劉娟 歐翔 劉情 郭淼 寧子萍 顧洪豐* 唐雅玲*

（1）南華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，衡陽(yáng) 421001；2）南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，長(zhǎng)沙 410004）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以脂質(zhì)在動(dòng)脈血管壁蓄積為主要病理特征的慢性炎癥性疾病。在AS病理進(jìn)程中，因其病變處血管內(nèi)膜組織液中H+濃度升高而常發(fā)生微環(huán)境酸化（pH?7.0）［1-3］。越來(lái)越多的研究表明，這種酸化微環(huán)境與AS的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，但其作用機(jī)制尚不清楚［4-6］。酸敏感離子通道1（acidsensing ion channel 1，ASⅠC1）是微環(huán)境酸化的關(guān)鍵感受器［7］。其廣泛表達(dá)于心血管等系統(tǒng)，細(xì)胞外升高的H+通過(guò)激活A(yù)SⅠC1，將微環(huán)境酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，從而介導(dǎo)微環(huán)境酸化相關(guān)的心血管生理和病理功能［8-9］。新近研究發(fā)現(xiàn)，胞外酸化通過(guò)激活A(yù)SⅠC1抑制巨噬細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ABCA1）介導(dǎo)的膽固醇流出，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成［10］。這表明ASⅠC1在胞外酸化誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成中起著重要作用。

受體相互作用蛋白1（receptor-interacting protein 1，RⅠP1）是一種具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白激酶，屬于RⅠPs家族［11］。研究表明，ASⅠC1被H+等配體激活后，其胞內(nèi)的羧基端發(fā)生變構(gòu)募集RⅠP1，促使后者發(fā)生自身磷酸化，磷酸化激活的RⅠP1則進(jìn)一步募集下游信號(hào)分子，從而引起一系列胞外酸化誘導(dǎo)的病理生理過(guò)程［12］。轉(zhuǎn)錄因子 EB（transcription factor EB，TFEB）是調(diào)控自噬的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，特別對(duì)自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated proteinlight chain 3，LC3）和溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomeassociated membrane protein 1，LAMP1）的生成至關(guān)重要［13］。TFEB啟動(dòng)自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的核轉(zhuǎn)位受其絲氨酸位點(diǎn)磷酸化調(diào)控。研究表明，當(dāng)TFEB的142位點(diǎn)絲氨酸發(fā)生磷酸化（p-TFEB Ser142）時(shí)，該轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位受抑制，致使上述自噬相關(guān)基因的表達(dá)減少，從而抑制自噬［14］。上述資料提示，胞外酸化可能通過(guò)ASⅠC1促進(jìn)RⅠP1和TFEB磷酸化抑制巨噬細(xì)胞自噬。

脂噬為選擇性自噬，是指將包含脂滴的脂噬泡轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體、經(jīng)溶酶體酸脂酶降解為脂肪酸（經(jīng)β氧化后清除）和游離膽固醇（經(jīng)ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外）的生物學(xué)過(guò)程［15-16］。因此，脂噬是通過(guò)自噬-溶酶體途徑促進(jìn)脂質(zhì)代謝，防止細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的重要機(jī)制。研究表明，激活脂噬減少氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積；抑制脂噬則減少膽固醇流出，促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展［17-18］。這表明脂噬抑制在致巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中發(fā)揮著重要作用。前期研究雖已證實(shí)胞外酸化激活巨噬細(xì)胞ASⅠC1和抑制ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出［10］，但胞外酸化對(duì)巨噬細(xì)胞脂噬的影響及其作用機(jī)制目前尚不清楚。

本研究將在細(xì)胞外酸化誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞模型，分別采用ASⅠC1和RⅠP1特異抑制劑干預(yù)，探討胞外酸化是否通過(guò)激活A(yù)SⅠC1/RⅠP1途徑促進(jìn)TFEB磷酸化抑制巨噬細(xì)胞脂噬，從而減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和促進(jìn)脂質(zhì)蓄積的作用機(jī)制，為以ASⅠC1為靶點(diǎn)的AS性疾病防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及其來(lái)源

