平的增加，這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了GA降解突變p53蛋白的機(jī)制，即GA通過上調(diào)與突變p53蛋白特異性結(jié)合的分子伴侶，并與CHⅠP、E2酶、26S蛋白酶體一起介導(dǎo)突變p53蛋白的泛素化降解。

除此之外GA還可以增加攜帶突變p53蛋白的癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［60］。這可能是由于突變p53蛋白本身就是克服腫瘤耐藥性的藥物開發(fā)潛在靶點(diǎn)［61］，GA顯著降低了腫瘤細(xì)胞中突變p53蛋白水平，從而使其對(duì)化療藥物的敏感性增加。

3.2.2 YK-3-273

YK-3-237為combretastatin a4（CA-4）的硼酸查爾酮類似物［62］（圖5），是SⅠRT1酶激活劑并對(duì)廣泛含突變p53蛋白的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抗增殖活性。

SⅠRT1酶是針對(duì)p53K382殘基上的一個(gè)眾所周知的去乙?；?。無論是野生型還是突變p53蛋白的去乙?；济黠@依賴于SⅠRT1酶的催化。野生型p53K382殘基的乙?；徽J(rèn)為是其保持穩(wěn)定［63］的重要決定因素，突變p53蛋白高度穩(wěn)定的機(jī)制目前尚不清楚，但Alves-Fernandes等［64］發(fā)現(xiàn)，在TNBC細(xì)胞中，小分子化合物YK-3-237激活了SⅠRT1酶活性降低了突變p53蛋白的乙?；?，使突變p53蛋白水平明顯下降。Rozenberg等［65］通過real-time PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，YK-3-273在肝癌細(xì)胞系HUH-7中可誘導(dǎo)GADD45、PTEN和PERP mRNA的表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞系T47D中，可誘導(dǎo)GADD45和p21 mRNA的表達(dá)，在鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2中，誘導(dǎo)p21 mRNA的表達(dá)，在3種不同的TNBC細(xì)胞株HS578T、MDA-MB-468和SUM149PT中誘導(dǎo)野生型p53靶基因PUMA和NOXA的表達(dá)［66］，這些結(jié)果提示，YK-3-237介導(dǎo)的去乙?；梢种仆蛔僷53蛋白在多種腫瘤細(xì)胞中的功能，并特異性釋放突變p53蛋白對(duì)野生型p53靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。然而，YK-3-237激活SⅠRT1酶的分子機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。最近報(bào)道稱，YK-3-237只有在蛋白質(zhì)被7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）標(biāo)記的情況下才能激活其SⅠRT1酶活性，不能針對(duì)新生p53蛋白發(fā)揮作用［67］。此外，YK-3-237還能激活人SⅠRT2酶活性，降低了細(xì)胞中α微管蛋白水平。通過SⅠRT2酶脫乙酰作用減少α微管蛋白可能與降解突變p53蛋白，上調(diào)野生型p53蛋白靶基因的表達(dá)共同發(fā)揮抗腫瘤作用［66］。

但是目前SⅠRT1酶在人類癌癥中的作用還存在爭議［64］，已有報(bào)道稱SⅠRT1酶抑制劑和激活劑（如白藜蘆醇）都能抑制人類腫瘤細(xì)胞株的生長［68］。雖然最近已經(jīng)開發(fā)了幾種SⅠRT1酶激活劑，但這些化合物的抗癌作用尚未見報(bào)道。鑒于SⅠRT1酶在癌癥、衰老、糖尿病和神經(jīng)元疾病等許多生物過程中的作用日益增加，YK-3-237可能會(huì)是一個(gè)很有研究和開發(fā)價(jià)值的小分子化合物。

3.2.3 他汀類（Stains）

突變p53蛋白在腫瘤細(xì)胞中的穩(wěn)定存在對(duì)其GOF活性至關(guān)重要［53］，然而目前對(duì)突變p53蛋白穩(wěn)定/降解的特異機(jī)制還知之甚少。通過高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了Stains降膽固醇藥物可作為結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白的降解誘導(dǎo)物，并且對(duì)野生型p53蛋白和接觸突變型p53蛋白的影響很小。

突變p53蛋白本質(zhì)上是不穩(wěn)定的，因?yàn)榧?xì)胞中E3泛素連接酶MDM2及CHⅠP均可以誘導(dǎo)其降解［69］，但是在腫瘤細(xì)胞中，突變p53蛋白卻可以與多種分子伴侶如Hsp90、Hsc70、DNAJA1等相互作用從而保持穩(wěn)定的狀態(tài)［70］。甲羥戊酸途徑在結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白的穩(wěn)定以及GOF活性中發(fā)揮重要的作用。結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白可以結(jié)合并激活SREPB轉(zhuǎn)錄因子，從而上調(diào)參與甲羥戊酸途徑的多種酶合成大量的5-磷酸甲羥戊酸（MVP），而5-磷酸甲羥戊酸的上調(diào)又可以反過來促進(jìn)結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白與DNAJA1等多種分子伴侶的相互作用，從而使結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白在腫瘤細(xì)胞中保持穩(wěn)定的狀態(tài)，就這樣形成了一個(gè)正反饋循環(huán)［71］。并且5-磷酸甲羥戊酸還可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的異戊二烯化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附、遷移和增殖過程中靶蛋白的膜附著［72］。HMG-CoA還原酶是催化甲戊酸途徑的第一步限速酶［73］，Stains藥物通過抑制HMG-CoA還原酶活性，特異性減少細(xì)胞內(nèi)5-磷酸甲羥戊酸的生成，抑制結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白與分子伴侶DNAJA1相互作用，從而使結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白被細(xì)胞內(nèi)E3泛素連接酶MDM2及CHⅠP介導(dǎo)的泛素化標(biāo)記并降解。

