張雪花, 王衛(wèi)華, 武 奇, 李 丁, 平繼輝, 梅 梅

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/江蘇省食品質(zhì)量與安全重點實驗室,江蘇 南京 210014; 2.獸用生物制品<泰州>國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,江蘇 泰州 225300; 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

中國于1994年在廣東分離出第一個H9N2病毒。中國提供的數(shù)據(jù)中(全球共享所有流感數(shù)據(jù)倡議,GISAID)H9N2分離株超過70%。最新的活禽市場監(jiān)測結(jié)果顯示,2014-2022年H9N2分離率持續(xù)居高不下,H9N2亞型逐漸超越其他亞型,成為家禽中最主要的亞型,同時也成為養(yǎng)禽業(yè)的頭號感染源[1-2]。大多數(shù)感染H9N2 AIV(亞型禽流感)的雞不會直接死亡,從而保留了二次感染其他亞型流感病毒的機會,促進了病毒重組。H9N2禽流感病毒作為“供體病毒”,為包括H3N8、H5N1、H7N9、H10N8和H10N3在內(nèi)的各種病毒亞型提供多個內(nèi)部基因[3-6]。H9N2 AIV繼續(xù)傳播和進化將進一步增加它作為新AIV基因供體的風(fēng)險。盡管H9N2 AIV對禽類的致病性不強,但當(dāng)與家禽中的其他病原體發(fā)生共感染或繼發(fā)感染時,會造成重大經(jīng)濟損失[7-9]。

1998年,中國廣東報道了世界首例人類感染H9N2禽流感病毒的病例[10]。截至2021年12月,在全球報告中,人類感染H9N2禽流感病毒確診病例已達95例,其中2020-2021年報道的33例病例中有32例來自中國,證實了H9N2禽流感病毒存在宿主溢出的高風(fēng)險[11]?？梢奌9N2不僅給家禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,也對人類健康構(gòu)成重大的威脅,是重要的人獸共患病病毒。

H9型AIV與H5、H7型高致病性禽流感的控制策略不同。雖然沒有強制接種H9N2禽流感疫苗,但幾乎所有雞群都接種了H9疫苗,以減少潛在的經(jīng)濟損失。中國獸藥基本信息數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)表明,在過去5年中,全國大約有50家生物公司生產(chǎn)了單價或多價H9N2疫苗。經(jīng)認證的H9疫苗相關(guān)產(chǎn)品中,疫苗株多達25株,且均為全病毒滅活疫苗。研究和臨床數(shù)據(jù)表明,接種H9N2疫苗可以減少病毒感染引起的臨床癥狀,為免疫雞群提供有效保護。然而,H9N2頻繁的抗原漂移是當(dāng)前H9N2疫苗接種的挑戰(zhàn)之一。當(dāng)H9N2疫苗毒株與流行毒株之間的抗原性存在差異時,全病毒滅活疫苗無法提供足夠的保護[12]。H9N2疫苗需要優(yōu)化毒株以適應(yīng)當(dāng)前病毒變異、多抗原群共流行的情況。重要的是,H9N2滅活疫苗主要誘導(dǎo)體液免疫,難以阻斷雞上呼吸道的病毒感染和排毒。H9N2 AIV能夠有效地在雞與雞之間進行氣溶膠傳播,即使在接種疫苗的雞之間也是如此[13],加大了病毒防控難度。因此,“防排毒”成為H9N2新型疫苗研制的新標準和又一挑戰(zhàn)。目前迫切需要開發(fā)更高效的疫苗來防控H9N2,例如在細胞和黏膜免疫水平上改進現(xiàn)有疫苗,或開發(fā)廣譜疫苗以應(yīng)對抗原的頻繁變異[14]。