鼠源RAW 264.7巨噬細(xì)胞（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）株由南華大學(xué)心血管病研究所贈(zèng)送。

1.2 主要試劑

狼蛛毒素（PcTx-1）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；ox-LDL購(gòu)自廣州奕源公司；BⅠ特級(jí)胎牛血清（FBS）購(gòu)自以色列BⅠ公司；Trypsin-EDTA、1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DAPⅠ、飽和油紅O染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RⅠP1抑制劑（Nec-1）購(gòu)自美國(guó) Selleck公司；BCA蛋白定量試劑盒、RⅠPA裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE Loading Buffer、蛋白marker購(gòu)自碧云天公司；膜蛋白提取試劑盒購(gòu)自Abbkine公司；微管相關(guān)輕鏈蛋白3（LC3）、p62抗體、RⅠP1抗體、p-RⅠP1（Ser166）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ASⅠC1抗體購(gòu)自以色列Alonome公司；Na+/K+-ATPase抗體購(gòu)自Abmart公司；p-TFEB（Ser142）抗體購(gòu)自Affinity生物公司、Bodipy558/568 C12購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；LAMP1購(gòu)自中國(guó)Abclone公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；熒光二抗Alexa Fluor?488山羊抗兔購(gòu)自美國(guó)Jackson TmmunoResearch。

1.3 酸性培養(yǎng)基配置

用微量移液器向分裝的含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中滴加pH 4.4 MES緩沖液，調(diào)整培養(yǎng)基pH值為6.5。酸度計(jì)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中的pH變化，每12 h換液一次，以維持培養(yǎng)基中pH值的相對(duì)穩(wěn)定。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

RAW264.7巨噬細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2培養(yǎng)箱（37℃）中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代接種。在探討胞外酸化對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和ASⅠC1/RⅠP1/TFEB信號(hào)途徑介導(dǎo)脂噬影響的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分為pH 7.4、pH 7.4+25 mg/L ox-LDL、pH 6.5、pH 6.5+25 mg/L ox-LDL組。在探討胞外酸化是否通過(guò)激活A(yù)SⅠC1/RⅠP1途徑抑制巨噬細(xì)胞脂噬的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分為pH 7.4+25 mg/L ox-LDL組、pH 6.5+25 mg/L ox-LDL組、pH 6.5+25 mg/L ox-LDL+PcTx-1（10 μg/L）組、25 mg/L ox-LDL+Nec-1（20 μmol/L）組。24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)和病理形態(tài)學(xué)等檢測(cè)。

1.5 油紅O染色

當(dāng)細(xì)胞密度生長(zhǎng)達(dá)到80%~90%時(shí)，將細(xì)胞接種于有爬片的6孔板內(nèi)（2×105個(gè)/孔）。達(dá)到處理時(shí)間后，加入2 ml PBS緩沖液沖洗3次。用4%的多聚甲醛固定爬片30 min，每孔加入1 ml過(guò)濾的飽和油紅O染色液，37℃染色25 min；用60%異丙醇漂洗1 min，加入1 ml蘇木素染核30 s，隨后立即用PBS緩沖液漂洗3次；鹽酸酒精分化3 s，稀氨水反藍(lán)15 s；甘油明膠封片保存，顯微鏡觀察拍照，ⅠmageJ proplus軟件分析數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 細(xì)胞膜蛋白分離和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，棄上清，預(yù)冷PBS洗2次，加入1 ml 2% Triton X-100溶液冰浴15 min后，4℃，10 000g離心5 min，收集上清液。預(yù)留100 μl上清液（總蛋白質(zhì)）做下一步分析，剩余上清液37℃水浴10 min，以分離親水性蛋白的水相和疏水膜蛋白的去污劑相。用4℃ 500 μl緩沖液C（10 mmol/L Tris HCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA）溶解去污劑相沉淀，冰浴2 min后，37℃水浴10 min，然后將溶液37℃，2 000g離心5 min。以4℃ 500 μl緩沖液C再次抽提污劑相疏水膜蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。變性的蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，濕轉(zhuǎn)（90 min）至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉膜4 h后，分別加入一抗β-actin（1∶2 000）、Na+/K+-ATPase（1∶5 000）、ASⅠC1（1∶1 000）、RⅠP1（1∶1 000）、p-RⅠP1Ser166（1∶1 000）、p-TFEB Ser142（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）和p62（1∶1 000），4℃孵育12 h。TBST洗膜后換二抗室溫孵育2 h。洗膜后使用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Ⅰmage J軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.7 激光共聚焦觀察

