孫雨蕉 常超 吳振華 張藝扉 田裕濤

（1）天津大學醫(yī)學工程與轉化醫(yī)學研究院，天津 300072；2）天津大學胸科醫(yī)院心臟外科重癥監(jiān)護室，天津 300051；3）天津市腦科學與神經工程重點實驗室，天津 300072）

脂類物質是生物體內一類重要的生物分子，包括脂肪酸（fatty acid，FA）、甘油脂質（glycerolipids，GL）、甘油磷脂（glycerophospholipids，GP）等［1］。在過去的幾十年里，不同類型的脂肪酸因其在健康和疾病方面的多種功能而受到人們的關注。其中多不飽和脂肪酸（poly-unsaturated atty acid，PUFA）是日常膳食中重要的營養(yǎng)成分，已有相關研究表明，提高日常多不飽和脂肪酸的攝入可帶來諸多益處，例如可增強免疫系統的功能以及降低心腦血管疾病發(fā)生風險等［2］，但其中的作用機制尚未被完全闡明。也有部分臨床研究揭示，膳食攝入的外源性和體內的內源性多不飽和脂肪酸水平或異常代謝與諸多疾病相關，例如在阿爾茨海默病、抑郁癥和孤獨癥患者中均發(fā)現明顯的多不飽和脂肪酸代謝異常［2］。這些結果表明，除了作為營養(yǎng)元素外，內源性多不飽和脂肪酸對維持各類細胞的正常功能也尤為重要，且不同的多不飽和脂肪酸可能存在差異化的作用形式。

離子通道作為廣泛分布于機體各類細胞膜表面的孔道蛋白，可選擇性通透Na+、K+、Ca2+和Cl-等離子，并通過門控過程調節(jié)不同狀態(tài)下對各類離子的通透程度，進而調節(jié)細胞的離子穩(wěn)態(tài)、興奮性以及細胞器功能等一系列細胞活動［3］。其中，鉀離子通道作為分布最廣、亞型最多的一類離子通道，在調節(jié)興奮性細胞的靜息膜電位與動作電位中起到重要作用。鉀離子通道有不同的分類方式和命名方法。根據結構和生理特性，可把鉀離子通道分為：電壓門控鉀離子通道（voltage-dependent potassium channel，KV）、鈣離子激活的鉀離子通道（Ca2+activated potassium channel，KCa）、內向整流鉀離子通道（inwardly rectifying potassium channel，Kir）和串聯孔域鉀離子通道（tandem pore domain potassium channels，K2P）等幾類，其中KCa通道由于其電壓敏感特性，也可歸類為KV通道家族。鉀離子通道門控過程受到如細胞膜電位、內源性配體分子和外源性藥物分子等多種形式的調控，在相應的生理和病理狀態(tài)下產生相應的調控效應［4］。游離脂肪酸分子可作為細胞內的信號分子或膜磷脂的組成部分行使一系列生理功能，調控生命活動。不同的脂肪酸分子作為信號分子可與細胞膜表面的GPR40、GPR120和GPR43等多種受體結合，激活G蛋白偶聯信號通路，參與各類生理過程［5］。近年來，越來越多的研究表明，除G蛋白偶聯受體外，脂肪酸分子可與鉀離子通道產生直接相互作用，調節(jié)鉀離子通道門控過程，進而在心血管系統、神經系統或免疫系統中對一系列重要生理功能發(fā)揮作用［6-8］。

鉀離子通道作為多不飽和脂肪酸的作用靶點，受到越來越多研究者的關注，尋找多不飽和脂肪酸在離子通道上的結合位點、認識并理解多不飽和脂肪酸與離子通道之間的相互作用形式以及門控調節(jié)的分子機制，對生理學、病理學以及藥物開發(fā)均具有重要意義。隨著結構生物學、計算生物學和分子動力學模擬技術的發(fā)展，對部分鉀離子通道和多不飽和脂肪酸之間相互作用形式的解析已達到近原子水平。本文將重點針對近年來的研究成果，聚焦多不飽和脂肪酸通過直接作用對鉀離子通道的調控形式、分子機制和生物物理機制進行總結，以期為未來多不飽和脂肪酸調控鉀離子通道的研究提供一定助力。

1 多不飽和脂肪酸的化學特性和生理作用

脂肪酸分子主要由一個極性的羧酸頭部以及具有疏水特性的脂肪族碳鏈尾部所構成。根據碳鏈尾部所包含的不飽和碳-碳雙鍵的數量，脂肪酸分子可以分為：全部為碳-碳單鍵的飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、僅含有一個碳-碳雙鍵的單不飽和脂肪酸（mono-unsaturated atty acid，MUFA），以及含有兩個及以上碳-碳雙鍵的多不飽和脂肪酸（poly-unsaturated atty acid，PUFA）［9］。

