張磊，劉劍飛，馬慧，周麗君*

1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；3解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部研究所，北京 100048；4解放軍總醫(yī)院護(hù)理部，北京 100853

弧菌是革蘭陰性菌，常被發(fā)現(xiàn)于河口、湖泊和海洋等水域中，可通過污染海產(chǎn)品對人類健康造成威脅，是食源性疾病的重要病原體之一[1-3]。在已知的12 種致病弧菌中，創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，V.vulnificus)致病性較強(qiáng)，易感人群感染后3 d 不處理，病死率可達(dá)100%[4]。隨著氣候轉(zhuǎn)暖、海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類海上活動增加，V.vulnificus感染人類的報道病例數(shù)連年增加，2006 年被Emerging Infectious Diseases雜志納入最危險的細(xì)菌之列[5-6]。除食源性途徑外，研究顯示V.vulnificus還可通過開放性傷口和外耳道等多種途徑入侵人體，引發(fā)原發(fā)性敗血癥，進(jìn)而誘發(fā)耳炎、肺炎等繼發(fā)感染[7-8]。隨著航海作業(yè)增多，頻發(fā)的海水淹溺事件成為海上作業(yè)減員的重要因素[9]。發(fā)生海上淹溺事件時，V.vulnificus可隨海水經(jīng)呼吸道入侵人體。在此過程中，研究V.vulnificus經(jīng)呼吸道侵襲是否造成感染，判斷其感染程度和感染進(jìn)展時間，進(jìn)行受累靶組織致病分析等，對其經(jīng)呼吸道感染的防治具有重要意義。目前對V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染宿主的報道鮮見。本研究通過滴鼻途徑建立V.vulnificus呼吸道感染小鼠模型，觀察感染早期階段(0～12 h)小鼠的生存狀態(tài)和炎性因子譜變化，并進(jìn)行靶組織病理學(xué)分析，旨在評估V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染對小鼠靶器官的致傷特點(diǎn)，為相關(guān)防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 無水乙醇、二甲苯、正丁醇購自國藥集團(tuán)；4%多聚甲醛固定液、脫蠟透明液、檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)、EDTA 抗原修復(fù)液(pH 9.0、pH 8.0)、PBS緩沖液、BSA、兔血清、蘇木精染液、伊紅染液和免疫組化試劑盒購自武漢賽維爾公司；2216E 瓊脂和2216E 肉湯購自青島海博公司；LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒購自美國BioLegend 公司。脫水機(jī)購自意大利DIAPATH 公司；包埋機(jī)、凍臺購自武漢俊杰公司；病理切片機(jī)購自德國Leica Biosystems 公司；顯微鏡成像系統(tǒng)購自日本Nikon公司；流式細(xì)胞儀購自美國Cytek公司。

1.1.2 弧菌V.vulnificus模式菌株1H00066購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(Marine Culture Collection of China，MCCC)，保存于含30%甘油的2216E培養(yǎng)基，-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物與分組 8～10 周齡SPF 級雌性BALB/c小鼠24只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021-0006]，體重17～18 g。隨機(jī)分為對照組、低濃度感染組、中濃度感染組和高濃度感染組，每組6 只。小鼠于SPF 條件下飼養(yǎng)于北京易科攀搏生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)周期(60 h 適應(yīng)性飼養(yǎng)+12 h 實(shí)驗(yàn))內(nèi)均自由飲食。本研究動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)康泰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)河北有限公司實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，所有流程均符合國際實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)理事會(the International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS)的相關(guān)指南，并遵守國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的管理和使用規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 創(chuàng)傷弧菌呼吸道感染小鼠模型的制備V.vulnificus1H00066 復(fù)壯后，接種至2216E 肉湯，35 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)12 h，12 000 r/min 室溫離心2 min。棄上清，菌體沉淀使用無菌1×PBS 洗滌3 次，并使用無菌1×PBS 分別稀釋至OD600nm=0.1(低濃度感染組)、OD600nm=0.2(中濃度感染組)、OD600nm=0.3(高濃度感染組)。各感染組分別取1 ml新鮮菌液，3000 r/min 室溫離心5 min；1×PBS 重懸至100 μl，充分渦旋混勻，4 ℃保存?zhèn)溆?；同時制備100 μl 1×PBS緩沖液作為對照組。各組小鼠均通過滴鼻給藥法逐滴緩慢滴入鼻腔，經(jīng)呼吸道給藥至體內(nèi)，構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌經(jīng)呼吸道感染小鼠模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物的處理及取材 在感染早期(0～12 h)每間隔1 h監(jiān)測一次各組小鼠的生存狀態(tài)，包括存活率、呼吸道與消化道有無異常癥狀、體表毛發(fā)情況及精神狀況。至12 h 監(jiān)測終點(diǎn)后麻醉小鼠并進(jìn)行眼球取血，靜置分離血清備用。脫頸處死小鼠后，獲取心臟、肺、肝、脾、腎、胃(1×PBS去內(nèi)容物)、回腸段(部分)等重要內(nèi)臟器官，使用無菌1×PBS 沖洗，置于4%多聚甲醛固定液中固定，24 h 后更換固定液，直至完全固定，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠內(nèi)臟器官組織病理學(xué)分析 將完全固定的小鼠臟器組織進(jìn)行石蠟包埋并切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，200×光鏡下觀察小鼠心臟、肺、肝、脾、腎、胃、回腸等內(nèi)臟器官的組織病理學(xué)變化。