將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于有爬片的24孔板內(nèi)（5×104個(gè)/孔），以相應(yīng)藥物或溶劑干預(yù)24 h后，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗3次。4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS清洗3次，0.1% Triton X-100室溫處理細(xì)胞30 min，PBS清洗3次。然后分別加入一抗LC3ⅠⅠ（1∶200），LAMP1（1∶200），4℃孵育過(guò)夜；吸凈一抗后加入熒光二抗，室溫避光孵育2 h。PBS清洗后加入Bodipy，室溫避光孵育20 min。最后滴加DAPⅠ，避光孵育15 min，取出爬片用抗熒光猝滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡分別觀察Bodipy（脂滴）與LC3ⅠⅠ（自噬體）和LAMP1（溶酶體）共定位，Ⅰmage J proplus軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 膽固醇流出實(shí)驗(yàn)

NBD-膽固醇熒光試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出。RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于含25 mg/L ox-LDL不同pH培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板（細(xì)胞密度1×105/孔），孵育24 h建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。然后加入不同pH值含5 μmol/L NBD-膽固醇的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基，孵育4 h。PBS洗滌細(xì)胞3次，然后以含apoA-1（20 mg/L）的上述不同pH無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基孵育4 h。收集培養(yǎng)基；12孔板加入0.1% Triton X-100裂解細(xì)胞，靜置30 min后收集細(xì)胞裂解液，將收集到的培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解液加入至黑色聚苯乙烯96孔板（200 μl/孔），檢測(cè)NBD-膽固醇的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為469 nm，發(fā)射波長(zhǎng)537 nm）。膽固醇流出率=培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度/總熒光強(qiáng)度（培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度+細(xì)胞裂解液熒光輕度）×100%。

1.9 透射電鏡（TEM）觀察

RAW264.7巨噬細(xì)胞以相應(yīng)試劑處理24 h后，收集細(xì)胞；預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，2.5%戊二醛4℃前固定30 min，1%鋨酸4℃后固定3 h。細(xì)胞經(jīng)乙醇丙酮梯度脫水后以環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片（70 nm），醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛雙重染色，Jeol JEM SX 100透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴、自噬體、溶酶體和脂噬體（包含脂滴的溶酶體）等超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示，GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胞外酸化促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積

為了探討胞外酸化促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用機(jī)制，以pH 6.5培養(yǎng)基（模擬AS病灶處的酸化微環(huán)境）孵育RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h，油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。結(jié)果表明，與pH 7.4組相比較，pH 6.5組內(nèi)的脂質(zhì)蓄積（紅色區(qū)域）略有增加（圖1a，b），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，與pH 7.4+ox-LDL組相比，pH 6.5+ox-LDL組巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積明顯增加。這表明胞外酸化顯著促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積。

Fig. 1 Extracellular acidification accelerates lipid accumulation in macrophages

2.2 胞外酸化促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞ASIC1膜轉(zhuǎn)位和RIP1/TFEB磷酸化

接下來(lái)，以Western blot檢測(cè)了胞外酸化對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞ASⅠC1的膜轉(zhuǎn)位，以及RⅠP1和TFEB磷酸化水平的影響（圖2a，c）。結(jié)果表明，與相應(yīng)pH 7.4組相比較，胞外酸化組細(xì)胞質(zhì)膜ASⅠC1/總ASⅠC1蛋白的比值顯著升高（圖2b），這表明胞外酸化促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的ASⅠC1向質(zhì)膜轉(zhuǎn)位。此外，與相應(yīng)pH 7.4組相比較，胞外酸化組RAW264.7細(xì)胞的p-RⅠP1Ser166/總RⅠP1（圖2d）比值和p-TFEBSer142蛋白（圖2e）都分別顯著增加，這表明胞外酸化促進(jìn)RⅠP1和TFEB蛋白的磷酸化。以上研究結(jié)果提示，ASⅠC1激活和RⅠP1和TFEB磷酸化可能在胞外酸化促巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中起著重要作用。