多不飽和脂肪酸可根據尾部碳鏈所含碳原子和雙鍵的數目來命名。例如，參與諸多生命活動調節(jié)的花生四烯酸（arachidonic acid，AA）為尾部含有4個不飽和雙鍵的20碳烯烴，可寫作20∶4。多不飽和脂肪酸的另一種分類與命名方式，是依據自甲基末端起，第一個不飽和雙鍵出現的碳原子位置是第3位或第6位，可分為ω-3和ω-6不飽和脂肪酸（圖1a）?；ㄉ南┧崾侨梭w內最重要的ω-6不飽和脂肪酸。此外，人們所熟知的二十二碳六烯酸——DHA（docosahexaenoic acid，22∶6）和二十碳五烯酸——EPA（eicosapentaenoic acid，20∶5）是具有重要生理功能的ω-3不飽和脂肪酸。

Fig. 1 Main types and metabolic pathways of polyunsaturated fatty acids圖1 多不飽和脂肪酸的主要種類及代謝途徑

根據多不飽和脂肪酸在化學結構上的特點，使其具有一系列理化特性。a. 羧酸頭部具有弱酸性質，其質子化程度的差異決定多不飽和脂肪酸攜帶正電或不帶電。一些研究顯示，多不飽和脂肪酸羧酸頭部的pKa約為7.4，因此在生理pH下，約50%的羧酸基團為去質子化狀態(tài)，攜帶正電荷［10-11］。環(huán)境pH的變化將會改變羧酸基團的帶電特性，影響多不飽和脂肪酸對離子通道的調控效果（下文詳述）。b. 尾部的碳-碳不飽和雙鍵使得雙鍵兩側的原子存在順式（cis-）和反式（trans-）構型的差異，這是多不飽和脂肪酸顯著區(qū)別于飽和脂肪酸的特點［12］。多不飽和脂肪酸尾部的多個順式雙鍵可以使其尾部的形狀發(fā)生彎折并衍生出不同的幾何構象。因此，尾部碳鏈長短、不飽和雙鍵的數量和位置會對多不飽和脂肪酸與離子通道的結合和調控效果產生影響（下文詳述）。

人體內的各種多不飽和脂肪酸可通過日常膳食攝入以及體內合成獲得。其中α-亞麻酸（α-linoleic acid，ALA，18∶3，ω-3）和亞麻酸（linoleic acid，LA，18∶2，ω-6）為必需脂肪酸，無法從頭合成，只能經由膳食攝入，而其他的多不飽和脂肪酸可經由體內的脂肪酸延長、還原等反應進行合成（圖1c）［13-14］。根據現有報道，在生理狀態(tài)下游離的多不飽和脂肪酸在體液環(huán)境（血漿、血清、腦脊液等）中的濃度為10~50 μmol/L，在增加膳食補充或營養(yǎng)補劑等條件下，體內的游離脂肪酸濃度會進一步升高［15-17］。

細胞內多不飽和脂肪酸的另一個來源是細胞膜中磷脂水解后釋放的游離脂肪酸。典型細胞膜的磷脂中，脂肪酸的羧酸頭部通過酯鍵和甘油分子相連接，甘油分子的首位碳原子（sn-1）一般連接一個飽和脂肪酸，第二位碳原子（sn-2）則主要連接一個不飽和脂肪酸（MUFA或多不飽和脂肪酸），其中AA和DHA是連接在sn-2位的主要多不飽和脂肪酸。通過磷脂酶A2的作用，可以將sn-2位的脂肪酸水解，釋放為游離脂肪酸。已有研究表明，不同類型的磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）可以和部分G蛋白耦聯受體（例如：5-羥色胺受體、緩激肽受體、食欲素受體等）相結合［18-20］。在受到細胞外激素、遞質等配體分子激活后，G蛋白耦聯受體可特異性地激活細胞內的PLA2，進而利用PLA2選擇性水解多不飽和脂肪酸。例如iPLA2水解DHA，cPLA2水解AA［21］。這些多不飽和脂肪酸被水解釋放后，可以直接沿細胞質膜擴散，結合并作用于離子通道蛋白（圖1b）。

隨著研究的深入，人們發(fā)現多不飽和脂肪酸在人體各系統中起著重要的生理調節(jié)功能。在神經系統中，多不飽和脂肪酸參與了涉及神經元和神經膠質細胞的多樣化過程，它促進神經元增值和分化，還通過促進軸突生長和突觸形成促進突觸傳遞［22-23］。在心血管系統中，多不飽和脂肪酸通過改變細胞膜物理化學性質、調控膜通道和蛋白質的直接相互作用等方式影響著心血管系統的功能，具有改善血管和心臟血流動力學、降低血漿甘油三酯的作用［24-26］。在免疫系統中，多不飽和脂肪酸的具體作用機制與細胞類型有關。例如，多不飽和脂肪酸可調節(jié)巨噬細胞中細胞因子的產生和分泌，抑制中性粒細胞的遷移和活性氧的產生［27-30］。除此之外，多不飽和脂肪酸還有助于保護胃腸道黏膜、調節(jié)胰島素的分泌、促進骨骼發(fā)育和維護骨密度等［31］。