1.2.4 免疫組化檢測小鼠回腸、肺、肝和脾組織中白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10、γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α表達(dá)情況 將完全固定的小鼠臟器組織進(jìn)行石蠟包埋并切片。經(jīng)脫蠟水化后，置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行修復(fù)，隨后置于3% H2O2室溫避光孵育25 min，1×PBS 沖洗后加入血清封閉30 min。1×PBS沖洗后分別加入抗IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α 抗體，4 ℃孵育過夜，1×PBS 沖洗后加入二抗室溫孵育5 min。加入DAB顯色液，蘇木精復(fù)染3 min，脫水、封片。切片置于顯微鏡下觀察，結(jié)果標(biāo)記為藍(lán)色(細(xì)胞核)、棕黃色(陽性表達(dá)的相應(yīng)細(xì)胞因子)。采用Aipathwell 軟件分析IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α 的陽性表達(dá)率。陽性表達(dá)率(%)=陽性面積/組織面積×100%。

1.2.5 小鼠血清1 3種炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測采集小鼠血液，3000 r/min 室溫離心5 min，取上層血清儲存于-80 ℃冰箱備用。每個樣本吸取25 μl 血清，按照LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒說明書方法，同時檢測各組小鼠血清中IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-10、 IL-23、 IL-12p70、 IL-17A、 IL-27、 IFN- γ、IFN-β、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1 和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等13 種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)流程如下：混合包被熒光微球與25 μl 血清孵育2 h，加入25 μl 檢測抗體孵育60 min，加入25 μl 藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-PE)孵育30 min；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測13種細(xì)胞因子的熒光強(qiáng)度，利用LEGENDplex軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對其表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)發(fā)布，以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠外觀生理學(xué)變化 感染后0～12 h，不同濃度感染組小鼠均先后出現(xiàn)較明顯的外觀生理學(xué)改變，包括弓背、安靜、精神萎靡、立毛、毛發(fā)粗糙、呼吸異常和腹瀉等癥狀；各組差異主要體現(xiàn)為不同癥狀的時間進(jìn)程。隨感染程度加重，外觀生理學(xué)改變發(fā)生時間前移，異常表現(xiàn)的小鼠數(shù)量增加。高濃度感染組小鼠于感染后12 h 死亡1 例，低、中濃度感染組無死亡病例。此外，各組小鼠均未見昏迷、暈厥、嘔吐、寒戰(zhàn)或局部表層皮膚壞死等經(jīng)消化道感染或開放傷口感染后的常見癥狀。

2.2V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠靶器官及相關(guān)組織病理學(xué)檢查結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠的腎、心臟、胃均未見異常病理變化，而肝、肺、回腸、脾等器官出現(xiàn)不同程度的病理損傷，且高濃度感染組損傷程度更重(圖1)。

圖1 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠主要臟器病理改變(HE ×200)Fig.1 Pathological changes of major organs in mice with V. vulnificus early infection via respiratory tract (HE ×200)