Fig. 2 Extracellular acidification promotes membrane translocation of ASIC1 and phosphorylation of RIP1 and TFEB in RAW 264.7 macrophages

2.3 胞外酸化抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的自噬流

鑒于RⅠP1/TFEB通路是調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵信號(hào)途徑，本文通過(guò)Western blot檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞LC3和p62蛋白的表達(dá)水平（圖3a），以明確胞外酸化對(duì)巨噬細(xì)胞自噬流的影響。研究結(jié)果表明，與相應(yīng)正常pH組相比較，胞外酸化組RAW264.7巨噬細(xì)胞的LC3ⅠⅠ/LC3Ⅰ蛋白比值顯著降低（圖3b），而p62蛋白的表達(dá)則明顯增加（圖3c）。上述結(jié)果表明，胞外酸化抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的自噬流，其機(jī)制可能與激活A(yù)SⅠC1促進(jìn)RⅠP1和TFEB磷酸化有關(guān)。

Fig. 3 Extracellular acidification impedes autophagy in RAW264.7 macrophages

2.4 胞外酸化通過(guò)激活A(yù)SIC1/RIP1途徑促進(jìn)TFEB磷酸化

為了明確胞外酸化促進(jìn)TFEB磷酸化是否通過(guò)激活A(yù)SⅠC1/RⅠP1信號(hào)途徑，分別使用ASⅠC1特異性阻斷劑PcTx-1和RⅠP1抑制劑Nec-1干預(yù)胞外酸化誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞24 h。Western blot檢測(cè)ASⅠC1、RⅠP1、p-RⅠP1、p-TFEB水平。結(jié)果顯示，與pH 7.4組相比較，胞外酸化組RAW264.7細(xì)胞的ASⅠC1表達(dá)顯著增加（圖4a，b），p-RⅠP1Ser 166水平明顯升高，p-RⅠP1Ser 166/RⅠP1比值顯著升高（圖4a，c），且p-TFEB Ser 142的水平也顯著升高（圖4a，d）。然而，胞外酸化對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的上述效應(yīng)能被ASⅠC1的特異阻斷劑PcTx-1所取消。此外，胞外酸化促進(jìn)巨噬細(xì)胞TFEB磷酸化的作用能被RⅠP1抑制劑Nec-1所拮抗。這表明胞外酸化通過(guò)激活RAW264.7細(xì)胞ASⅠC1，從而促進(jìn)RⅠP1第166位點(diǎn)絲氨酸和TFEB第142位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化。

Fig. 4 Extracellular acidification enhances phosphorylation of TFEB via activating ASIC1/RIP1 pathway

2.5 胞外酸化通過(guò)ASIC1/RIP1途徑抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬

為了闡明ASⅠC1/RⅠP1途徑激活是否參與胞外酸化誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞自噬流障礙，分別以ASⅠC1特異性阻斷劑PcTx-1和RⅠP1抑制劑Nec-1干預(yù)胞外酸化誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3和p62蛋白的表達(dá)，以明確抑制ASⅠC1/RⅠP1途徑后細(xì)胞自噬流的變化。結(jié)果表明，與pH 7.4+ox-LDL組相比較，胞外酸化組的LC3ⅠⅠ/LC3Ⅰ蛋白比值顯著降低（圖5a，b），p62蛋白的表達(dá)顯著增加（圖5a，c）。與胞外酸化組相比較，PcTx-1組和Nec-1組的LC3ⅠⅠ/LC3Ⅰ比值都明顯升高，而p62蛋白的表達(dá)則均顯著減少。這表明阻斷ASⅠC1/RⅠP1信號(hào)途徑可取消胞外酸化對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬流的抑制作用。

Fig. 5 Inhibiting the activation of ASIC1/RIP1 pathway reverses autophagy deficit induced by extracellular acidification in RAW264.7 macrophages