總之，多不飽和脂肪酸通過膳食攝入或者自身合成等方式存在于生物體內，并以其獨特的形式參與體內不同種類細胞活動的調控。多不飽和脂肪酸主要通過改變目標通道的電導、門控動力學特征等方式調節(jié)通道功能［32］，其對鉀離子通道的影響已有多篇優(yōu)秀綜述，但更為詳盡的作用靶點與分子機制解析一直是研究的難點，這大大影響了關于多不飽和脂肪酸的靶向機制研究。其中，多不飽和脂肪酸調控KV7通道和BKCa通道的分子機制近年來已形成較為系統的研究，其研究的技術路線和方法值得借鑒到其他鉀離子通道的研究過程中。因此本文將聚焦于多不飽和脂肪酸對鉀離子通道的直接調控作用，重點針對近些年KV7和BKCa通道關于調控形式、分子機制和生物物理機制等方面的研究成果進行總結。

2 多不飽和脂肪酸對KV7通道的調控及分子機制

2.1 KV7通道的生理病理功能和基本結構

KV7是電壓門控鉀離子通道家族中的成員，其通道電流具有緩慢激活以及慢速延遲整流的特征。KV7亞家族包含5個不同成員，分別為KV7.1~KV7.5，不同KV7通道的表達具有組織和細胞差異性，且具有不同的生理功能。KV7.1主要分布于心肌細胞，是心肌細胞中產生慢速延遲整流鉀電流（slow ⅠK）的主要通道，參與心肌細胞動作電位的復極化過程，特別是在機體需要額外的復極化電流，尤其是在高交感張力狀態(tài)下，通道被激活［33］；同時，內耳中內淋巴細胞所表達的KV7.1通道，參與維持細胞中鉀離子濃度的平衡［34］。KV7.2和KV7.3可組裝為異源四聚體，是神經系統中M電流的分子基礎，對于穩(wěn)定神經元的靜息電位具有重要作用，并參與神經元興奮性的調節(jié)［35］。KV7.4通道在內耳淋巴細胞中與KV7.1一起參與維持細胞的離子平衡［36］；同時，平滑肌細胞中的KV7.4通道也參與維持靜息電位［37-39］。KV7.5在神經系統和平滑肌中與其他的KV7蛋白形成異源四聚體發(fā)揮生理功能［38，40-41］。由于KV7通道表達廣泛并參與眾多生理功能，KV7通道的功能失常通常會導致一些疾病的發(fā)生。KV7通道的功能喪失性突變可能導致心律失常、心室顫動和猝死，而功能獲得性突變則可能導致短QT綜合征或心房顫動［42］。KV7通道的突變可能會降低通道的電壓敏感性，導致通道的開放概率降低、閉合動力學增加，從而增加神經元的興奮性，導致癲癇的發(fā)生［43-44］。此外，KV7.4介導的K電導在聲音感應細胞的復極化過程中起關鍵作用，KV7.1通道的功能性喪失突變與人類先天性耳聾有關［36，45］。因此，研究相關化合物對KV7通道的調節(jié)作用及分子機制或許對KV7通道相關疾病的治療具有重要幫助。

KV7通道由kcnq基因編碼，每個kcnq基因編碼1個亞基，4個亞基組成同源或異源四聚體，形成具有功能的KV7通道［41，46-47］。一個典型的KV7通道亞基包括6個α螺旋跨膜片段（S1~S6）和胞內的N端和C端［48-49］，4個亞基的S5~S6組成中心孔道區(qū)域（pore domain，PD），S1~S4片段位于中心孔道區(qū)域外側，為電壓敏感結構域（voltage sensitive domain，VSD）（圖2a）［50］。2017年，Mackinnon研究組［50］解析了KV7.1結構；2021年，郭江濤組和陽懷宇組［51］合作解析了KV7.2通道的結構（圖2b）。KV7通道的晶體結構揭示了KV7通道的PD和VSD存在結構域交叉，VSD和相鄰亞基的PD緊鄰在一起，KV7通過沿著VSD中S4片段排布的帶有正電荷的精氨酸（Arg，R）感受細胞膜電位的變化［49］。當細胞膜發(fā)生去極化時，S4片段從細胞膜的底端向上移動［52-54］，S4片段的移動觸發(fā)PD區(qū)域的S6片段組成的門的開放，進而開放KV7的孔道區(qū)域［55-56］。細胞內、外的各種配體，或者輔助亞基蛋白，通過影響S4的移動、通道門的開放，以及兩者之間的相互耦合，進而調節(jié)KV7通道的激活［45］。

Fig. 2 Crystal structure of KV7 channel, binding sites of poly-unsaturated fatty acids to KV7 channel and their effects on channel current圖2 KV7通道晶體結構、多不飽和脂肪酸與KV7通道結合位點及對通道電流的影響

2.2 多不飽和脂肪酸對KV7通道的調節(jié)作用

目前，已有多個研究組在體外同源或異源表達系統中系統研究了多不飽和脂肪酸對KV7通道家族成員的調控作用。這些研究主要通過在細胞外急性施加多不飽和脂肪酸（DHA、EPA、AA、ALA或LA）展開研究，結果表明它們大多可在幾分鐘內達到最大效果［11，57-59］，這表明多不飽和脂肪酸通過直接作用于KV7通道的方式影響KV7通道的功能。