(1)肝。對照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，著色均勻，結(jié)構(gòu)清晰，無明顯病理變化。低濃度感染組小鼠肝組織邊緣可見少量肝細(xì)胞水樣變性，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染；中濃度感染組小鼠肝組織中可見較多肝細(xì)胞氣球樣變性，細(xì)胞腫脹，核居中，胞質(zhì)空泡化；高濃度感染組小鼠肝組織中可見較多肝細(xì)胞水樣變性，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，多見淋巴細(xì)胞與點(diǎn)狀的巨噬細(xì)胞就浸潤，少見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，核溶解。(2)肺。對照組小鼠肺組織無異常病理表現(xiàn)。低濃度感染組可見肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤；中濃度感染組可見較大范圍的肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤，局部可見出血；高濃度感染組可見較大范圍的肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤，可見較多出血。(3)回腸。對照組小鼠回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的炎癥表現(xiàn)。低濃度感染組小鼠回腸組織局部固有層底部可見少量淋巴細(xì)胞浸潤；中濃度感染組小鼠回腸組織黏膜層局部可見腸腺擴(kuò)張，腺腔內(nèi)可見壞死細(xì)胞碎片；高濃度感染組小鼠回腸組織黏膜層可見多處水腫，腸上皮與固有層之間可見空隙。(4)脾。對照組脾組織結(jié)構(gòu)正常。低濃度感染組可見多處脾小結(jié)生發(fā)中心擴(kuò)張，紅髓有大面積髓外造血灶，伴有多核巨細(xì)胞數(shù)量明顯增多；中濃度感染組脾小結(jié)數(shù)量明顯減少，紅髓有大面積髓外造血灶，伴有多核巨細(xì)胞數(shù)量增多；高濃度感染組小鼠局部脾小結(jié)中可見生發(fā)中心擴(kuò)張，紅髓有大面積髓外造血灶，伴有多核巨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，少見中性粒細(xì)胞浸潤。

2.3V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠靶器官中炎性因子表達(dá)變化 采用免疫組織化學(xué)法檢測V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠靶器官(回腸、肺、肝和脾)中炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α 的陽性表達(dá)率，結(jié)果見圖2－5。

圖2 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠回腸組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)變化Fig.2 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in intestinal of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.3.1 回腸 與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠回腸組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達(dá)率均明顯增高(P<0.05)。中、高濃度感染組小鼠回腸組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達(dá)率均明顯高于低濃度感染組(P<0.05)(圖2)。

2.3.2 肺 與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠肺組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達(dá)率均明顯增高(P<0.05)。中、高濃度感染組小鼠肺組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達(dá)率均明顯高于低濃度感染組(P<0.05)(圖3)。

圖3 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠肺組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)變化Fig.3 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in lung of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.3.3 肝 與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠肝組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達(dá)率均明顯增高(P<0.05)。中、高濃度感染組小鼠肝組織中IL-6、IL-10 和IFN-γ 的陽性表達(dá)率均明顯高于低濃度感染組(P<0.05)(圖4)。

圖4 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠肝組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)變化Fig.4 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in liver of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.3.4 脾 與對照組比較，低濃度感染組小鼠脾組織IL-10、IFN-γ 和TNF-α 的陽性表達(dá)率均明顯增高(P<0.05)，IL-6 的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中、高濃度感染組小鼠脾組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達(dá)率均明顯高于低濃度感染組和對照組(P<0.05)(圖5)。

圖5 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠脾組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)變化Fig.5 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in spleen of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.4V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠血清促炎-抑炎因子譜變化 采用高通量多因子檢測結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠血清TNF-α、MCP-1 表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，IL-27表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IL-10和IFN-β 表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)，而中、高濃度感染組小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-17A、GM-CSF表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，高濃度感染組小鼠血清IL-1α、IL-23、IL-12p70、IFN-γ表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05，表1)。

表1 V. vulnificus呼吸道感染早期小鼠血清13種炎性因子表達(dá)水平(pg/ml, ±s, n=6)Tab.1 Expression levels of 13 inflammatory factors in serum of mice with V. vulnificus early infection via respiratory tract (pg/ml, ±s, n=6)

表1 V. vulnificus呼吸道感染早期小鼠血清13種炎性因子表達(dá)水平(pg/ml, ±s, n=6)Tab.1 Expression levels of 13 inflammatory factors in serum of mice with V. vulnificus early infection via respiratory tract (pg/ml, ±s, n=6)

IL.白細(xì)胞介素；IFN.干擾素；TNF-α.腫瘤壞死因子-α；MCP-1.單核細(xì)胞趨化蛋白-1；GM-CSF.粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；與對照組比較，(1)P<0.05；與低濃度感染組比較，(2)P<0.05；與中濃度感染組比較，(3)P<0.05