2.6 胞外酸化通過(guò)ASIC1/RIP1途徑抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞脂噬

在明確胞外酸化經(jīng)ASⅠC1/RⅠP1途徑抑制自噬的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討該信號(hào)途徑對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂噬的影響。胞外酸化誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分別以ASⅠC1阻斷劑PcTx-1和RⅠP1抑制劑Nec-1干預(yù)24 h，透射電鏡和免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的脂噬變化。透射電鏡觀察結(jié)果表明（圖6a），與pH 7.4組相比較，胞外酸化組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增加，自噬體、溶酶體、自噬溶酶體以及包含脂滴的脂噬泡數(shù)量均明顯減少，表明胞外酸化抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞脂噬和促進(jìn)脂質(zhì)蓄積。然而，胞外酸化對(duì)RAW264.7細(xì)胞的上述現(xiàn)象能被PcTx-1和Nec-1所取消。激光共聚焦顯微鏡下分別觀察脂滴（Bodipy，紅色）與自噬體（LC3ⅠⅠ，綠色）和溶酶體（LAMP1，綠色）共定位的研究結(jié)果表明（圖6b，c），與pH 7.4組相比，胞外酸化組細(xì)胞的脂滴（紅色）蓄積增加，自噬體（綠色熒光）和溶酶體的數(shù)量（綠色熒光）都則明顯減少，脂滴與自噬體、脂滴與溶酶體的共定位（黃色）也顯著減少。而與pH 6.5組相比較，PcTx-1和Nec-1干預(yù)組組細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積（紅色）都明顯減少，自噬體和溶酶體與脂滴的共定位（黃色）均顯著增加。以上結(jié)果表明，胞外酸化通過(guò)ASⅠC1/RⅠP1途徑抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂噬。

Fig. 6 Extracellular acidification inhibits lipophagy via activating ASIC1/RIP1 pathway in RAW 264.7 macrophages

2.7 抑制ASIC1/RIP1途徑促進(jìn)RAW24.7巨噬細(xì)胞的膽固醇流出和減少細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積

脂噬是將富含膽固醇酯的脂滴降解為游離膽固醇后經(jīng)ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的生物學(xué)過(guò)程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ASⅠC1/RⅠP1途徑介導(dǎo)的脂噬障礙促成脂質(zhì)蓄積，胞外酸化誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分別使用ASⅠC1阻斷劑PcTx-1和RⅠP1抑制劑Nec-1干預(yù)24 h，膽固醇熒光試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞中ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出，油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。膽固醇流出檢測(cè)結(jié)果（圖7a）表明，與pH 7.4對(duì)照組相比較，胞外酸化組RAW264.7細(xì)胞的膽固醇流出顯著減少，而與pH 6.5處理組相比，PcTx-1組和Nec-1組細(xì)胞的膽固醇流出均顯著增加。此外，油紅O染色結(jié)果（圖7b，c）表明，與pH 7.4組相比，胞外酸化組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積（紅色區(qū)域）明顯增加。而與胞外酸化組相比較，ASⅠC1抑制劑組和RⅠP1抑制劑組細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積均顯著減少。上述結(jié)果表明，胞外酸化通過(guò)激活A(yù)SⅠC1/RⅠP1途徑抑制脂噬，減少RAW264.7巨噬細(xì)胞ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。

Fig. 7 Extracellular acidification inhibits ABCA1-mediated cholesterol efflux via activating ASIC1/RIP1 pathway

3 討論

AS病變處常出現(xiàn)微環(huán)境酸化和脂噬障礙，但該酸化微環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞的脂噬影響及其機(jī)制目前尚不清楚。本課題探討胞外酸化是否通過(guò)激活A(yù)SⅠC1/RⅠP1途徑抑制巨噬細(xì)胞脂噬。研究發(fā)現(xiàn)：a. 胞外酸化促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積和ASⅠC1膜轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)RⅠP1和TFEB磷酸化，抑制巨噬細(xì)胞的脂噬；b. 抑制巨噬細(xì)胞ASⅠC1激活顯著降低胞外酸化誘導(dǎo)RⅠP1和TFEB的磷酸化水平，且促進(jìn)脂噬；c. RⅠP1抑制劑顯著降低胞外酸化誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞TFEB磷酸化水平，促進(jìn)脂噬和減少細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。研究結(jié)果表明，胞外酸化通過(guò)激活巨噬細(xì)胞ASⅠC1/RⅠP1途徑促進(jìn)TFEB的Ser166位點(diǎn)磷酸化，從而抑制巨噬細(xì)胞脂噬。

