童艷梅， 陳秀荔， 胡庭俊， 劉青云,3， 李強(qiáng)勇,3， 馮鵬霏，楊春玲， 彭 敏， 朱威霖， 潘傳燕， 曾地剛， 趙永貞,3*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021；3. 廣西蝦類繁育工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530021)

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)屬于綠藻門(Chlorophyta)羽藻目(Bryopsidophyceae)蕨藻科(Caulerpaceae)蕨藻屬(Caulerpa)，是一種多年生大型可食用海藻，因其直立莖球狀體晶瑩剔透、圓潤(rùn)飽滿似葡萄，且藻體軟嫩多汁，口感如魚子醬般豐富，又有“海葡萄”和“綠色魚子醬”的美稱[1]。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，含人體所需的多種氨基酸、維生素、多糖和脂肪酸等，是最符合人類食用的蕨藻之一[2]。研究表明，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的粗多糖含量占干重的34.00%～64.97%[2-8]，高于絕大部分的可食用海藻，如馬尾藻(Scagassum)、羊棲菜(Hizikia fusifarme)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)[9]等，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的提取方式主要有水提取法、堿提取法和超聲波輔助提取法等方法，其提取率為3.22%～11.30%[10-14]，表明仍有大量的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖未被完全提取。王小兵等[15]采用速溶劑萃取技術(shù)(ASE)提取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖，多糖提取率能達(dá)到51.03%，但該方法對(duì)儀器條件的要求較苛刻，成本較高。因此，研發(fā)一種溫和、高效、低成本的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取工藝對(duì)于促進(jìn)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大。

酶解法是近年來(lái)使用最為廣泛的植物多糖提取方法，鄭朝陽(yáng)等[16]研究表明，木瓜蛋白酶能水解植物中的游離蛋白質(zhì)，減少多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而有效提高多糖提取率。為此，本研究將木瓜蛋白酶酶解法與目前已有的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取方法進(jìn)行對(duì)比篩選，確定提取多糖的最佳方法，并采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，同時(shí)也探究了長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的抗氧化活性，以期為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藥物 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻鮮藻委托杭州牧海食品經(jīng)營(yíng)有限公司從越南芽莊購(gòu)入。

主要試劑 木瓜蛋白酶(G8431)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品(SD9360)、2,2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-硫酸)二銨鹽(SA5340)，北京索來(lái)寶科技有限公司。NaOH (天津博迪化工有限公司，批號(hào)：2019年8月23日)。正丁醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：2020年9月25日)。

主要儀器 恒溫水浴鍋(英國(guó)，Grant SUB6)，電磁爐(九陽(yáng)，JYC-19BE5)，高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德，Centrifuge 5810R)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA)，冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ， ALPHA 1-4 LD plus)，電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司，ESJ110-48)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9240A)，高速度功能粉碎機(jī)(永康市云達(dá)機(jī)械設(shè)備廠，JR-200)，酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，DNM-9602G)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

制備長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末 用海水清洗長(zhǎng)莖葡萄蕨藻，然后用蒸餾水再洗滌3次，并在50 ℃的烘箱中干燥，隨后粉碎過50目藥典篩，并保存在干燥器中備用，按藥典方法測(cè)定水分。

篩選提取方法 根據(jù)已有文獻(xiàn)公布的研究方法，分別嘗試5種不同的提取方法提取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粗多糖(表1)，根據(jù)多糖提取率、成本、便捷及可行性確定用于本研究的基礎(chǔ)方法。

表1 五種提取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粗多糖方法的簡(jiǎn)要流程Tab. 1 Summaries of five methods for extracting polysaccharides from C. lentillifera

按上述簡(jiǎn)要流程，具體方法如下。

①取308 g新鮮長(zhǎng)莖葡萄蕨藻(通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知10 g藻粉=308 g鮮藻)洗凈，手動(dòng)榨汁得到的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻汁并加入5倍的95%乙醇，4 ℃醇沉12 h。3 500×g離心15 min棄去上層乙醇，收集沉淀溶解在50 mL蒸餾水中，棄去不溶性雜質(zhì)，冷凍干燥36 h后收集多糖并稱重，記為組1。

②取10 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末加入200 mL蒸餾水，在60 ℃下提取2 h。提取結(jié)束后3 500×g離心15 min收集上清液。將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃負(fù)壓濃縮，得到10 mL濃縮提取液，加入5倍的95%乙醇，4 ℃醇沉12 h。3 500×g離心15 min棄去上層乙醇，收集沉淀溶解在50 mL蒸餾水中，棄去不溶性雜質(zhì)，冷凍干燥36 h后收集多糖并稱重，記為組2。

