于良君，何友盛，姚 智

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 學報編輯部，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，云南 昆明 650201；3.云南大學 資源植物研究院/農(nóng)學院，云南 昆明 650504)

嗜魚外瓶霉(Exophiala pisciphila)是一種對重金屬離子具有極強耐性和富集能力的深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes，DSE)，其產(chǎn)孢方式以環(huán)痕產(chǎn)孢為主，具有典型的橫隔膜和微菌核結(jié)構(gòu)[1]。在魚類(Piscis)、狗(Canis lupus familiaris)、馬(Equus caballus)和甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)蟲卵的動物宿主體表以及桉樹(Eucalyptus robustaSmith)、豌豆(Pisum sativumL.)和小麥(Triticum aestivumL.)等植物根際土壤中可以分離獲得嗜魚外瓶霉[2]。張玉潔等[3]從云南會澤鉛鋅礦區(qū)自然生長的植物密序野古草[Arundinella bengalensis(Spreng.) Druce)]健康根內(nèi)分離得到1 株嗜魚外瓶霉，并發(fā)現(xiàn)該菌對鉛、鋅、鎘和銅等重金屬離子具有極強的耐性和富集能力。接種試驗發(fā)現(xiàn)：嗜魚外瓶霉可以強化玉米根系對毒性重金屬離子的固持作用，提高宿主植物對鎘的耐受性[4]；還可將不溶性無機磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸根(PO43-)，促進宿主植株對磷的吸收[5]?？梢?，嗜魚外瓶霉在增強植物重金屬耐受性和治理土壤重金屬污染等方面有巨大的研究價值。

鈣離子是一種具有生理活性的二價陽離子，對真菌生長代謝具有重要影響。外源施用鈣可以提高真菌對重金屬離子的耐性，如：外源添加鈣離子可顯著緩解鉛、鎘、砷和汞對香菇生長的毒害作用，在重金屬脅迫下增加香菇菌絲體的生物量[6]。鈣還可緩解或消除鋁脅迫造成的外生菌根真菌Sl08 的抗氧化酶活性上升，提高其抗鋁毒的能力[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)：外源施用適量的硫[8]和褪黑素[9]有利于嗜魚外瓶霉生長，可增強其對鎘的耐受能力，但未見鈣對鎘脅迫下嗜魚外瓶霉影響的相關(guān)報道。本研究分析了鎘脅迫下不同鈣濃度處理對嗜魚外瓶霉生長、礦質(zhì)營養(yǎng)和鎘含量的影響，以通過控制不同鈣濃度水平探究嗜魚外瓶霉對鎘的耐受性，為探討嗜魚外瓶霉應(yīng)對重金屬脅迫的機制以及利用鈣與嗜魚外瓶霉的協(xié)同作用提高植株重金屬耐受性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試嗜魚外瓶霉分離自云南會澤鉛鋅礦區(qū)自然生長的密序野古草根部，現(xiàn)保存于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，菌株編號為ACCC32496。

試劑和藥品：蒸餾水(埃爾格純水機)；CdCl2·2.5H2O 和CaCl2·6H2O (分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司)；Na2SO4(分析純，廣東光華化學廠有限公司) 。試驗器材：紫外可見分光光度計(UV-5800 型，上海元析儀器有限公司)；恒溫搖床(TS-211B，上海天呈實驗儀器制造有限公司)；火焰原子吸收分光光度計(iCE 3000 SERIES，Thermo) 。

1.2 試驗設(shè)計

稱取1.015 g CdCl2·2.5H2O 溶解于5 L Modified Melin-Norkrans Broth (MMN)液體培養(yǎng)基[10]，配制為100 mg/L Cd2+質(zhì)量濃度；在此基礎(chǔ)上分別加入0.03、0.15、0.30、1.50 和3.00 g CaCl2，配制為5 個Ca2+濃度(0.045、0.225、0.450、2.250和4.500 mmol/L)處理。將每瓶900 mL 的培養(yǎng)基平均分裝至6 個250 mL 的三角瓶中作為平行，共30 個平行處理，各放入1 枚直徑為4～6 cm 的嗜魚外瓶霉，于28 ℃、120 min/r 恒溫搖床連續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.3 指標測定

將培養(yǎng)7 d 的培養(yǎng)液過濾，分離出菌絲，于75 ℃下烘干48 h，稱得菌絲干質(zhì)量；采用血球計數(shù)法測定培養(yǎng)液孢子數(shù)[11]；用pH 計測定培養(yǎng)液pH 值。參考《土壤農(nóng)化分析》[12]的方法，菌絲鎘(Cd)、鈣(Ca)、鎂(Mg)和硫(S)采用濃 HNO3—HClO4消解制樣，并用火焰原子吸收分光光度法測定含量；菌絲中氮(N)和磷(P)采用濃 H2SO4—H2O2消解法制樣，分別采用奈氏法和鉬銻抗比色法測定含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 整理數(shù)據(jù)；采用SPSS Statistics 26 進行單因素方差分析(ANOVA)；采用最小顯著差數(shù)法(LSD)和新復(fù)極差法(Duncan’s)進行多重比較；采用Origin 2021 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下不同濃度鈣對嗜魚外瓶霉菌絲干質(zhì)量、孢子數(shù)和培養(yǎng)液pH 值的影響