多不飽和脂肪酸對KV7通道家族成員具有較為復雜的調控效果。其中最為明確的調控效果是，在接近靜息電位的負電壓范圍內，多不飽和脂肪酸可以明顯地增大KV7.1通道和KV7.5通道的同源四聚體或者KV7.2+7.3異源四聚體的電流幅值［11，58，60］。除電流幅值之外，也有一部分報道表明，多不飽和脂肪酸還可以改變KV7通道的電壓依賴激活特性，表現為使KV7通道的電導-電壓關系曲線（G-V曲線）向復極化方向移動［11，57-58，60］。但在DHA作用下KV7.4出現了與上述相反的效果，KV7.4通道的G-V曲線出現了向超極化方向移動的現象，并伴隨電流幅度的下降［60］。此外也有研究結果表明，即使在刺激電壓達到最高，KV7通道開放概率達到最大時，多不飽和脂肪酸仍可以增加KV7通道的最大電導［59］。移動電壓門控通道的G-V曲線和增大通道的最大電導，可以使得KV7通道電流在各個電壓范圍內增大（圖2d）。

在現有的研究中，一般7 μmol/L或更高濃度的多不飽和脂肪酸可顯著改變KV7通道的功能。但值得注意的是，前期的一些研究主要是在生理活動范圍以外即更加去極化的電壓區(qū)間內測得的，所以還應謹慎評估多不飽和脂肪酸對電流幅值的實際生理意義。但由于多不飽和脂肪酸普遍改變了KV7通道的電壓依賴特性（Vhalf左移），因此在更接近靜息電位水平的電壓范圍內，其電流也會相應增加。近年來的一些研究，在與生理狀態(tài)更為相關的復極化的電壓條件下，觀測到添加多不飽和脂肪酸使電流幅值增大的現象［11，57-58］。

2.3 多不飽和脂肪酸調控KV7通道的作用靶點和分子機制

對于多不飽和脂肪酸與KV7通道相互作用的分子機制，較為深入的工作主要是在KV7.1通道上開展。目前已明確的KV7.1通道上兩個主要的多不飽和脂肪酸作用位點為“S4位點”和“S6位點”。

作為電壓門控鉀離子通道，KV7.1通道S4跨膜片段中順次排布了多個攜帶正電荷的精氨酸。當細胞膜電位發(fā)生去極化時，通道蛋白通過這些精氨酸感受膜電位的變化，帶動S4螺旋向上移動，進而帶動孔道區(qū)域的構象變化［11，61］。通過將KV7.1通道

S4片段中頂部的兩個精氨酸位點R228和R231突變?yōu)椴粠щ姾傻墓劝滨０罚≦），既影響了多不飽和脂肪酸與KV7.1通道的結合，同時也顯著降低由多不飽和脂肪酸引起的Vhalf移動（圖2c）［11，61-62］。另一方面，通過增加溶液pH值，使得多不飽和脂肪酸頭部去質子化，顯著增加羧酸頭部的極性，或者施加頭部極性更強的多不飽和脂肪酸類似物（DHA-Gly或AA-taurine），均可顯著增強多不飽和脂肪酸調控KV7.1通道電壓依賴特性的能力［63］。這些結果可以有效表明，多不飽和脂肪酸中帶有負電的羧酸頭部結合于胞質外膜一側，與S4片段頂端帶有正電荷的精氨酸形成靜電相互作用，使得KV7.1通道的電壓敏感結構域在膜電位發(fā)生去極化時向上移動發(fā)生易化，使得電壓敏感性增強，改變了電壓激活曲線。這一機制在電壓鉗結合熒光測定中得到進一步證實，通過突變S3-S4上G219C或K218C可產生隨VSD移動而變化的熒光信號變化，表征多不飽和脂肪酸可以易化VSD結構域的移動［11，61］。對于相對特異的KV7.4通道，通過實驗和分子動力學模擬發(fā)現，這種差異與KV7.4通道的S4下半部分的3個精氨酸（R213、R216和R219）有關，DHA通過與S4下半部分的精氨酸相互作用來穩(wěn)定S4的靜止或中間狀態(tài)，從而抑制通道開放。多不飽和脂肪酸可以通過自身頭部負電荷和S4片段上的帶電氨基酸發(fā)生相互作用，并通過極性的強弱調控這種作用，最終影響通道開放過程的后期階段，發(fā)揮門控調節(jié)的作用［60］。