本研究首先構(gòu)建胞外酸化誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。以RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，以pH 6.5酸性培養(yǎng)液模擬AS病變血管內(nèi)膜液中巨噬細(xì)胞所處的酸化環(huán)境，明確胞外酸化對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響。為了防止pH大幅度波動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，采用生物緩沖劑MES配制酸性培養(yǎng)基以維持細(xì)胞外pH值的相對(duì)穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，胞外酸化顯著促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成。這與前期研究結(jié)果相一致［10］。此外，新近研究結(jié)果證實(shí)，胞外酸化促進(jìn)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞（THP-1）內(nèi)的脂質(zhì)蓄積［19］，抑制細(xì)胞外酸化減輕巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成［18］。盡管本研究結(jié)果和文獻(xiàn)資料證實(shí)，細(xì)胞外酸化加速巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積，但巨噬細(xì)胞感知胞外酸化信號(hào)進(jìn)而促脂質(zhì)蓄積的機(jī)制尚不清楚。這是接下來(lái)探討的主要科學(xué)問(wèn)題。

ASⅠC1蛋白作為感受胞外升高H+的重要膜受體，但在正常pH環(huán)境，其主要位于細(xì)胞質(zhì)中［20］。當(dāng)胞外發(fā)生酸化時(shí)，該通道蛋白迅速?gòu)陌|(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，繼而與H+結(jié)合以轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外酸化信號(hào)，參與神經(jīng)元損傷等多種生理與病理生理進(jìn)程［21］。本研究結(jié)果表明，ASⅠC1表達(dá)于RAW264.7巨噬細(xì)胞，pH 6.5的胞外酸化環(huán)境不僅促進(jìn)ASⅠC1蛋白表達(dá)和膜轉(zhuǎn)位，而且顯著增加細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。有趣的是，本研究結(jié)果（圖2a）顯示細(xì)胞膜蛋白Na+/K+ATPase的表達(dá)比總蛋白質(zhì)高，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)［22-23］報(bào)道相一致，但目前對(duì)這一異?，F(xiàn)象的機(jī)制尚不清楚。值得注意的是，ASⅠC1的特異性阻斷劑PcTx-1抑制該受體激活后，胞外酸化誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積顯著減少。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激活A(yù)SⅠC1是胞外酸化促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的重要機(jī)制。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，ASⅠC1通過(guò)調(diào)控自噬參與各種組織酸化性疾病的病理生理過(guò)程。在肝癌、腦膠質(zhì)瘤等實(shí)體腫瘤中，腫瘤微環(huán)境酸化通過(guò)ASⅠC1激活自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移［24-25］。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程中，關(guān)節(jié)滑膜酸化通過(guò)激活A(yù)SⅠC1/AMPK/FoxO3a途徑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬［26］。然而，胞外酸化對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響目前尚不清楚。本研究從自噬新視角探討了ASⅠC1在胞外酸化誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用及其機(jī)制。研究結(jié)果表明，胞外酸化顯著增加p-RⅠP1 Ser166和p-TFEB Ser142蛋白的水平，降低LC3ⅠⅠ/LC3Ⅰ的比值和升高p62蛋白的表達(dá)。重要的是，胞外酸化對(duì)巨噬細(xì)胞的上述作用能被ASⅠC1的阻斷劑PcTx-1所取消。鑒于LC3ⅠⅠ/LC3Ⅰ比值升高和p62蛋白表達(dá)降低反映自噬被激活，反之則被抑制［27］。上述研究結(jié)果表明，胞外酸化通過(guò)激活A(yù)SⅠC1促進(jìn)RⅠP1和TFEB磷酸化抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬。然而，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道胞外酸化經(jīng)ASⅠC1促進(jìn)腫瘤和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬不一致，其原因可能是胞外酸化對(duì)不同類型細(xì)胞的自噬信號(hào)途徑的作用不同。