本研究室擬通過對H5亞型AIV的血凝素(HA)蛋白質(zhì)序列進行比對分析,設(shè)計出HA共有序列,制備成HA亞單位疫苗,效力試驗結(jié)果證明,HA亞單位疫苗對不同流行毒株具有理想的保護效果[15-16]?；谝陨涎芯砍晒?本研究同樣選擇具有免疫原性的HA基因,通過對2010-2019年H9亞型AIV HA蛋白關(guān)鍵性氨基酸位點進行分析和統(tǒng)計,選擇每個位點最高頻率氨基酸序列,并對關(guān)鍵性抗原位點進行校正,設(shè)計出HA(H9亞型)共有序列[16],利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達HA蛋白。免疫效力試驗結(jié)果表明,該疫苗具有良好的、廣譜的免疫效果,為后續(xù)廣譜疫苗的研究提供了研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗室于2017-2019年在浙江、安徽、江蘇和山東等省份的養(yǎng)雞場分離篩選H9亞型AIV毒株 115、236、YZ,經(jīng)進化樹分析,3個毒株屬于h9.4.2.5分支的不同亞分支。H9亞型禽流感代表性毒株[A/chicken/Shandong/6/1996 (h9.4.2.3)(SD/6)、A/chicken/Guangxi/55/2005 (h9.4.2.5)(GX/55)、A/turkey/Wisconson/1/1966 (h9.1)(WI/1)]由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)平繼輝教授惠贈。桿狀病毒表達系統(tǒng)為本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的設(shè)計 對2010-2019年公布的H9亞型AIV HA蛋白的抗原相關(guān)位點、受體結(jié)合位點、潛在糖基化位點等關(guān)鍵序列進行分析,結(jié)合本試驗室分離的H9流行株關(guān)鍵性氨基酸位點,利用生物信息學(xué)軟件選擇高頻氨基酸,并對關(guān)鍵性位點進行校正,設(shè)計合成基因HA。

1.2.2 重組桿狀病毒的獲得與鑒定 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建和制備含有目的基因HA的重組桿狀病毒,經(jīng)藍白斑篩選獲得含有HA基因的重組質(zhì)粒。用HA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞,27 ℃靜置培養(yǎng),每天觀察,待轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)停止生長、變圓、脫落等細胞病變癥狀時,收獲,得到重組桿狀病毒rVHA。提取rVHA基因組DNA,然后進行PCR鑒定。PCR鑒定正確后,取重組病毒rVHA上清液接種Sf9細胞,觀察4 d,固定細胞,進行間接免疫熒光鑒定重組病毒特異性。

1.2.3 重組蛋白的表達、分析 取重組桿狀病毒rVHA上清液,接種懸浮培養(yǎng)的high five細胞,同時將野生型桿狀病毒感染high five細胞作為對照。每天取少量細胞液進行臺盼藍染色,觀察細胞死亡情況,待細胞90%變藍后收獲,利用高壓均質(zhì)機將細胞破碎,進行Western-Blot、血凝活性等分析。

1.2.4 紅細胞凝集試驗檢測重組蛋白HA血凝活性 在微量血凝板上先加25 μl 磷酸緩沖鹽溶液(PBS);第一孔加25 μl重組蛋白(rHA)混勻,倍比稀釋至216;每孔再加入25 μl PBS、25 μl 1%雞紅細胞懸液,室溫(20～25 ℃)下反應(yīng)30 min,記錄結(jié)果。

1.2.5 重組桿狀病毒傳代后遺傳穩(wěn)定性及增殖性能鑒定 將重組桿狀病毒rVHA連續(xù)傳代至第8代,對每代HA基因的核酸序列進行測序。對每代重組桿狀病毒進行病毒滴度(TCID50)鑒定,評價重組桿狀病毒的增殖性能。

1.2.6 交叉血凝抑制試驗(HI) 檢測rHA與不同分支H9亞型AIV病毒陽性血清(115、236、YZ、SD/6、WI/1)的交叉反應(yīng)活性,設(shè)無特定病原(SPF)陰性血清為對照。

1.2.7 重組蛋白的免疫原性評價 重組蛋白rHA與白油按體積比1∶3乳化制備成HA油乳劑疫苗。乳化完全后,經(jīng)性狀、穩(wěn)定性和無菌檢驗后,無菌裝入疫苗瓶內(nèi),命名為rHA疫苗,4 ℃保存。

