張?zhí)鞄洠軜菲?綜述，于冠宇，張 衛(wèi) 審校

（海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院肛腸外科，上海 200433）

結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer, CRC)在惡性腫瘤中發(fā)病率排名第三（占新發(fā)腫瘤病人的10.0%），且死亡率排名第二（占新增腫瘤死亡病人的9.4%）[1]。針對CRC 等實體腫瘤，傳統(tǒng)治療方式根據(jù)不同的類型與階段，選擇手術(shù)治療、放療、化療以及靶向治療等方式進行治療[2]。但傳統(tǒng)治療方式對病人總生存期改善有限，CRC 發(fā)病率與死亡率仍高居不下。

近年來，免疫療法的提出改變了以往直接針對腫瘤的治療策略，并開辟了對抗腫瘤的另一路徑——細胞免疫療法[3]。其中，嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T cell, CAR-T 細胞）免疫治療是腫瘤治療的創(chuàng)新方式之一。通過基因修飾，病人回輸后的T 細胞可表達CAR，之后與獨立于主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)受體的靶抗原結(jié)合，得以定向識別和消除表達特定靶抗原的腫瘤細胞[4]。得益于良好的特異性和強大的殺傷作用，CAR-T 細胞免疫治療方式在血液腫瘤治療的臨床應(yīng)用中取得了顯著成效，且在實體腫瘤治療中具有極大的應(yīng)用潛力。

1 CAR-T細胞免疫治療CRC的靶點選擇

在CAR-T 細胞免疫治療CRC 過程中，CAR 與癌細胞表面靶抗原識別并結(jié)合是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。尋找合適的治療靶點是CAR-T 細胞免疫治療得以開展的基石。Qi 等[5]報道的應(yīng)用靶向密封蛋白（Claudin）18.2（CLDN18.2）CAR-T細胞對37 例胃腸道腫瘤治療的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果表明，在CLDN18.2 陽性表達的胃腸道腫瘤病人中獲得良好的療效和可接受的安全性。

治療靶點的選擇常需考慮腫瘤的組織病理特征，CRC腫瘤組織高表達的分子包括表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）以及磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphate and tension homolog,PTEN）表達的蛋白質(zhì)等多種實體腫瘤標志物。目前，適用于CRC 的治療靶點有癌胚抗原（carcinoembryonic, CEA）、鳥苷酸環(huán)化酶2C（guanylyl cyclase 2C, GUCY2C)、上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）等[6]。綜合來看，靶點選擇策略有如下共同之處。

1.1 良好的特異性

CAR-T 細胞實現(xiàn)對腫瘤細胞的精準殺傷需要治療靶點具有良好的特異性。急性淋巴細胞白血病等血液腫瘤細胞可普遍表達CD19 等腫瘤特異抗原（tumor specific antigen,TSA），與免疫細胞結(jié)合的特異性較高[7]。與之不同的是，實體腫瘤如CRC 腫瘤細胞缺乏TSA，更多的是腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen, TAA)作為治療靶點。此類抗原在腫瘤細胞高水平表達，但在正常細胞也有一定的表達[8]。因此，利用TAA 在腫瘤細胞與正常細胞表達的差異來尋找合適的治療靶點是提高治療靶點特異性的主要策略。

GUCY2C 表達于胃腸上皮細胞，是治療CRC 及轉(zhuǎn)移性CRC 的重要靶點之一，在腸外細胞僅有下丘腦神經(jīng)元少量產(chǎn)生，具有一定的組織特異性[9]。同時，GUCY2C 在原發(fā)性CRC 中可穩(wěn)定表達，且在轉(zhuǎn)移灶中也維持表達。與具有極性、僅于上皮細胞的腔面膜表達GUCY2C 的正常腸上皮細胞相比，惡變的上皮細胞因失去極性而造成GUCY2C 廣泛表達于細胞整個表面[10]。這提高了GUCY2C 的特異性，使CAR-T細胞得以將其特異識別。

另一個在CRC 病人高表達的腫瘤相關(guān)抗原是CEA，其作為治療靶點的原因與GUCY2C 相類似。在正常腸上皮細胞中，CEA 被糖蛋白或微絨毛包裹，且表達同樣具有極性——僅在腸腔一側(cè)細胞膜表達。細胞發(fā)生惡變后，CEA表達失去極性，在細胞整個表面都顯著表達[11]。然而，CEA在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤細胞中也可高表達，其組織特異性較差[12]。因此，CEA 被用作治療靶點時，其安全性需要廣泛的實驗數(shù)據(jù)進行評價。