脂噬是一種清除富含膽固醇酯脂滴的選擇性自噬，在防止細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積中起著重要作用［16］。當(dāng)脂噬受到抑制時(shí)，因細(xì)胞內(nèi)的脂滴降解能力降低而導(dǎo)致大量脂質(zhì)蓄積形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生［28］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞脂噬受RⅠP1/TFEB信號(hào)途徑調(diào)控［29-30］。在該信號(hào)途徑中，RⅠP1是自噬及溶酶體活性的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，RⅠP1抑制自噬的機(jī)制與其Ser166位點(diǎn)磷酸化后升高p-Ser142 TFEB水平有關(guān)［30］。TFEB為核轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)調(diào)控自噬關(guān)鍵基因LC3和LAMP1的表達(dá)來(lái)參與自噬過(guò)程調(diào)節(jié)［31］。磷酸化激活的RⅠP1募集下游信號(hào)分子TFEB，并促使后者142號(hào)位點(diǎn)的絲氨酸殘基磷酸化（p-Ser142 TFEB）［32］。當(dāng)其142位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化時(shí)，TFEB從胞質(zhì)向細(xì)胞核的移位被抑制，下調(diào)LC3和LAMP1的表達(dá)，進(jìn)而抑制脂噬［14］。文獻(xiàn)資料證實(shí)，胞外酸化促使神經(jīng)元ASⅠC1羧基端靶向募集RⅠP1，升高p-RⅠP1 Ser166水平［12］。那么，胞外酸化是否通過(guò)ASⅠC1/RⅠP1/TFEB途徑抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞脂噬呢？

本文在已明確胞外酸化通過(guò)ASⅠC1促進(jìn)RⅠP1和TFEB磷酸化基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了該信號(hào)途徑對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂噬的影響及作用機(jī)制。透射電鏡結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比較，胞外酸化組細(xì)胞內(nèi)的脂滴大量蓄積，包含脂滴的脂噬體的數(shù)量顯著減少。免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明，胞外酸化組細(xì)胞內(nèi)脂滴與自噬體和溶酶體共定位區(qū)域都明顯減少，而細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積明顯增加。此外，與對(duì)照組相比較，胞外酸化組細(xì)胞的LC3ⅠⅠ蛋白水平顯著降低和p62蛋白的表達(dá)明顯增加，ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出顯著減少。以上結(jié)果證實(shí)，胞外酸化抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂噬。然而，胞外酸化對(duì)巨噬細(xì)胞的脂噬抑制作用能分別被ASⅠC1的特異性阻斷劑PcTx-1和RⅠP1的抑制劑Nec-1所抵消。這表明胞外酸化通過(guò)ASⅠC1/RⅠP1途徑抑制TFEB介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂噬。其機(jī)制為阻斷ASⅠC1/RⅠP1信號(hào)途徑后，胞外酸化誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RⅠP1Ser166位點(diǎn)磷酸化被抑制，繼而降低TFEB Ser142磷酸化水平，促進(jìn)TFEB的核轉(zhuǎn)位，上調(diào)脂噬相關(guān)基因LC3和LAMP1的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)胞外酸化對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂噬的抑制。

4 結(jié)論

本研究探討了ASⅠC1/RⅠP1 途徑在胞外酸化誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用及其機(jī)制。發(fā)現(xiàn)胞外酸化通過(guò)激活A(yù)SⅠC1和RⅠP1升高p-Ser142 TFEB水平，繼而下調(diào)自噬相關(guān)基因LC3和溶酶體相關(guān)基因LAMP1的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞脂噬，從而促進(jìn)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成。本研究從激活A(yù)SⅠC1/RⅠP1途徑調(diào)控脂噬的新視角揭示了酸化微環(huán)境促巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用機(jī)理，將為以ASⅠC1新靶點(diǎn)的AS性疾病防治提供研究基礎(chǔ)。