10日齡SPF雞30只,分3組,每組10只雞。第一組,rHA疫苗組,頸部皮下注射rHA疫苗,每只注射0.5 ml;第二組,商品疫苗組,每只注射0.3 ml;第三組,陰性對照組,每只注射0.5 ml無菌生理鹽水。免疫后第14 d、21 d、28 d 采血,分離血清,檢測血清HI抗體效價。免疫28 d后,選取2株處于不同亞分支的H9亞型AIV流行毒株115和YZ株進行攻毒,每只攻毒劑量為1×106.0EID50(半數(shù)雞胚感染量)。每日觀察雞群采食量、飲水量以及精神狀態(tài)是否出現(xiàn)異常,觀察是否出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況。攻毒后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d稱量各組試驗雞的質(zhì)量,計算雞的相對增質(zhì)量率。攻毒后3 d、5 d、7 d用無菌棉拭子采集雞喉頭和泄殖腔分泌物,采集的拭子樣品通過尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚3枚,每枚 0.2 ml,每天觀察,連續(xù)觀察5日,檢測雞胚尿囊液血凝效價。若接種喉拭子或泄殖腔拭子的雞胚任何一個出現(xiàn)雞胚尿囊液血凝效價≥1×22,則該雞排毒;若雞胚尿囊液血凝效價<1×22則為可疑,需要盲傳一代,盲傳后血凝效價<1×22則判定為陰性,表明該雞不排毒。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Reed-Muench法計算病毒滴度。用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

對構(gòu)建的pFastBac1-HA重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進行雙酶切驗證,獲得目的基因和載體2個條帶(圖1),結(jié)果表明HA基因與載體pFastBac1連接成功。

M:DL5 000 marker;1:雙酶切重組質(zhì)粒。圖1 重組質(zhì)粒pFastBac1-HA的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pFastBac1-HA

2.2 重組病毒的拯救與鑒定

用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞,細胞變大變圓,折光率增加,細胞停止生長,表明細胞出現(xiàn)病變,收獲為rVHA。通過間接免疫熒光檢測重組病毒rVHA感染的細胞與不同H9陽性血清反應(yīng)的情況,熒光顯微鏡下可見,感染重組病毒的細胞出現(xiàn)明亮的綠色熒光(圖2A～圖2C);野生型桿狀病毒感染細胞未出現(xiàn)明顯熒光(圖2D),表明含HA基因的重組桿狀病毒拯救成功,且表達的HA蛋白與不同H9陽性血清間有反應(yīng)活性。

2.3 Western blot鑒定重組蛋白的表達

rVHA感染的high five細胞完全病變后收獲,用高壓均質(zhì)機裂解細胞,然后進行Western-Blot鑒定,rHA與H9亞型AIV陽性血清孵育后,出現(xiàn)與預(yù)期大小一致、較明顯的特異條帶63 000(圖3),證明HA蛋白成功獲得大量表達。

A:rVHA感染Sf9細胞(115血清);B:rVHA感染Sf9細胞(SD/6血清);C:rVHA感染Sf9細胞(WI/1);D:野毒感染Sf9細胞(115血清)。圖2 重組蛋白HA與不同H9亞型禽流感陽性血清結(jié)合的間接免疫熒光法鑒定Fig.2 Indirect immunofluorescence assay identification of recombinant protein HA reacting with positive sera of different H9 avian influenza subtypes

M:蛋白marker;1:重組蛋白HA;2:野生桿狀病毒對照。圖3 Western blot 分析重組蛋白質(zhì)與H9陽性血清的反應(yīng)Fig.3 Reaction of recombinant protein with positive sera of H9 subtypes avian influenza by Western blot

2.4 重組蛋白HA血凝活性

通過微量血凝試驗檢測rHA血凝活性,同時設(shè)115病毒尿囊液為對照,表達的重組蛋白HA血凝效價為1×212(圖4),說明rHA具有凝集紅細胞的生物學(xué)活性。

2.5 重組病毒遺傳穩(wěn)定性及增殖性能鑒定

測序結(jié)果顯示,第1～8代重組桿狀病毒的外源HA基因與目的序列完全一致,表明重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。重組桿狀病毒傳至第7～8代時病毒滴度達108.00TCID50/ml以上(表1),表明重組桿狀病毒增殖性能良好。

圖4 重組HA蛋白的血凝活性檢測Fig.4 Detection of hemagglutination activity of recombinant HA protein

表1 重組桿狀病毒穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.6 重組HA蛋白交叉反應(yīng)活性