高濃度感染組8.58±0.44(1)(2)(3)10.53±0.81(1)(2)(3)7.64±0.73(1)(2)3.15±0.00 15.15±1.27(1)(2)(3)4.27±0.25(1)(2)(3)8.28±0.88(1)(2)1.69±0.00(1)7.76±0.71(1)(2)(3)14.43±0.09 104.70±1.97(1)(2)(3)17.61±0.37(1)(2)(3)113.10±10.47(1)(2)(3)炎性因子IL-1β IL-1α IL-6 IL-10 IL-23 IL-12p70 IL-17A IL-27 IFN-γ IFN-β TNF-α MCP-1 GM-CSF對照組3.74±0.00 5.91±0.46 3.99±0.32 3.31±0.28 3.93±0.00 1.85±0.00 3.49±0.17 33.16±8.87 4.28±0.54 15.55±0.74 3.82±0.00 5.08±0.70 15.36±2.14低濃度感染組4.08±0.59 6.07±0.50 4.46±0.35 3.15±0.00 3.93±0.19 2.06±0.19 4.80±0.82 1.69±0.00(1)5.32±0.92 14.51±0.71 41.33±3.62(1)8.47±0.62(1)19.03±6.38中濃度感染組5.30±0.46(1)6.62±0.26 6.56±0.62(1)(2)3.15±0.00 4.04±0.19 2.22±0.33 6.62±1.35(1)1.69±0.00(1)5.66±0.33 15.62±0.41 68.03±2.37(1)(2)15.71±0.20(1)(2)27.86±3.99(1)

3 討 論

既往研究顯示，V.vulnificus可通過消化道和局部傷口兩種途徑感染人類，且病程進(jìn)展迅速，經(jīng)消化道感染后主要表現(xiàn)為腸胃炎、敗血癥和蜂窩組織炎等，經(jīng)傷口感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、膿毒血癥和壞死性筋膜炎等[10]。上述兩種感染途徑均可迅速導(dǎo)致人體發(fā)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，從而造成多器官損傷，病死率超過50%[11]。呼吸道是人體與外界相通的重要途徑，發(fā)生海上淹溺事件時，V.vulnificus可能通過呼吸道入侵人體，但目前對V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染的報道少見。本研究采用滴鼻法建立了不同濃度V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染小鼠模型，對其早期感染進(jìn)程(0～12 h)中的致傷作用進(jìn)行了病理學(xué)觀察，可為進(jìn)一步研究V.vulnificus多途徑感染致病性及臨床救治提供參考。

本研究廣泛摘取V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染早期小鼠循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的重要器官組織，病理學(xué)觀察顯示，回腸、肺、肝、脾等器官出現(xiàn)不同程度的損傷，應(yīng)為V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染后主要的受累靶器官。其中肝細(xì)胞損傷程度隨菌液接種濃度增高而加重。肺組織隨菌液接種濃度增高，其炎性浸潤程度呈上升趨勢?；啬c組織的病變程度隨V.vulnificus菌液接種濃度增高而呈現(xiàn)更加復(fù)雜的臨床變化。脾組織代償性造血功能出現(xiàn)的頻率隨V.vulnificus感染程度加重而增高，提示合并多組織損傷程度加深。

本研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)呼吸道感染V.vulnificus后，可在12 h 內(nèi)引起呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等器官不同程度的組織結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞變形和炎性細(xì)胞浸潤，這些病理學(xué)表現(xiàn)可對感染組小鼠的腹瀉、喘咳等外觀生理學(xué)癥狀做出解釋。對V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染與經(jīng)其他途徑感染進(jìn)行比較，經(jīng)腹腔、皮下和肌肉感染V.vulnificus除可引起脾、肺、肝產(chǎn)生病理學(xué)變化外，還可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)心臟和腎組織損傷，但胃和腸無顯著病理變化；V.vulnificus經(jīng)消化道感染較之其他感染途徑的致傷作用更為廣泛，可導(dǎo)致小鼠心臟、肝、脾、肺、腎、胃和腸等器官組織的廣泛損傷，引起更為嚴(yán)重的繼發(fā)感染[12-15]。本研究結(jié)果顯示，V.vulnificus可通過呼吸道感染小鼠，在其早期感染進(jìn)程中，心臟、腎和胃受到的影響較小。此結(jié)果可為判定V.vulnificus的感染途徑提供參考，從而及時針對受累器官展開臨床診斷和治療。對于不同途徑感染V.vulnificus后受累靶器官的損傷情況及其致傷機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)合病理學(xué)觀察，測定了小鼠受累靶器官回腸、肺、肝、脾中炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，經(jīng)呼吸道感染V.vulnificus后靶器官中IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α的表達(dá)量隨菌液接種濃度升高而增加，提示靶器官損傷程度隨小鼠感染程度加重而加重。作為促炎因子，IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)增加會引起機(jī)體炎性反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上易合并其他癥狀而造成器官損傷[16-17]。陸海霞等[14]的研究顯示，小鼠經(jīng)腹腔途徑感染V.vulnificus后，肝組織中IL-6、IFN-γ 和TNF-α表達(dá)明顯升高，與本研究結(jié)果一致。在本研究中，感染組小鼠靶器官中抑炎因子IL-10 表達(dá)量明顯升高，究其原因，可能是由于V.vulnificus感染早期機(jī)體分泌促炎因子，導(dǎo)致促炎反應(yīng)的發(fā)生和促炎細(xì)胞因子的大量釋放，隨之刺激抑炎因子代償性分泌增多。此外，本研究結(jié)果提示，當(dāng)促炎因子總體表達(dá)水平顯著高于抑炎因子時，會引起靶器官發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致器官、組織和細(xì)胞受損。