Stains藥物可以抑制對(duì)癌癥進(jìn)展至關(guān)重要的兩種細(xì)胞活動(dòng)——蛋白質(zhì)異戊二烯化和突變p53蛋白的穩(wěn)定化，它是一款較為理想的靶向結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白的小分子抑制劑。此外，Stains藥物還可使含突變p53R172H蛋白的腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感，這表明了Stains藥物可作為獨(dú)立或與其他化療藥物聯(lián)合治療腫瘤的潛在作用［74］。然而，Moon等［75］發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中只有阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的日劑量分別達(dá)到30 mg/kg和10 mg/kg時(shí)才會(huì)有較好的抗腫瘤效果，這相當(dāng)于約140 mg和約50 mg的人體劑量，高于成人規(guī)定的臨床劑量，這也是為什么Stains藥物治療癌癥的臨床試驗(yàn)結(jié)果存在爭議。因此目前最重要的是發(fā)現(xiàn)降低Stains藥物劑量的同時(shí)仍保留其誘導(dǎo)突變p53蛋白降解能力的方法。

通過Stains藥物抑制甲羥戊酸途徑-DNAJA1軸誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)突變型p53蛋白降解可能代表了一種有希望的治療癌癥的策略。

3.3 間接靶向p53蛋白治療腫瘤的策略

3.3.1 重新激活被抑制的野生型p53蛋白功能

在保持野生型TP53基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，最廣泛采用的治療方法是抑制野生型p53蛋白的降解。野生型p53蛋白降解的機(jī)制涉及E3泛素連接酶MDM2對(duì)其泛素化標(biāo)記，最終導(dǎo)致野生型p53蛋白被細(xì)胞自身蛋白酶體所降解。MDM2介導(dǎo)的泛素化依賴其與野生型p53蛋白的直接結(jié)合，促使人們尋找抑制MDM2-p53結(jié)合的小分子作為穩(wěn)定野生型p53蛋白并使其恢復(fù)效力的工具。于是大量靶向MDM2蛋白以重新激活野生型p53蛋白功能的小分子應(yīng)運(yùn)而生（表1）。

Table 1 MDM2/MDMX-p53 inhibitors and their mechanisms of action表1 MDM2/MDMX-p53抑制劑及其作用機(jī)制

3.3.2 利用miRNA抑制含突變p53蛋白的腫瘤發(fā)生

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子［79］，主要功能為抑制其靶mRNA的轉(zhuǎn)譯或促進(jìn)其降解，因此，miRNA水平的改變可以通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)水平。野生型p53蛋白可通過直接激活轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)成熟來調(diào)節(jié)miRNA水平［80］，而突變p53蛋白會(huì)導(dǎo)致p53/miRNA軸的失調(diào)和其他miRNA的上調(diào)，從而賦予額外的致癌能力，如體細(xì)胞重編程等（表2）。此外，最近一些研究聚焦于循環(huán)miRNAs，探索其診斷和預(yù)后潛力，表明miRNAs的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。miRNAs可能是一種有效的癌癥治療工具。

Table 2 miRNA agonists and their mechanisms of action表2 miRNA激動(dòng)劑及其作用機(jī)制

3.3.3 利用合成致死抑制含突變p53蛋白的腫瘤發(fā)生

與直接靶向突變p53蛋白藥物相比，合成致死方法對(duì)p53蛋白結(jié)構(gòu)的依賴較小，這表明它可以廣泛作用于多種p53蛋白突變類型。根據(jù)腫瘤細(xì)胞中所含突變p53蛋白功能喪失（loss of function，LOF）和GOF的不同，可使用不同的策略（表3）。

Table 3 Inhibition of tumorigenesis containing mutated p53 proteins based on synthetic lethal effects表3 基于合成致死效應(yīng)抑制含突變p53蛋白的腫瘤發(fā)生

4 總結(jié)與展望

p53蛋白是人體內(nèi)天然免疫和抗腫瘤反應(yīng)的重要組成部分。其突變不僅會(huì)造成原本抑癌功能的喪失，甚至還會(huì)出現(xiàn)一些促進(jìn)癌癥發(fā)生的新功能。幾十年來，科學(xué)家們?yōu)榱藨?zhàn)勝突變p53蛋白提出了各種各樣的觀點(diǎn)，除上文提到的幾種策略外，還提出從水解的突變p53蛋白中提取特異性肽作為新抗原由抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）提供給B細(xì)胞和T細(xì)胞以激活免疫反應(yīng)［87］，利用靶向突變p53蛋白的小分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)水解靶向嵌合體（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC）化合物以降解突變p53蛋白等多種方式，達(dá)到治療癌癥的目的。然而目前絕大多數(shù)針對(duì)突變p53蛋白的藥物仍處于初級(jí)階段，沒有一款上市，因此現(xiàn)在就斷定針對(duì)突變p53蛋白的治療會(huì)對(duì)癌癥有效還為時(shí)過早，但是一旦有針對(duì)突變p53蛋白療效較好的化合物出現(xiàn)，就有可能開創(chuàng)癌癥治療新時(shí)代，特別是在p53蛋白功能障礙在人類癌癥中如此普遍存在的情況下。

總的來說，突變p53蛋白是一個(gè)有吸引力的癌癥治療靶點(diǎn)，隨著針對(duì)突變p53蛋白的治療策略及藥物不斷開發(fā)，根據(jù)患者的TP53基因突變情況設(shè)計(jì)個(gè)性化的治療方案將成為可能。