通過HI試驗測定rHA與不同分支H9陽性血清交叉反應(yīng)的抗原性,并同時與不同分支H9病毒進行比較。由圖5可知,rHA與現(xiàn)有流行毒株血清(h9.4.2.5)反應(yīng)的HI滴度較高,與分支較遠的WI/1(h9.1)反應(yīng)最差。除去血清與同源病毒的反應(yīng),rHA反應(yīng)活性明顯優(yōu)于其他病毒,表明rHA具有良好的交叉反應(yīng)活性。

2.7 重組病毒的免疫原性評價

HI血清抗體作為流感疫苗血清學(xué)保護的反應(yīng)指標,商品疫苗效力評判標準為HI抗體效價≥1×26.00。試驗組于免疫后14 d、21 d、28 d采集靜脈血,以分離的流行毒株115、YZ作為檢測抗原檢測血清抗體HI效價。重組蛋白疫苗免疫后14 d即可誘導(dǎo)雞產(chǎn)生較高水平的 HI 抗體應(yīng)答,免疫后14 d HI效價能達到1×212.00以上,免疫后28 d 達到1×214.59,rHA組抗體效價顯著高于商品苗組(圖 6)。

SPF雞免疫28 d后,對不同亞分支的H9亞型AIV流行株115和YZ以1×106EID50的病毒量進行攻毒。臨床觀察結(jié)果顯示,各攻毒試驗組在攻毒后14 d內(nèi)均無死亡。rHA組、商品苗組在攻毒后無異常,飲水量、采食量、精神狀態(tài)均正常,空白組(陰性組)在攻毒后4 d食欲與飲水欲相對較差。

攻毒后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d分別對各組試驗雞稱體質(zhì)量,并計算不同試驗組雞體質(zhì)量相對增長率。結(jié)果顯示,rHA免疫組的試驗雞相對增質(zhì)量率最高;空白組(陰性組)的雞相對增質(zhì)量率明顯低于免疫組(圖7)。

a:rHA;b:h9.4.2.5-115;c:h9.4.2.5-236;d:h9.4.2.5-YZ;e:Sh9.4.2.3-SD/6;f:h9.1-WI/1。h9.4.2.5為流行毒株。圖5 重組蛋白HA與H9不同陽性血清型交叉反應(yīng)活性Fig.5 Cross-reactivity of recombinant protein HA with different positive serotypes of H9

A:以病毒115為檢測抗原檢測免疫后血清HI抗體;B:以病毒YZ為檢測抗原檢測免疫后血清HI抗體。*表示差異顯著(P<0.05)。圖6 不同抗原檢測免疫后血清HI抗體Fig.6 HI antibody in sera after immunization detected with different antigens

A:感染115毒株后試驗雞相對增質(zhì)量率;B:感染YZ毒株后試驗雞相對增質(zhì)量率。圖7 攻毒后不同試驗組雞的相對增質(zhì)量率Fig.7 Relative weight gain rate of chickens in different experimental groups after challenge

115和YZ毒株感染后3 d、5 d、7 d分別采集各組試驗雞的咽拭子和泄殖腔拭子樣品,測定攻毒后每只雞的排毒情況。

感染115毒株3 d后,rHA疫苗組喉頭排毒率為20%,泄殖腔排毒率為0;感染5 d后,喉頭排毒率為20%,泄殖腔排毒率為0;商品苗感染3 d后,喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率為20%;感染5 d后,喉頭排毒率為20%,泄殖腔未檢測到排毒;陰性對照組感染3 d、5 d后,喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率為100%;感染7 d后所有組未測到排毒(表2)。

表2 感染115毒株免疫保護結(jié)果

攻擊YZ毒株3 d后,rHA疫苗組的喉頭排毒率為20%;其余未檢測到病毒,排毒率為0。商品苗組攻毒3 d后的喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率為20%;攻毒5 d后喉頭排毒率為40%,泄殖腔未檢測到排毒。陰性對照組攻毒3 d、5 d后的喉頭排毒率為100%,泄殖腔排毒率也為100%。7 d后所有組未測到排毒(表3)。