此外，還有EpCAM、人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）等治療靶點均因具有良好的特異性而被應(yīng)用于CAR-T 細胞免疫治療CRC[13-15]。

1.2 安全性和有效性

特異性篩選出治療靶點后，還應(yīng)進一步綜合體外實驗、動物實驗、臨床試驗等結(jié)果評價其有效性和安全性。在不同實驗階段，可能會得出與預(yù)期不符的實驗結(jié)果，影響治療靶點選擇的最終決策。良好的治療靶點，應(yīng)具有足夠的安全性以及可觀的有效性。

CEA 作為用于治療CRC 的主要治療靶點之一，在過去數(shù)十年間經(jīng)歷了相對完整的實驗論證過程。Darcy 等[16]開展的一項實驗將通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠嵌合scFv anti-CEA 受體T 細胞與人結(jié)腸癌LoVo 系細胞（效靶比=1∶1）混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CAR-T 細胞與癌細胞特異結(jié)合并釋放大量干擾素(interferon, INF)γ [（1 062±15） μg/L，對照組＜20 μg/L]，且在后續(xù)的動物實驗中驗證scFv anti-CEA 受體可在小鼠中擴增，并使CAR-T細胞對結(jié)腸癌細胞有效定位，之后通過穿孔素介導(dǎo)靶細胞裂解。Zhang 等[17]開展的一項anti-CEA CAR-T 細胞治療轉(zhuǎn)移性CRC 的Ⅰ期臨床研究驗證了CEA作為治療靶點的安全性。研究未觀察到與CAR-T細胞治療相關(guān)的嚴重不良事件發(fā)生。此外，在入組的10 例病人中，既往發(fā)生疾病進展的7 例經(jīng)CAR-T 細胞治療后病情穩(wěn)定，2例通過PET/CT 與MRI 檢查提示病灶縮小，證明anti-CEA CAR-T細胞治療CRC具有可觀的有效性。

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)間皮素（mesothelin, MSLN）在間皮瘤、卵巢癌等腫瘤組織中高表達，而靶向MSLN 的CAR-T細胞免疫治療也在動物實驗階段驗證其有效性[18]。Zhang等[19]應(yīng)用癌細胞系異種移植法（卵巢癌、乳腺癌和CRC 細胞系）和癌癥病人細胞異種種植法（MSLN+CRC 和胃癌病人）分別造模癌癥小鼠，之后應(yīng)用anti-MSLN CAR-T細胞進行治療。結(jié)果表明，anti-MSLN CAR-T 細胞免疫治療不僅抑制實驗組小鼠的腫瘤生長，同時提高小鼠體內(nèi)T 細胞數(shù)目和抑癌細胞因子水平，體現(xiàn)了MSLN 作為新型細胞免疫治療靶點的應(yīng)用潛能。

盡管CEA 作為CAR-T 細胞免疫治療的經(jīng)典靶點經(jīng)歷了長時間的驗證，但其有效性與安全性仍需更多的高等級臨床證據(jù)深入論證，如更廣泛、多中心的臨床隨機對照試驗等。其他治療靶點如MSLN 等也需如此，在理論走入實踐、基礎(chǔ)走入臨床的各個環(huán)節(jié)反復(fù)驗證其有效性及安全性。足夠的安全性是治療靶點得以廣泛應(yīng)用的必要條件，而治療效果則是衡量治療靶點臨床收益的重要指標之一。

2 CAR-T細胞免疫治療CRC的制約因素

CAR-T 細胞免疫在血液腫瘤治療中取得了顯著成效，然而，CRC 等實體腫瘤具有與血液腫瘤差異較大的抗原表達及腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）。這些差異會導(dǎo)致CAR-T 細胞免疫治療CRC 的應(yīng)用過程中產(chǎn)生不良反應(yīng)，也會降低治療的有效性，成為制約CAR-T細胞免疫治療CRC發(fā)展的因素。

2.1 制約治療的不良反應(yīng)