在對S4位點進行突變后，雖然有效消除了多不飽和脂肪酸對KV7.1通道Vhalf的移動，但依然保留其提升KV7.1通道最大電導的影響，這一現象表明，除S4作用位點外，還存在一個多不飽和脂肪酸的作用位點［62］。進一步有研究通過定點突變實驗發(fā)現，將S6片段上的K326位點側鏈所攜帶的正電荷移除之后，這種對最大電導（Gmax）的影響完全消失。多不飽和脂肪酸和K326之間也會形成正負電荷間的靜電相互作用（圖2c）。結合分子動力學模擬研究，發(fā)現在多不飽和脂肪酸的羧基頭部和K326相互作用后，可以改變模擬體系中KV7.1通道離子孔道結構域和相鄰選擇性濾器的構象變化。這一構象變化將促進鉀離子通透性的增加，這也是多不飽和脂肪酸增大KV7.1電導的機制。此外，通過分子對接和分子動力學模擬，并經實驗驗證，研究人員還發(fā)現，除S4和S6上帶正電荷的位點外，S5片段上的Y278可以通過氫鍵和多不飽和脂肪酸發(fā)生相互作用，對多不飽和脂肪酸進入結合區(qū)域發(fā)揮關鍵作用［64］。這些研究表明，多不飽和脂肪酸作用于KV7.1的多個獨立位點。相近的位點在KV7.2和KV7.3上也可以觀察到［59］。

多不飽和脂肪酸對KV7通道功能的調控，還依賴于多不飽和脂肪酸結構的差異［59，62，65］。Liin研究組和Larsson研究組［59］的多項合作研究表明，多不飽和脂肪酸的頭基是影響其效果的關鍵基團，通過將羧酸基團替換為牛磺酸、半胱氨酸、甘氨酸和天冬氨酸可獲得具有差異性激活效果的多不飽和脂肪酸類似物。在他們最新的工作中，進一步合成了具有巨大芳香環(huán)的酪氨酸頭基多不飽和脂肪酸類似物，通過同時作用于多個效應位點，獲得更為顯著的激活效應［65］。這為以多不飽和脂肪酸為前體分子進行針對長QT綜合征藥物的開發(fā)具有重要的現實意義。

2.4 KCNE輔助亞基對多不飽和脂肪酸作用的調節(jié)

除由kcnq基因編碼的主亞基外，KV7家族通道還會和輔助亞基共表達。輔助亞基能夠調控KV7通道的表達、門控等生物物理學特性。KV7通道的輔助亞基由kcne基因編碼，表達KCNE1-5蛋白。生物化學和電生理功能實驗顯示，KCNE輔助亞基具有單跨膜結構，在空間上主要臨近KV7通道的VSD結構域，可與KV7通道形成直接的相互作用。Sun和Mackinnon［66］于2020年解析獲得KCNE與KCNQ通道所組成復合體的晶體結構，該結構揭示，在跨膜界面處，KCNE3亞基嵌入由3個KCNQ1亞基形成的裂縫中。KCNE亞基和KV7通道在多種細胞或組織中均有共定位和共表達，進一步闡釋KCNE共表達如何影響多不飽和脂肪酸對KV7通道的調節(jié)效果具有重要的生理意義。

現有的一些研究提示，當KV7.1和KCNE1共表達時會影響多不飽和脂肪酸的調節(jié)作用，但關于KCNE1的調節(jié)效果存在并不一致的結論。Doolan等［67］的研究顯示，20 μmol/L的DHA可以有效增大KV7.1+KCNE1復合體的電流，但無法改變僅由KV7.1組成的通道電流，這表明對于DHA引起的KV7.1通道電流幅值的增加，KCNE1是必要的成分。而同屬于n-3不飽和脂肪酸的EPA主要減慢了KV7.1+KCNE1的激活動力學特征，并未對電流幅值產生影響［57］。與之相反，Liin等［11，58］的研究則表明，當施加7 μmol/L或更高濃度的DHA后，可以使得KV7.1的Vhalf向復極化方向移動，但當KCNE1與KV7.1共表達時，KCNE1的存在會在很大程度上削減DHA對Vhalf的效果。同時，在Liin的研究中，當KV7.1和KCNE1共表達時，DHA可導致最大電導Gmax的增大［58］。此外，還有研究表明，20 μmol/L DHA或EPA可以顯著增加KV7.1+KCNE1的電流并使Vhalf向復極化方向移動，但是在KV7.1通道上，EPA并未顯現任何效果［57］。目前的研究并未能完全揭示導致上述差異化作用的分子機制，根據已有的結果推測，其原因一方面可能是通道表達系統的差異，在已有研究中，爪蟾卵母細胞表達系統中一般需要更高濃度多不飽和脂肪酸才能激活通道［68］，這可能與爪蟾細胞和哺乳動物細胞（HEK細胞系、COS7細胞系等）的細胞膜脂環(huán)境、脂類代謝等方面具有較大差異有關，另一方面可能是多不飽和脂肪酸的施加方式帶來的差異，相較于單次施加，持續(xù)灌流DHA等多不飽和脂肪酸往往會使電流幅值增大得更顯著［11，59］。除KV7.1外，當KCNE1/KCNE2與KV7.2/KV7.3共表達的時候，則無法進一步影響DHA對Vhalf的作用。