③ (多糖提取和醇沉步驟同②)，3 500×g離心15 min棄去上層乙醇，收集沉淀溶解在50 mL蒸餾水中，加入Sevege試劑(氯仿：正丁醇為4∶1，體積比，現(xiàn)配現(xiàn)用)，多糖溶液與Sevege體積比為4∶1，置于分液漏斗中，劇烈振蕩15 min，靜置30 min，棄去蛋白質(zhì)層和有機(jī)溶劑層，重復(fù)以上操作，直至無(wú)蛋白質(zhì)出現(xiàn)。冷凍干燥36 h后收集多糖并稱重，記為組3。

④取10 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末加入200 mL蒸餾水，加入質(zhì)量濃度為0.5%的木瓜蛋白酶，在60 ℃下提取2 h，pH為6。提取結(jié)束后沸水滅酶5 min，3 500×g離心15 min收集上清液。將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃負(fù)壓濃縮，得到10 mL濃縮提取液，加入5倍的95%乙醇，4 ℃醇沉12 h。3 500×g離心15 min棄去上層乙醇，收集沉淀溶解在50 mL蒸餾水中，棄去不溶性雜質(zhì)，冷凍干燥36 h后收集多糖并稱重，記為組4。

⑤取10 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末加入200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaOH溶液中，在60 ℃下提取5 h。提取后3 500×g離心15 min收集上清液，將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃負(fù)壓濃縮，得到10 mL濃縮提取液，加入5倍的95%乙醇，4 ℃醇沉12 h。3 500×g離心15 min棄去上層乙醇，收集沉淀溶解在50 mL蒸餾水中，棄去不溶性雜質(zhì)，冷凍干燥36 h后收集多糖并稱重，記為組5。

單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定使用方法④提取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖，即木瓜蛋白酶酶解法。按照上述方法，探究料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取溫度(30、40、50、60和70 ℃)、提取時(shí)間(1、2、3、4和5 h)、木瓜蛋白酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、提取次數(shù)(1、2、3和4次)，這5個(gè)因素對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取的影響。

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理，選擇料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)為自變量，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的提取率(Y)為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert. V 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析，得到長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取的最佳工藝參數(shù)。

多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱量10 mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖置于100 mL容量瓶中定容。取7支具塞玻璃試管，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mL的葡萄糖溶液，用蒸餾水補(bǔ)足體積至1.0 mL，充分混勻后迅速置于冰浴中冷卻5 min。取出后加入4 mL現(xiàn)配的0.2%蒽酮硫酸溶液，搖勻，立即置于沸水浴中煮沸10 min。取出，冷卻至室溫，在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量(μg)為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.003 4x+0.084 1，R2=0.999 2。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的測(cè)定 將長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粗多糖溶解于蒸餾水中，并將濃度調(diào)整至適合測(cè)定的范圍。精確吸取1.0 mL于具塞玻璃試管中，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，在620 nm處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度，再按照式(1)計(jì)算長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品中的多糖提取率(D，%)：

式中，N代表多糖濃度(g/mL)，V代表待測(cè)體積(mL)，n代表稀釋倍數(shù)，L代表多糖得率，M代表多糖樣品的質(zhì)量(g)。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì) ABTS 自由基清除能力的測(cè)定 取ABTS二銨鹽40.7 mg，加蒸餾水定容至10 mL，配置成7.4 mmol/L的ABTS二銨鹽儲(chǔ)備液。再取K2S2O87 mg，加蒸餾水定容至10 mL，配置成2.6 mmol/L的過二硫酸鉀儲(chǔ)備液。將上述兩種儲(chǔ)備液各取1 mL混合，黑暗環(huán)境下室溫放置12 h，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液將混合液稀釋10～20倍，直至吸光度為0.70±0.02，此溶液即為ABTS自由基工作液。精確稱取5 mg維生素C于容量瓶中，用超純水溶解后定容至100 mL，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成濃度為20.84 μg/mL的陽(yáng)性對(duì)照溶液。準(zhǔn)確吸取不同體積的待測(cè)樣品溶液于96微孔板中，再加入100 μL的ABTS工作液，用純水補(bǔ)足體積至200 μL，振搖10 s以充分混勻后靜置6 min。調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為734 nm測(cè)吸光度，記為Asample；空白組以等體積的純水代替ABTS工作液，記為Ablank；對(duì)照組以等體積的純水代替樣品溶液，記為Acontrol。清除率計(jì)算同式(2)。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定 稱取4 mg DPPH固體試劑，95%乙醇溶解并定容至100 mL，配為40 μg/mL溶液，避光保存?zhèn)溆?。精確稱取5 mg維生素C置于容量瓶中，用超純水溶解后定容至100 mL，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋配制成濃度為20.84 μg/mL的陽(yáng)性對(duì)照溶液。準(zhǔn)確吸取不同體積待測(cè)樣品溶液于96微孔板中，再加入100 μL的DPPH溶液，輕輕混勻后用95%乙醇補(bǔ)足體積至250 μL，避光反應(yīng)30 min。調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)515 nm測(cè)吸光度，記為Asample；空白組以等體積的純水代替DPPH溶液，記為Ablank；對(duì)照組以等體積的純水代替樣品溶液，記為Acontrol。清除率按下式計(jì)算：