細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome, CRS）是常發(fā)生于CAR-T細胞免疫治療血液腫瘤的不良反應(yīng)之一（on-target/on-tumor toxicity）[20]。其發(fā)生的主要原因是T細胞激活后介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，使巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞或上皮細胞釋放出大量細胞因子[21]。然而，CRS 在CART細胞免疫治療實體腫瘤時并不多見。Zhang等[17]的研究著重監(jiān)測了CRS 的敏感標志物——C 反應(yīng)蛋白與白介素(interleukin, IL)-6。結(jié)果表明，在回輸CAR-T 細胞后呈單峰樣拋物線變化趨勢，并未高位維持，因此病人無嚴重的CRS發(fā)生。相同的結(jié)果還體現(xiàn)于Ahmed等[22]應(yīng)用CAR-T細胞免疫治療肉瘤的研究中，在對病人的細胞因子進行持續(xù)監(jiān)測過程中，發(fā)現(xiàn)僅IL-8 在回輸CAR-T 細胞后的第1、2、4 周有顯著增高，其余細胞因子無明顯增多，也未觀察到嚴重的CRS發(fā)生。

在應(yīng)用CAR-T 細胞免疫治療實體腫瘤的過程中，更明顯的不良反應(yīng)是CAR-T細胞非特異性靶向而造成的機體損傷（on-target/off-tumor toxicity）。這是因為治療如CRC 等實體腫瘤選取的治療靶點為TAA，CAR-T 細胞回輸后可能會對表達靶抗原的非腫瘤組織造成損傷。Morgan 等[23]報道，1例結(jié)腸癌術(shù)后淋巴及肝轉(zhuǎn)移的病人在輸注抗HER-2 CAR-T細胞后15 min內(nèi)出現(xiàn)呼吸窘迫，并在5 d后死亡。分析認為CAR-T 細胞在回輸后立即定位并攻擊有ERBB2 低表達的肺上皮細胞，從而引發(fā)嚴重的CRS，并最終導(dǎo)致病人死亡。Parkhurst等[24]報道3例轉(zhuǎn)移性CRC病人回輸anti-CEA CART細胞后的治療情況，3例病人CEA均有顯著下降，1例肺轉(zhuǎn)移灶及肝轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)客觀退縮，其余2 例腫瘤病灶無明顯變化。此外，該治療誘發(fā)了3 例嚴重短暫性炎性結(jié)腸炎，分析原因，認為是CAR-T 細胞識別了正常腸上皮細胞少量表達的CEA。

雖然CAR-T 細胞治療靶點在臨床試驗之前嚴格篩選，也經(jīng)過體外實驗與動物實驗，但免疫細胞回輸后對病人產(chǎn)生的不良反應(yīng)仍需大量的臨床試驗來深入研究，以便更安全、廣泛地應(yīng)用CAR-T細胞免疫治療CRC。

2.2 制約治療的腫瘤環(huán)境

腫瘤細胞的生活環(huán)境較復(fù)雜，包括有成血管細胞（內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等）、免疫細胞（淋巴細胞、巨噬細胞等）、成纖維細胞，以及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）、擴散性生長因子和細胞因子等[25]。這樣的環(huán)境可使血管加速生成、成纖維細胞增殖，以及炎癥細胞聚集等，形成的物理屏障及TME會制約CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞[26]。

實體腫瘤的物理屏障限制了CAR-T 細胞的穿透能力。與血液腫瘤不同的是，CRC等實體腫瘤細胞呈團塊樣生長，阻礙了免疫細胞浸潤。此外，腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancerassociated fibroblast, CAF）產(chǎn)生的腫瘤ECM 構(gòu)成了另一重要的物理屏障[27]。ECM 由糖蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白等其他大分子物質(zhì)組成，在腫瘤細胞外無序排列，這使得CAR-T細胞難以與腫瘤細胞靶向結(jié)合[28]。

實體腫瘤還具有免疫抑制效應(yīng)的TME，由Treg細胞、骨髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell, MDSC）、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）等參與構(gòu)建，降低CAR-T 細胞的殺傷能力[29-31]。其中，Treg 細胞發(fā)揮的免疫抑制效應(yīng)更明顯，其抑制效應(yīng)主要體現(xiàn)如下：通過抑制性受體[T 淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain,TIM)-3、T 細胞免疫球蛋白和ITIM 結(jié)構(gòu)域蛋白(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain,TIGIT)、程序性死亡受體(programmed death, PD)-1 和淋巴細胞活化基因(lymphocyte activation gene,LAG)-3]、抑制性細胞因子[轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β、IL-10和IL-35)、調(diào)節(jié)樹突狀細胞釋放吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)[通過Treg 細胞的細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)蛋白 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen,CTLA)-4 與樹突狀細胞的抗原分化簇(cluster of differentiation,CD)80 結(jié)合]和中斷腺苷代謝(通過Treg 細胞CD39 和CD73)來抑制抗腫瘤T 細胞反應(yīng)；通過TGF-β 誘導(dǎo)CAF 增殖，增加ECM的產(chǎn)生與沉積，發(fā)揮物理屏障作用，限制CART細胞的浸潤[32]。