既往研究顯示，V.vulnificus在感染過程中會誘導(dǎo)多種炎性因子參與機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)[18]。為進(jìn)一步明確V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染小鼠后血清炎性因子譜的變化規(guī)律，同時為V.vulnificus呼吸道感染的無創(chuàng)性診斷提供參考，本研究進(jìn)一步檢測了小鼠血清中多種炎性因子的變化，結(jié)果顯示，不同濃度感染組小鼠血清中多種促炎因子表達(dá)水平均呈升高趨勢，在高濃度感染組中尤為明顯，其中TNF-α和MCP-1的表達(dá)變化相對更為顯著。TNF-α 作為發(fā)生感染時體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)之一，可刺激其他細(xì)胞因子如IL-6、血小板活化因子的產(chǎn)生，引起多器官功能損害，是組織損傷的早期敏感指標(biāo)[19]。而巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞在靶器官受到嚴(yán)重?fù)p傷時可誘導(dǎo)分泌MCP-1，導(dǎo)致其表達(dá)水平明顯升高[20]。這兩種促炎因子表達(dá)水平的顯著變化提示V.vulnificus呼吸道感染早期宿主體內(nèi)可能存在廣泛的炎性反應(yīng)。同時，本研究結(jié)果顯示，血清中平衡炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子IL-27表達(dá)水平迅速下降，造成表達(dá)失調(diào)，加劇了機(jī)體的炎性反應(yīng)，進(jìn)而協(xié)同促炎因子而對機(jī)體造成損傷。IL-27的類似變化鮮見于其他相關(guān)研究，提示其具備作為V.vulnificus呼吸道感染早期敏感指標(biāo)的潛在價值。此外，TNF-α 和GM-CSF 在高濃度感染組小鼠血清中表達(dá)水平明顯增高，均超過100 pg/ml。IL-10 和IFN-β 作為抑炎因子，其表達(dá)量在感染后變化不明顯，提示其可能不適合作為V.vulnificus呼吸道感染早期檢測指標(biāo)。由此可見，在經(jīng)呼吸道感染V.vulnificus后，及時監(jiān)測血清中炎性因子譜的變化對于病情判斷和臨床治療具有重要指導(dǎo)意義。

本研究存在一定局限性。首先，感染實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)菌株，缺乏對不同來源菌株的相關(guān)研究，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在偏差，因此需要加強(qiáng)對國內(nèi)其他來源V.vulnificus菌株的呼吸道致病性研究；其次，尚未以V.vulnificus致病的具體機(jī)制為突破點(diǎn)開展進(jìn)一步探索。基于上述兩點(diǎn)，本課題組在未來應(yīng)進(jìn)一步展開樣本擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)和V.vulnificus呼吸道致病機(jī)制研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了多濃度V.vulnificus呼吸道感染小鼠模型，結(jié)果顯示，回腸、肺、肝和脾是該途徑感染重要的靶器官；感染早期小鼠出現(xiàn)了明顯的外觀生理學(xué)改變，靶器官中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α呈高表達(dá)，同時血液中多種炎性因子表達(dá)失衡，促使機(jī)體內(nèi)過度炎性反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)小鼠廣泛的機(jī)體損傷。TNF-α、MCP-1 和IL-27 可能成為V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染早期的潛在敏感指標(biāo)。