2 結(jié)果

2.1 篩選提取方法

1～5組長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率分別為0.72%、2.44%、3.69%、8.55%和3.32%，其中組4的提取率最高，且操作較為簡(jiǎn)便(圖1)。因此，綜合提取效率、操作便捷性以及多糖提取率等因素，確定以組4作為提取方法進(jìn)行工藝優(yōu)化，即使用木瓜蛋白酶酶解法提取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖。

圖1 不同提取方法對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響1.鮮藻提取組，2.普通水提取組，3. sevege試劑處理提取組，4.添加木瓜蛋白酶提取組，5. NaOH堿提取組。Fig. 1 Effects of different extraction methods on the extraction rate of polysaccharides from C. lentillifera1. the fresh algae extraction group, 2. the water extraction group, 3. the sevege reagent treatment group, 4. the papain group, 5. the NaOH extraction group.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

料液比對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響 當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率達(dá)到最大，之后隨著料液比的増高而降低(圖2-a)，因此將1∶40作為最佳料液比條件。

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Single factor test results

提取溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響 當(dāng)溫度小于50 ℃時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率隨著溫度的升高而增加(圖2-b)，溫度為50 ℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到頂峰，隨溫度的升高而逐漸降低。因此，選擇最佳的提取溫度為50 ℃。

提取時(shí)間對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響 隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率逐漸增加(圖2-c)。但提取時(shí)間超過3 h后，多糖提取率降低。因此選擇最佳的提取時(shí)間為3 h。

木瓜蛋白酶添加量對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響 隨著木瓜蛋白酶添加量的增多，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率呈上升趨勢(shì)(圖2-d)。在添加量達(dá)到2.0%之后，多糖提取率趨于平穩(wěn)，因此為了控制成本，確定最佳的木瓜蛋白酶添加量為2.0%。

提取次數(shù)對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響 提取次數(shù)提升至2次時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率明顯增高(圖2-e)。當(dāng)提取次數(shù)大于2次后，多糖提取率略有降低且基本保持不變。因此，為了節(jié)約成本，提高效率，提取次數(shù)確定為2次。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定木瓜蛋白酶添加量為2.0%，提取次數(shù)為2次。隨后應(yīng)用Design-Expert. V 8.0.6軟件探究料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 2 Response surface design and results

建立回歸方程方差分析 利用Design-Expert. V 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次項(xiàng)回歸方程：

式中，Y為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率，A、B和C分別代表料液比、提取時(shí)間和提取溫度。

方差分析 為了檢驗(yàn)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取工藝回歸模型的有效性，對(duì)該模型進(jìn)行方差分析(表3)?；貧w模型P＜0.000 1，表明該回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。矯正系數(shù)R2(Adj)=0.956 8，表明實(shí)驗(yàn)誤差小，準(zhǔn)確度高。模型確定系數(shù)R2=0.981 1，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2(Pred)=0.950 6，二者的數(shù)值接近，說明偏差在合理范圍之內(nèi)，實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的擬合度程度較好，二者有高度相關(guān)性。失擬項(xiàng)P=0.953 0＞0.05，結(jié)果不顯著，說明選擇的模型對(duì)該實(shí)驗(yàn)的擬合性良好。變異系數(shù) C.V.%為3.16%，反映了模型具有較高的穩(wěn)定性和可信度。信噪比(Adeq Precisior)為17.222，大于臨界值4，表明模型的準(zhǔn)確度高。以上指標(biāo)均表明，可采用該擬合回歸方程對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

表3 響應(yīng)面二次模型多糖得率的方差和回歸系數(shù)分析Tab. 3 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model

自變量對(duì)多糖提取率的影響程度 該回歸模型中的自變量一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率有顯著影響(P＜0.05)。由F值可知，三個(gè)因素對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響程度的大小順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。