3 多不飽和脂肪酸對BKCa通道的調控及分子機制

3.1 BKCa通道的生理病理功能和基本結構

BKCa通道，也可稱為Slo1，KCa1.1或maxiK通道，是鉀離子通道家族中較為特殊的成員，其顯著特征是電導值>100 pS（通常為250~300 pS）［69］，以及具有細胞內鈣離子結合域，可以因細胞內鈣離子濃度升高和/或細胞膜電位去極化激活［70-72］。由于BKCa通道的電導值顯著高于其他鉀離子通道，BKCa通道的打開會導致大量鉀離子外排，從而使細胞膜電位超極化。因此在大多數細胞中，如神經元、內分泌細胞、平滑肌細胞，其產生的外向鉀離子流可抑制細胞的興奮性，進而發(fā)揮重要的負反饋調節(jié)作用［73-74］。

通過使用特定的BKCa通道激動劑/抑制劑或轉基因小鼠，研究人員已鑒定出BKCa通道在諸多生理或病理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用。在生理功能方面，BKCa通道是參與神經元快速后超極化的重要通道，廣泛分布在中樞神經系統，調節(jié)神經元的放電頻率和神經遞質的釋放［74］；在平滑肌細胞中，BKCa通道的開放會有效降低平滑肌細胞的緊張性，實現對抗血管性高血壓的功能［75］；在內分泌細胞中，BKCa通道則直接參與激素分泌的調控［76］。除此之外，BKCa通道還參與肌肉疲勞、心臟節(jié)律、晝夜節(jié)律以及酒精耐受等諸多生理功能的調控［74，77-78］。當BKCa通道的功能異常時，則會引發(fā)一些病理性改變。在心血管系統中，BKCa通道的功能障礙會引起膜超極化，使血管收縮減少和血管松弛，導致高血壓、糖尿病等疾病［79］；在神經系統中，BKCa通道的功能獲得性突變體通過加速尖峰復極化和增強動作電位后超極化幅度來促進高頻放電，導致全面性癲癇、陣發(fā)性運動障礙［74］；與之相反，在視交叉上核神經元中，BKCa通道的電流會隨著年齡的增長而減弱，從而使動作電位后超極化幅度減弱，導致老年人的晝夜節(jié)律調節(jié)能力下降［80］。因此探究BKCa通道的調節(jié)機制、尋找對BKCa通道具有調節(jié)作用的化合物具有重要意義。

BKCa通道的α亞基由單一基因（kcnma1，slo1）編碼，可通過選擇性剪切、轉錄后翻譯以及內源性信號分子的功能性調制調節(jié)其功能。根據冷凍電鏡解析得到的通道結構，BKCa通道每一個α亞基主要包含3個結構域，其中跨膜部分由7個跨膜片段（S0~S6）組成。和典型的電壓門控鉀離子通道類似，BKCa通道的S1~S4構成負責感受膜電位變化的電壓敏感結構域（VSD）［81］，S5-P-S6構成介導鉀離子通過的孔道門控結構域（PD），區(qū)別于典型的6跨膜（6TM）鉀離子通道，S0片段為BKCa通道所特有。BKCa通道的細胞內部分為負責感受細胞二價陽離子（Ca2+/Mg2+）的細胞內區(qū)域（cytoplasmic domain，CTD）［82］（圖3a，b）。

Fig. 3 Structure of BKCa channels, action sites of poly-unsaturated fatty acids and regulatory mechanisms圖3 BKCa通道的結構及多不飽和脂肪酸作用位點與調控機制

不同于其他鉀離子通道典型的交叉束門控方式，BKCa通道的VSD和PD沒有形成結構域交叉，S4~S5之間的連接片段非常短，不具有KV通道的S4~S5鉸鏈片段，因此無法使用交叉束門控?，F有的電生理和藥理學實驗充分證明BKCa通道是采用選擇性濾器門控方式控制通道的開放和關閉［83-84］。通過精確分析BKCa通道的開放-關閉參數以及激活-失活動力學參數等電生理數據，Horrigan和Aldrich［70］提出HA模型（Horrigan-Aldrich model），HA模型通過經典概率模型描述BKCa通道門控過程的動力學特征，通過數學模型，解釋了BKCa通道VSD和CTD與PGD區(qū)域間的功能耦合特征，并在后續(xù)的研究中表明其可靠性［85］，是目前主流的BKCa通道動力學功能模型（圖3f）。結合HA模型，通過在較大尺度上分析BKCa通道結構-功能關系，目前可知PD是BKCa通道實現選擇性濾器門控的核心區(qū)域，CTD和VSD通過變構耦合，易化PD區(qū)域的構象變化。即細胞內鈣離子濃度和細胞膜去極化水平的增加可以提高BKCa通道的開放概率，但二者都不是通道開放的必要條件，BKCa通道僅通過PD構型變化即可實現通道的開放和關閉狀態(tài)轉換［86］。