由表1 可知：Cd 脅迫下，隨著培養(yǎng)液中Ca2+濃度的增加，嗜魚外瓶霉菌絲干質(zhì)量、孢子數(shù)和pH 值均呈先升高再降低的變化趨勢，其中，0.225 mmol/L Ca2+處理下菌絲干質(zhì)量、孢子數(shù)和培養(yǎng)液pH 值均達到峰值。

表1 不同濃度鈣對嗜魚外瓶霉菌絲干質(zhì)量、孢子數(shù)和培養(yǎng)液pH 值的影響Tab.1 Effects of different calcium concentrations on the dry weight of mycelium,spore number and pH value of culture medium of Exophiala pisciphila

2.2 鎘脅迫下不同濃度鈣對嗜魚外瓶霉菌絲鎘含量的影響

由圖1 可知：培養(yǎng)液中的Ca2+濃度可顯著影響嗜魚外瓶霉菌絲的Cd 含量。隨著培養(yǎng)液中Ca2+濃度的增加，菌絲Cd 含量呈先上升后下降的變化趨勢，0.450 mmol/L Ca2+處理下菌絲中Cd含量最高。

圖1 不同濃度鈣培養(yǎng)液對菌絲鎘含量的影響Fig.1 Effects of different calcium concentrations on the cadmium content in mycelium

2.3 鎘脅迫下不同濃度鈣對嗜魚外瓶霉菌絲礦質(zhì)元素含量的影響

由圖2 可知：Cd 脅迫下，培養(yǎng)液中Ca2+濃度可顯著影響嗜魚外瓶霉菌絲Mg、N、P、Ca 和S 的含量，其中，隨著培養(yǎng)液Ca2+濃度的增加，菌絲中Mg 和P 含量呈下降趨勢，Ca 和S 含量呈上升趨勢，N 含量呈先下降后上升的變化趨勢。100 mg/L Cd 脅迫下，與0.450 mmol/L Ca2+處理相比，0.045 mmol/L Ca2+處理下嗜魚外瓶霉菌絲的Mg、N 和P 含量分別顯著增加6.2%、77.8%和24.0%，Ca 含量顯著下降53.0%；而4.500 mmol/L Ca2+處理下菌絲Ca、N 和S 含量分別顯著上升76.8%、38.4%和12.0%，Mg 含量則顯著下降19.9%。值得注意的是，不同濃度Ca2+處理時，菌絲中Ca 含量隨著Ca2+濃度的增加而增加。

圖2 不同濃度鈣對嗜魚外瓶霉菌絲中礦質(zhì)元素的影響Fig.2 Effects of different calcium concentrations on the mineral elements in mycelia of Exophiala pisciphila

2.4 相關(guān)性分析

由表2 可知：菌絲干質(zhì)量與Ca 含量呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，與P 含量呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與Mg 和S 含量呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)；菌絲Cd 含量與Ca 和S 含量呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，與Mg 含量呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與N 含量呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)，與P 含量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；培養(yǎng)液Ca 含量與菌絲Mg 和P 含量呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，與菌絲Ca 和S 含量呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。上述結(jié)果表明：菌絲干質(zhì)量受Ca、Mg、S 和P 的影響；Cd 脅迫下，菌絲Cd 含量與Mg 和P 的吸收具有協(xié)同作用，與Ca 和S 的吸收具有拮抗作用；培養(yǎng)液外源添加鈣可改善菌絲對營養(yǎng)液中Ca 和S 元素的吸收，會抑制Mg 和P 的吸收。

表2 菌絲干質(zhì)量、菌絲Cd 含量、培養(yǎng)液Ca 含量與菌絲礦質(zhì)營養(yǎng)含量的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis among dry weight of mycelium,cadmium content of mycelium,calcium content of culture solution and mineral nutrition content of mycelium