實體腫瘤異于血液腫瘤的環(huán)境使得CAR-T細胞產(chǎn)生效應(yīng)面臨重重阻礙，這表明仍需探索合理的治療策略，以克服實體腫瘤環(huán)境對CAR-T細胞免疫治療的制約[33]。

3 CAR-T細胞免疫治療CRC的展望

CAR-T細胞免疫治療CRC療效與其他實體腫瘤相比仍有一定差距，其制約因素主要為CRC的TAA，甚至TSA表達有限。Golubovskaya 等[34]探究anti-CD47 CAR-T 細胞抗腫瘤效能的體外及動物實驗結(jié)果表明，腫瘤細胞系整體CD47表達顯著高于正常細胞，但在CRC細胞系中表達卻偏低，因此在動物模型實驗中觀察到CAR-T 細胞對卵巢癌、胰腺癌及宮頸癌良好的抗腫瘤效能，但對CRC 的治療效果不佳。同時，CRC 具有更復(fù)雜的免疫微環(huán)境，也是CAR-T 細胞治療CRC 效果與治療其他實體腫瘤療效產(chǎn)生差異的主要原因。另一可能影響治療效果的因素是腫瘤的病理分期，然而目前CAR-T 細胞在實體腫瘤治療中多用于較晚期的病人，缺少早期病人進行療效比較。這一因素的探究依賴于產(chǎn)品成熟度的提升與較早期病人的應(yīng)用。

目前，已有針對提高CAR-T 細胞免疫治療靶點特異性以及突破TME 制約等問題的相關(guān)研究正在進行。如對CAR 結(jié)構(gòu)進行改造，采用雙重CAR 結(jié)構(gòu)或串聯(lián)CAR 結(jié)構(gòu)，使CAR-T多靶點靶向結(jié)合腫瘤抗原后產(chǎn)生殺傷作用[35]。

此外，更多的治療策略被提出，以期減輕TME對CAR-T細胞的影響。如對CAR-T 細胞進行改造，使其可以表達肝素酶，以降解腫瘤ECM，使CAR-T 細胞更有效地進入腫瘤組織[36]。還有研究將CAR-T 的靶細胞確定為CAF，通過特異性結(jié)合CAF 表面高度表達的成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）對其造成殺傷[37-38]。

同時，創(chuàng)新給藥途徑也能提高CAR-T 細胞免疫治療的有效性，如向肝內(nèi)局部輸注CAR-T 細胞，以增加局部濃度[39]。作為治療腫瘤的方法之一，細胞免疫治療還可與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，如將實體腫瘤手術(shù)切除后再行細胞免疫治療，將治療效果聯(lián)合放大。但是，各種創(chuàng)新方案都需大量的臨床試驗進行驗證，而這也是目前CAR-T 細胞免疫治療的不足之一，期待未來開展更多的臨床試驗，獲得更多積極的結(jié)果。

細胞免疫治療作為對抗腫瘤的新一代治療方法，對實體腫瘤的治療極具應(yīng)用潛力。因此，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心于2020 年8 月組織起草了《人源性干細胞及其衍生細胞治療產(chǎn)品臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，進一步為開展細胞免疫治療臨床試驗的研究者提供了針對性的指南。上海市政府更將細胞治療列入上海市科技“十四五”及中長期規(guī)劃的重點任務(wù)，上海市有多款CART 細胞治療產(chǎn)品進入上市申報階段。上海市斯丹賽生物開發(fā)的治療CRC 等實體腫瘤anti-GCC CAR-T 細胞產(chǎn)品也于2022 年4 月被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）授予快速通道資格。然而，實體腫瘤具有缺乏特異性抗原以及特殊的腫瘤環(huán)境等特點，產(chǎn)生一系列亟待解決的臨床問題。在未來，需要對已掌握的技術(shù)進行廣泛的驗證，探索解決臨床問題的全新途徑。