3.2 多不飽和脂肪酸對BKCa通道的調節(jié)作用

BKCa通道因其具有高電導率，是各組織中控制靜息膜電位的關鍵通道。由于人血漿中的游離多不飽和脂肪酸濃度在微摩爾每升水平［87］，所以多數時候正常生理狀態(tài)下的多不飽和脂肪酸水平即可對BKCa通道具有相應的調節(jié)作用，進而對生理活動產生一定的影響，如心血管系統中對血壓的影響、神經系統中對神經元興奮性或神經免疫的影響等［88-89］，因此研究多不飽和脂肪酸對BKCa通道的調節(jié)作用具有重要意義。已有多項研究表明，DHA、AA等多不飽和脂肪酸可以間接或直接激活各種天然細胞中的BKCa通道［89-90］，通過增加鉀離子外流，減少鈣離子內流，加速細胞膜電位的復極化，從而產生有利的生理狀態(tài)改變［89］。一些研究結果顯示，多不飽和脂肪酸通過多種機制激活BKCa通道，如Qian等［91］發(fā)現，低濃度DHA（<1 μmol/L）可在CYP環(huán)氧合酶代謝物介導下，激活BKCa通道，而當濃度上升到微摩爾后，DHA可直接激活BKCa，無需CYP環(huán)氧合酶代謝物的介導。此外，DHA還可以通過磷脂酶C-肌醇三磷酸-Ca2+

信號通路激活BKCa通道。另外一些研究通過異源表達系統也明確顯示BKCa通道可被多不飽和脂肪酸直接激活。多個研究組的工作表明，AA可以通過直接作用激活表達于血管平滑肌或HEK細胞上的BKCa通道，在施加生理濃度（~10 μmol/L）的AA后，通道電流顯著增大，同時Vhalf向復極化方向移動［92-93］。而Hoshi組［94-96］的工作主要表明，在施加飽和濃度（~3 μmol/L）的DHA后，表達于HEK細胞的BKCa通道電流可被增大6~10倍，Vhalf向復極化方向大幅移動。這些研究表明，無論是ω-3或ω-6不飽和脂肪酸，均會對BKCa通道產生明顯地正向調節(jié)作用。

3.3 多不飽和脂肪酸調控BKCa通道的作用靶點和分子機制

目前，已有一些研究對多不飽和脂肪酸作用于BKCa通道的機制與分子靶點進行了較為深入的研究。Hoshi等［95］的研究表明，在體外表達的BKCa通道上，DHA可以增大BKCa通道的電流幅值，使通道的G-V曲線向復極化方向移動。而進一步通過在超極化電壓條件下記錄的BKCa單通道開放概率表明，在將電壓感受結構域置于靜息狀態(tài)時，DHA依然可以有效增加BKCa通道的開放概率，但并不改變通道的電導值（圖3e，g）。借助HA模型可以表明，DHA主要增大了表征PD結構域核心孔道門控的關鍵參數L0，導致通道關閉態(tài)能量的降低，進而使得通道的關閉態(tài)更不穩(wěn)定，更容易由關閉態(tài)轉換到開放態(tài)［86］。HA模型數值模擬表明上述機制是DHA激活BKCa通道的主要或唯一機制。Hoshi等［97］在后續(xù)研究中，進一步通過將BKCa通道胞內結構域整體移除，證實僅跨膜結構域即可響應DHA對BKCa通道的全部作用效果。利用構建的人-果蠅BKCa通道功能性嵌合體開展的電生理實驗表明，人源BKCa通道PD的S5-P loop-S6片段是響應多不飽和脂肪酸的關鍵區(qū)域。進一步通過對S5-P loop-S6片段中差異化氨基酸進行定點突變掃描，鑒定出S6片段上318位的酪氨酸是與多不飽和脂肪酸相互作用的唯一位點，這也與前述HA模型的模擬相互吻合，即多不飽和脂肪酸通過和PD區(qū)域上Y318形成相互作用調節(jié)BKCa通道核心的選擇性濾器門控過程（圖3c，d）。這一結論與后續(xù)Martin等［93］在AA和BKCa通道的相互作用機制的結果也相互印證。

為進一步闡明多不飽和脂肪酸與BKCa通道之間的相互作用，Tian等［96］進行了更為深入的研究。結果表明，以DHA為代表的多不飽和脂肪酸通過帶負極性的羧酸頭部和Y318的羥基形成離子-偶極間的相互作用。通過提高溶液pH，使羧酸頭部處于去質子化狀態(tài)或通過人工合成構建具有更低pKa頭部的DHA類似物，都可以顯著增強多不飽和脂肪酸的作用效果。而通過對BKCa通道318位的定點突變和引入極性特征更為可控的人工氨基酸，可進一步明確318位點的酪氨酸所攜帶的極性羥基是BKCa通道參與和多不飽和脂肪酸相互作用的關鍵基團。此外，研究還進一步明確了多不飽和脂肪酸的親和力與其碳鏈的長短間的重要關系，碳鏈尾部越長則親和力越高，而碳鏈尾部上雙鍵的數目、位置和羥基化修飾也對其效果具有重要影響。但這一系列研究并未完全解釋多不飽和脂肪酸和Y318位點形成相互作用后BKCa通道的選擇性濾器門控如何改變，以及多不飽和脂肪酸如何結合于BKCa通道的相關區(qū)域。