3 討論

3.1 鈣對鎘脅迫下嗜魚外瓶霉菌生長發(fā)育及菌絲鎘含量的影響

Cd 具有很強的生物毒性，可抑制真菌菌絲生長，但來源與遺傳背景不同的真菌對Cd 的耐受性有較大差異[2]。嗜魚外瓶霉是具有極端耐性的真菌，在多種重金屬脅迫下仍具有生長發(fā)育的能力[13]。本研究表明：嗜魚外瓶霉在Cd 脅迫下仍能生長，且添加適量Ca 可以顯著促進菌絲的生長發(fā)育，并降低Cd 脅迫的抑制效應(yīng)，這主要是因為Ca 是植物和微生物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子之一，對于維持細胞壁和細胞膜的穩(wěn)定性以及陰陽離子的平衡具有重要作用；同時，Ca2+作為第二信使感受、傳遞和響應(yīng)環(huán)境信號的變化，可直接調(diào)控部分抗氧化酶的活性[7,14]。本研究還發(fā)現(xiàn)：0.045 和4.500 mmol/L Ca2+處理下嗜魚外瓶霉的菌絲干物質(zhì)量、孢子數(shù)和鎘含量偏低，這可能是因為低濃度Ca 不能滿足菌絲正常生長所需的Ca2+；Ca 能與Cd 競爭在細胞內(nèi)結(jié)合的位點，從而減少Cd 的吸附和積累，這一結(jié)果提示Ca 對調(diào)節(jié)Cd 在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和分配具有潛在作用[15-17]。已有研究表明：外源添加Ca2+可顯著降低香菇中的Cd 含量[18-20]；本研究也顯示：0.225和0.450 mmol/L Ca2+處理總體有利于嗜魚外瓶霉菌絲生長，這為Cd 污染土壤的修復(fù)提供了一種潛在策略。需要注意的是，本研究是在實驗室條件下進行的，實際環(huán)境中受其他因素的影響可能會與本研究結(jié)果有所不同，因此，還需要進一步研究驗證本研究結(jié)果，并探索Ca 在Cd 污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用潛力。

3.2 鈣對鎘脅迫下嗜魚外瓶霉礦物質(zhì)積累的影響

有研究表明：土壤中的部分微生物在代謝過程中產(chǎn)生各種酶類，如核酸酶、磷酸酶和硫酸酶等，這些微生物可將磷酸鹽溶解為植物可以吸收利用的可溶性磷[5]。本研究中Cd 脅迫導致嗜魚外瓶霉菌絲P 含量減少，分析其原因可能是嗜魚外瓶霉分泌的酶類物質(zhì)生物解磷所致。Cd 脅迫下，谷胱甘肽(glutathione，GSH)代謝在機體做出響應(yīng)以緩解Cd 脅迫對微生物造成的毒害作用，是生物體內(nèi)減緩Cd 毒害作用的重要物質(zhì)；S 是GSH 的重要組成成分[17-18]，本研究Cd 脅迫下菌絲S 含量增加，其原因可能是嗜魚外瓶霉菌絲通過增加S 的吸收促進GSH 合成，以此緩解Cd 對菌絲體的毒害作用，同時提升機體的重金屬耐受性。Cd 與Ca 存在交互作用，菌絲中Ca 含量的增加可能是Cd 增加聚磷酸鹽含量，而聚磷酸鹽被認為是離子運輸?shù)妮d體，Ca2+與聚磷酸鹽的結(jié)合強于Cd2+，從而使菌絲Ca 含量增加[19-21]。因此，真菌應(yīng)對重金屬脅迫的機制可能是通過改變菌絲的礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量以減輕細胞內(nèi)游離態(tài)金屬離子對細胞的毒害作用[3]。

3.3 礦質(zhì)元素與嗜魚外瓶霉菌絲干質(zhì)量、鎘含量和鈣累積的相關(guān)性

礦質(zhì)元素在菌絲生長過程中起著重要的作用，真菌的生長需要大量礦質(zhì)營養(yǎng)元素(如N、P、K)和微量礦質(zhì)營養(yǎng)元素(如Mg、S、Cu、Ca等)[21-24]。重金屬脅迫下可能導致生物礦質(zhì)營養(yǎng)元素缺乏，產(chǎn)生毒害癥狀[2]。本研究表明：不同的礦質(zhì)元素對菌絲干物質(zhì)累積和Cd、Ca 元素累積的影響有較大差異。P 含量與菌絲干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，這是由于P 的添加能夠直接促進菌絲對P 的吸收和菌絲的淀粉酶活性，與徐柯[24]的研究結(jié)果相似。Ca 和S 可顯著抑制菌絲對Cd 的積累，這是因為Cd2+和Ca2+具有非常相似的物理化學性質(zhì)，且已有研究表明：Cd2+可以在菌絲體外置換鈣調(diào)蛋白、肌膜和肌鈣蛋白C 中Ca2+的結(jié)合位點，并有可能影響其他Ca2+結(jié)合蛋白[15-17]。而S 的增加能使機體合成更多的含硫化合物(如GSH)，以抵御重金屬Cd 的毒害[25]。不適宜的Ca 濃度會脅迫菌絲生長，從而導致MMN 培養(yǎng)液中的Ca 和S 過剩。需要注意的是，礦質(zhì)元素與嗜魚外瓶霉的相互作用是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，受多種因素的綜合影響[26]，因此，在進行相關(guān)性分析時需要盡可能控制其他影響因素的干擾，以獲得準確、可靠的結(jié)果。

4 結(jié)論

嗜魚外瓶霉菌絲培養(yǎng)過程中，添加適量Ca可以促進菌絲生長，且以0.225 mmol/L Ca2+最有利于菌絲和孢子生長，也有利于菌絲累積N、P、Mg 和S。為了減輕菌絲對Cd 的吸附，可適量添加P 和Mg；不適宜的礦質(zhì)元素濃度則會毒害菌絲生長。