響應(yīng)面分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 曲線的走勢(shì)越陡，說明該因素對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的提取率影響越大，曲線的走勢(shì)越平緩則說明該因素對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響越小。對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率影響最大的因素為料液比，其次為提取溫度和提取時(shí)間(圖3～圖5)，這與表3中的分析結(jié)果相一致。由回歸模型預(yù)測(cè)的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶44.77，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間3.08 h，木瓜蛋白酶添加量2.0%，提取次數(shù)2次，最大提取率預(yù)測(cè)值為41.41%。為了方便操作，將優(yōu)化的條件改為料液比1∶45，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間3 h，木瓜蛋白酶添加量2.0%，提取次數(shù)2次。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的提取率為41.24%±0.09%，這和預(yù)測(cè)值較接近，因此該模型可較好地預(yù)測(cè)和模擬長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的產(chǎn)率及最佳的提取工藝。

圖3 料液比與提取時(shí)間對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響(a)響應(yīng)面圖，(b)等高線圖，下同。Fig. 3 Effects of material/solution ratio and extraction time on the extraction rate of polysaccharides from C. lentillifera(a) response surface figure, (b) contour figure, the same below.

圖4 料液比與提取溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響Fig. 4 Effects of material/solution ratio and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides from C. lentillifera

圖5 提取時(shí)間與提取溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響Fig. 5 Effects of extraction time and temperature on the extraction rate of polysaccharides from C. lentillifera

2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用 隨著長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖濃度的升高，對(duì)DPPH自由基的清除能力也不斷增強(qiáng)(圖6)。當(dāng)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的濃度為3.00 mg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率達(dá)到52.98%，且隨著多糖濃度的升高該清除率不再增加，維生素C和長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的IC50分別為7.38 μg/mL和2.32 mg/mL，說明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，但清除率較差。

圖6 對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig. 6 Scavenging effect on DPPH free radicals

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用 隨著長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖濃度的升高，對(duì)ABTS自由基的清除率也不斷增加(圖7)。當(dāng)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖濃度為2.00 mg/mL時(shí)，ABTS的清除率達(dá)到93.8%，且不再隨多糖濃度的增加而升高，維生素C和長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的IC50分別為7.07 μg/mL和0.67 mg/mL，說明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì)ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除作用。

圖7 對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig. 7 Scavenging effect on ABTS free radicals

3 討論

植物中的多糖常與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，因此用傳統(tǒng)的水提取法不易完全提取。木瓜蛋白酶是一種含巰基肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，能水解長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中的游離蛋白和結(jié)合蛋白，減少多糖與蛋白的結(jié)合，增加植物多糖的溶出[16]。

本研究在前人的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，嘗試了5種不同的提取方法，以期探索高效提取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的制備工藝。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖1)，組1的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率僅為0.72%，這表明采用普通的物理處理方法無(wú)法完全破壞植物細(xì)胞，大量多糖仍未溶出。組2多糖水提取后不經(jīng)過任何處理，提取率為2.44%，可能是由于此方法提取的多糖中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量高，導(dǎo)致多糖濃度低，提取率隨之下降。組3多糖在水提取后采用sevege試劑除蛋白，提取率高于組2，但此法操作過程中蛋白質(zhì)多出現(xiàn)在兩液面交界處，分離時(shí)多糖損耗較大，且需要取多糖層多次進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，操作較為繁瑣。組4多糖的提取率最高，達(dá)到8.55%，相比于組3的sevege試劑法，此組添加木瓜蛋白酶能在提取過程中一并水解植物細(xì)胞膜中的結(jié)合蛋白，從而更大限度地使長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖溶出，且反應(yīng)溫和易操作。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖是酸性多糖，因此組5采用堿提取法，但此法會(huì)溶出大量色素，導(dǎo)致多糖濃度降低，故使用此法時(shí)需提前將藻粉進(jìn)行除色素處理。因此，綜合提取效率、操作便捷性以及多糖提取率等因素，本研究確定以木瓜蛋白酶酶解法作為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的基礎(chǔ)提取方法并進(jìn)行工藝優(yōu)化。