3.4 BKCa通道輔助亞基對多不飽和脂肪酸作用的調節(jié)

除α亞基外，不同的輔助亞基也可以通過影響B(tài)KCa通道的門控過程顯著地改變其電生理特性和藥理學特性。BKCa通道的附屬亞基包括4種具有兩跨膜結構（2TM）的β亞基（β1~β4）和4種具有單跨膜結構（1TM）的γ亞基（γ1~γ4）。這些附屬亞基具有高度組織特異性，這也是完整的BKCa通道（α+β/γ）復合體具有多樣的生理功能的分子和結構基礎［98］。例如，β1/4亞基可以顯著增加Ca2+敏感性、增加PD關閉構象的穩(wěn)定性并減慢通道激活和去激活動力學過程［99］。β2亞基改變了VSD和PD的耦合程度，同時使BKCa通道具有N-型失活（N-type inactivation）的特征［100］。

現有的研究表明，多不飽和脂肪酸對BKCa通道的調控高度依賴于輔助亞基。當β1或β4亞基存在時，多不飽和脂肪酸會顯著增大激活BKCa通道的效能，通過對單通道記錄的分析以及HA模型擬合，可以確定β1或β4亞基存在不改變多不飽和脂肪酸減弱BKCa通道關閉穩(wěn)定性的機制，而使得這種作用進一步增大（L0由3倍左右的增加變?yōu)?0倍以上的增加），即β1/4亞基起到多不飽和脂肪酸效果“放大器”的作用。通過定點突變研究，發(fā)現β1/β4亞基上N端的β1 R11-C18和β4 E12-R19對這一效果的產生至關重要，需要兩個位點分別攜帶具有相反電荷的氨基酸，當其中一個位點被移除電荷后，其“放大”多不飽和脂肪酸激活作用的效應則顯著降低甚至消失（圖3c）［94］。而β2亞基對多不飽和脂肪酸的調控則具有更復雜的特征，DHA和AA在作用于BKCa通道和β2亞基共表達的復合物后，具有差異性效果［93-94］。

但更為深入的分子機制，即β1/β4亞基上N端如何發(fā)揮了“放大器”的效果，目前都未能進一步闡明。由于BKCa通道輔助亞基表達具有組織和細胞特異性的特點，多不飽和脂肪酸具有開發(fā)成為靶向激動劑的潛力，同時也提示其在細胞內的作用形式可能也具有差異性。由于有關機制尚不明了，相關應用受到較大限制。

4 總結與展望

綜上所述，KV7和BKCa通道作為廣泛表達于生物體內的鉀離子通道，在各種組織中通過調節(jié)細胞的興奮性參與多種生理過程。它們的功能異常也可能導致多種病理過程的發(fā)生。多不飽和脂肪酸中帶負電荷的頭部基團能夠直接與KV7和BKCa通道中帶正電氨基酸殘基發(fā)生靜電相互作用，從而調節(jié)通道的開放狀態(tài)，這使其有望在許多疾病尤其是心血管疾病的藥物治療過程中發(fā)揮重要作用。例如，多不飽和脂肪酸可通過影響KV7.1通道VSD結構域的移動來恢復心律失常心肌細胞的節(jié)律性放電，從而縮短豚鼠心臟的QT間期［11］。DHA通過作用于BKCa通道Y318位點側鏈周圍的相互作用口袋激活BKCa通道，使肺動脈高壓患者血管張力恢復到健康受試者水平［101］?？傊嗖伙柡椭舅峒捌涠喾N類似物由于其頭部帶電基團或尾部長短、雙鍵位置和數量的不同，對KV7和BKCa通道電流具有不同的調控效果。因此，通過使用不同種類的多不飽和脂肪酸或者根據調控規(guī)律設計更有效的多不飽和脂肪酸類似物來調控KV7和BKCa通道的開放，對于高血壓、心臟節(jié)律異常等心血管疾病的預防或治療具有重大幫助。

多不飽和脂肪酸除作為營養(yǎng)成分外，其作為信號分子對各類生理過程的調控作用和機制已受到越來越多的重視。離子通道作為多不飽和脂肪酸重要的作用靶點，深入研究其與多不飽和脂肪酸相互作用的結構基礎、分子機制和生物物理機制對更全面地了解多不飽和脂肪酸的生理或病理作用，以及藥物開發(fā)具有重要意義。不同于常見的小分子物質，多不飽和脂肪酸具有柔性可變的碳鏈尾部以及和細胞膜脂的相溶特征，使其作用于通道蛋白的形式區(qū)別于以往的“配體-口袋”結合形式，這使得相應的研究需要借助結構生物學、計算生物學、分子生物學以及電生理記錄等多技術手段探索細胞膜脂質成分和通道蛋白交互作用的機制。雖然已有眾多研究組在這一方向開展研究，但目前依然只能針對各個通道開展特定研究，未能形成系統性技術路徑，也未能在更為深入的分子層面對相關多不飽和脂肪酸對離子通道的調控進行解析。

本文結合作者之前的研究工作，對具有重要生理功能，且相關作用機制已研究較為全面和有深度的KV7和BKCa通道進行了綜述。期望本綜述能對未來更多多不飽和脂肪酸調節(jié)離子通道的機制研究提供參考和借鑒，對認識多不飽和脂肪酸的作用和開發(fā)以多不飽和脂肪酸為結構基礎的離子通道激動劑/抑制劑提供思路。