綜上,rHA疫苗組保護率明顯高于商品苗組,表明rHA疫苗對當(dāng)前H9亞型AIV流行株毒株具有良好的保護效果。

表3 感染YZ毒株免疫保護結(jié)果

3 討 論

目前,中國控制H9N2禽流感的主要策略是疫苗接種。然而,中國H9N2病毒多種抗原型同時流行,疫苗更新速度落后于病毒變異速度,使有效疫苗接種面臨挑戰(zhàn)。滅活疫苗免疫可有效減輕H9N2病毒感染后的臨床癥狀,大大減少經(jīng)濟損失。然而,另一個挑戰(zhàn)是全病毒滅活疫苗免疫不能阻止H9N2 AIV再感染或病毒脫落。在中國,包括散養(yǎng)和混養(yǎng)在內(nèi)的傳統(tǒng)畜牧業(yè)系統(tǒng)繼續(xù)占據(jù)重要地位,然而,中國家禽業(yè)的主要發(fā)展方向是集約化圈養(yǎng)。研制具有廣譜性中和活性的通用疫苗對于控制H9N2具有重要意義。關(guān)于廣譜疫苗的研究已有報道,利用Epigraph算法來設(shè)計豬 H3 流感疫苗血凝素蛋白,該疫苗接種小鼠后可產(chǎn)生顯著針對不同H3分離株的交叉反應(yīng)抗體和T細胞反應(yīng),免疫雪貂后,用2種H3N2病毒攻擊,該疫苗可保護雪貂免受攻擊毒株的侵害[17-18];基于馬賽克HA序列的H9亞型禽流感滅活疫苗能對異源H9N2 AIV株產(chǎn)生較好的交叉攻毒保護效果[19]。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,重組病毒表達系統(tǒng)成為生產(chǎn)有廣譜交叉免疫效果的禽流感疫苗的技術(shù)平臺。桿狀病毒表達系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點:不使用活病毒,生物安全性高;表達的HA蛋白可組裝成病毒樣顆粒(VLP),其結(jié)構(gòu)功能與天然蛋白質(zhì)相似,免疫原性良好,蛋白質(zhì)表達效率高;重組桿狀病毒基因遺傳穩(wěn)定,病毒增殖性能良好,保證了疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量[20-21]。

新型廣譜疫苗一直是防控禽流感病毒相關(guān)研究的熱點方向,只研究單個毒株的HA免疫原性,不能得到具有廣譜保護效果的疫苗,本研究通過對2010-2019年H9亞型禽流感及本試驗室分離的最新流行株 HA蛋白的抗原相關(guān)位點、受體結(jié)合位點、潛在糖基化位點等關(guān)鍵位點序列進行分析,并對關(guān)鍵位點進行校正,利用生物信息學(xué)軟件選擇每個位點最高頻次氨基酸設(shè)計合成HA基因,并構(gòu)建桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得重組蛋白,經(jīng)間接免疫熒光、免疫印跡、交叉血凝抑制試驗對其廣譜活性進行鑒定,初步證明重組蛋白具有廣譜的交叉反應(yīng)活性。

重組蛋白疫苗免疫后14 d即可誘導(dǎo)雞產(chǎn)生較高水平的 HI 抗體應(yīng)答,14 d HI效價能達到212.00以上,28 d達到1×214.59,顯著高于商品苗組。用2株不同亞分支的H9亞型AIV毒株115、YZ攻擊免疫組雞,各組均未出現(xiàn)臨床癥狀。攻擊115毒株3 d后,rHA疫苗組保護率為80%,商品苗保護率為0;5 d后,rHA疫苗組保護率為80%,商品苗保護率為80%。攻擊YZ毒株3 d后,rHA疫苗組保護率為80%,商品苗保護率為0;5 d后,rHA疫苗組保護率為100%,商品苗保護率為60%。表明,重組蛋白疫苗組產(chǎn)生較好的交叉保護效果,明顯高于商品苗組。

另外,本研究采用高表達效率的high five細胞,提高了蛋白質(zhì)的表達量,血凝活性高達1×212;high five細胞為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的全懸浮細胞,降低了成本,生產(chǎn)周期變短,適于大規(guī)模培養(yǎng),為亞單位疫苗規(guī)模化生產(chǎn)提供了可行性。

綜上,通過分析、設(shè)計H9亞型禽流感HA關(guān)鍵位點等得到HA基因,利用Bac-to-Bac 表達的外源蛋白HA具有廣譜的保護效力,可為研究 H9亞型廣譜亞單位疫苗提供技術(shù)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。