由式(1)可知，多糖提取率主要取決于多糖得率和多糖濃度，因此優(yōu)化長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取工藝需重點(diǎn)從這兩方面著手。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的含水量可達(dá)96.76%，高含水量的特性導(dǎo)致長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的干燥藻粉具有一定的吸水性。因此，在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，過低的料液比會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)莖葡萄蕨藻藻粉無(wú)法完全溶于水中，溶液呈米糊狀且接近飽和，多糖可溶出空間變小，從而降低多糖提取率。另一方面，過高的料液比會(huì)使雜質(zhì)含量增高，多糖濃度降低，也不利于提高多糖提取率(圖2-a)。溫度是酶能否充分發(fā)揮活性的重要因素，當(dāng)提取溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，木瓜蛋白酶達(dá)到最適作用溫度，酶與底物完全接觸反應(yīng)，多糖提取率達(dá)到頂峰。溫度大于50 ℃時(shí)，酶結(jié)構(gòu)在高溫下被破壞，酶活性隨著溫度的升高而降低，多糖提取率也隨之逐漸降低(圖2-b)。在其他因素固定的情況下，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率在提取時(shí)間為3 h時(shí)最高，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，其原因可能由于提取時(shí)間過長(zhǎng)而導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的改變或者糖苷鍵的裂解(圖2-c)。木瓜蛋白酶添加量是控制工藝成本的重要因素之一，當(dāng)酶用量剛好與反應(yīng)底物完全結(jié)合時(shí)，即為酶的最適用量。本次實(shí)驗(yàn)中，木瓜蛋白酶添加量達(dá)到2.0%之后，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率趨于平穩(wěn)，表明木瓜蛋白酶濃度已飽和，即最適添加量為2.0% (圖2-d)。此外，適當(dāng)增加提取次數(shù)能提高藻粉利用率、降低工藝成本、并大幅提高多糖提取率。當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率明顯提高了2.2%，隨后趨于平穩(wěn)，表明該工藝的最佳提取次數(shù)為2次(圖2-e)。

單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的前提是假定各因素間沒有交互作用，但在實(shí)際問題中，各因素相互獨(dú)立的情況是極為少見的，因此研究因素間的交互作用尤為重要[19]。考慮到成本與實(shí)際可行性，實(shí)驗(yàn)將木瓜蛋白酶添加量和提取次數(shù)分別固定為2.0%和2次，并應(yīng)用Design-Expert. V 8.0.6軟件探究料液比、提取時(shí)間和提取溫度三因素間的相互作用。方差分析中模型的P＜0.000 1，表明本研究建立的回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各項(xiàng)系數(shù)均反映該模型具有較高的穩(wěn)定性和可信度。F值、響應(yīng)面圖和等高線圖的結(jié)果顯示，料液比對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取率的影響最大，這可能也與長(zhǎng)莖葡萄蕨藻藻粉具有吸水的特性有關(guān)。通過該回歸模型預(yù)測(cè)的提取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖最佳工藝為料液比1∶45、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間3 h、木瓜蛋白酶添加量2.0%，在此條件下，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的實(shí)際提取率為41.24%，與理論值相差0.17%，表明該模型可較好地預(yù)測(cè)和模擬長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的產(chǎn)率及最佳的提取工藝。王小兵等[15]采用ASE技術(shù)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的多糖提取率可達(dá)到51.03%，高于本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際提取率。究其原因：一是長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的產(chǎn)地具有差異，王小兵等[15]采用的實(shí)驗(yàn)材料取自海南，而本實(shí)驗(yàn)的藻體取自越南芽莊，不同地區(qū)的光照、水體鹽度等因素具有差異性，從而導(dǎo)致不同地區(qū)藻體積累的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)含量具有差異[20]。二是兩者對(duì)鮮藻的干燥方式有差異。有研究表明，在其他因素相同的情況下，冷凍干燥處理的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中活性物質(zhì)的含量明顯高于熱風(fēng)干燥處理[7]。三是兩者提取方式有差異。王小兵等[15]采用的加速溶劑萃取儀能快速地將萃取物從基質(zhì)活性部位解吸出來(lái)，大大提高多糖提取率，但此法需要高溫高壓的條件，成本高，不利于大規(guī)模投產(chǎn)。

此外，本實(shí)驗(yàn)還探究了長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)該多糖對(duì)DPPH和ABTS清除率的IC50分別為2.32和0.67 mg/mL，最高清除率分別可達(dá)52.98%和93.80%，表明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì)ABTS的清除作用優(yōu)于DPPH。但宋偉康[10]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用弱于DPPH，與本研究的結(jié)果相反，其原因可能是二者的提取方法有差異，從而導(dǎo)致多糖產(chǎn)物的活性不同。

綜上，本研究為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)，后續(xù)將探究該酶解法提取的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的分子結(jié)構(gòu)，闡明木瓜蛋白酶對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖結(jié)構(gòu)和活性功能的影響，以期促進(jìn)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多糖的深度開發(fā)利用。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）