曾瑜 邊亞芹 楊怡春 彭冬先

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院,廣東 廣州 510280;2.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510280;3.深圳市龍崗中心醫(yī)院,廣東 深圳 518100)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是一種患者連續(xù)發(fā)生≥3次,20周前妊娠產(chǎn)物丟失的病理性妊娠狀態(tài),與感染、遺傳及內(nèi)分泌等因素有關(guān)[1-2]。目前仍有約50%復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者尚未發(fā)現(xiàn)原因,稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA),導(dǎo)致患者再次妊娠失敗的風(fēng)險增加[3]。研究表明,絨毛血管增生、滋養(yǎng)細(xì)胞增殖對正常妊娠至關(guān)重要,在孕早期,絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞進入中螺旋動脈,增加胎盤血供,維持妊娠需求[4-5]。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是調(diào)節(jié)血流灌注的重要因子,在促進胚胎存活方面發(fā)揮重要作用[6]。非對稱性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)由蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈經(jīng)甲基化修飾水解后形成,是一種內(nèi)源性NO合成酶抑制劑,ADMA可通過減少NO的產(chǎn)生損害內(nèi)皮細(xì)胞功能,從而對胎兒發(fā)育造成不良影響[7-8]。然而目前關(guān)于ADMA與URSA的相關(guān)性尚不明確,因此,本研究以URS患者為研究對象,旨在探討ADMA在URSA患者血漿及絨毛組織中的表達其臨床意義,以期為臨床治療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月-2021年12月南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院收治的URSA患者168例為研究對象,采用計算機產(chǎn)生隨機數(shù)法將就診患者以3∶1的比例分為訓(xùn)練集126例(URSA組)和測試集42例,分別用于構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型和驗證模型預(yù)測效能。另選取同期于我院進行終止妊娠的126例孕婦作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①自然流產(chǎn)次數(shù)≥3次,經(jīng)診斷確診為URSA。②B超檢查結(jié)果證實胚胎停止發(fā)育、無原始胎心搏動。③無家族遺傳病史,夫婦雙方染色體核型檢查結(jié)果正常。④婦科檢查、超聲及子宮輸卵管造影檢查排除患者生殖器官畸形。⑤患者性激素、甲狀腺功能、內(nèi)分泌功能正常。⑥無生殖道感染。⑦臨床資料完整,無精神障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：①流產(chǎn)原因明確,即因感染、染色體異常、解剖結(jié)構(gòu)異常及自身免疫疾病等因素導(dǎo)致的流產(chǎn)。②生殖內(nèi)分泌激素異?；颊?。③患者合并甲狀腺疾病、糖尿病及自身免疫疾病。④合并惡性腫瘤。⑤近三個月服用過激素類藥物。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①無不良妊娠史。②產(chǎn)前檢查結(jié)果提示胎兒發(fā)育正常,血絨毛膜促性腺激素檢查正常。

1.2 研究方法 通過查閱電子病歷收集患者年齡、孕周孕酮水平等一般資料,入院后采集5 mL空腹靜脈血,低溫分離血漿,置-80 ℃冷凍保存。分別采集兩組女性人工流產(chǎn)術(shù)后的新鮮絨毛,生理鹽水常規(guī)沖洗,勻漿后取上清液待測,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清及絨毛組織上清液ADMA水平。Th17、Treg細(xì)胞采用美國Thrmo Fisher公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀檢測。白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)采用ELISA試劑盒檢測。收集的胎盤標(biāo)本冰凍切片,HE染色后由同一病理科醫(yī)師閱片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料采用2檢驗,計量資料采用t檢驗,以表示,通過閾值效應(yīng)分析孕婦與血漿及絨毛ADMA與URSA發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系,采用多因素Logistics回歸模型分析發(fā)生URSA的獨立危險因素,采用R軟件構(gòu)建列線圖預(yù)測模型。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較 訓(xùn)練集患者年齡20～37歲,平均(27.52±2.94)歲,孕周6～12周,平均孕周(9.22±1.89)周。測試集患者年齡22～36歲,平均(27.84±2.67)歲,孕周6～11周,平均孕周(8.89±1.74)周,訓(xùn)練集和測試集患者一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組孕婦年齡23～36歲,平均(28.01±2.88)歲,孕周6～10周,平均孕周(8.56±1.68)周。與對照組比較,URSA組患者IL-6、IL-17、Th17及Th17/Treg顯著增加,孕酮、IL-10、TGF-β及Treg顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.2 兩組患者外周血和絨毛組織ADMA表達 與對照組比較,URSA組血漿及絨毛組織ADMA表達均顯著增加(P<0.05),見表2。

表2 兩組患者外周血和絨毛組織ADMA表達

2.3 兩組胎盤病理形態(tài)學(xué)改變 對照組絨毛發(fā)育良好,而胎盤光學(xué)顯微鏡下可見不同程度的絨毛發(fā)育不良,合體結(jié)節(jié)增多,并伴有微血栓形成,見圖1。

圖1 兩組胎盤病理形態(tài)學(xué)改變

2.4 URSA發(fā)生的多因素分析 以表1中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)及血漿、絨毛組織ADMA表達為自變量,以是否發(fā)生URSA為因變量,進行多因素分析,結(jié)果顯示IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg及血漿ADMA、絨毛組織ADMA是發(fā)生URSA的獨立危險因素,而孕酮、IL-10、TGF-β及Treg是發(fā)生URSA的保護因素,見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析URSA發(fā)生的相關(guān)因素

2.5 血漿及絨毛ADMA與URSA的平滑曲線擬合 采用平滑曲線擬合血清血漿及絨毛ADMA與URSA的相關(guān)關(guān)系。在調(diào)整年齡、孕周等混雜因素后,采用廣義相加模型和曲線擬合分析血漿及絨毛ADMA與URSA的關(guān)系,結(jié)果顯示,血漿及絨毛ADMA與URSA呈線性正相關(guān)關(guān)系,隨著二者水平的升高,孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險增加,見圖2。

圖2 血漿及絨毛ADMA與URSA的平滑曲線擬合圖

2.6 血漿及絨毛ADMA與URSA的閾值效應(yīng)分析 調(diào)整受試者年齡、孕周等混雜因素后,當(dāng)血漿ADMA≥1.43 μmol/L時,血漿ADMA每增加0.6 μmol/L,孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險增加17%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.115,95%CI：0.102～0.133,P<0.05);當(dāng)血漿ADMA<1.43 μmol/L時,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.080,95%CI：0.912～1.215,P>0.05)。當(dāng)絨毛ADMA≥1.92 μmol/L時,絨毛ADMA每增加0.6 μmol/L,孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險增加14%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.192,95%CI：1.085～1.302,P<0.05);當(dāng)絨毛ADMA<1.92 μmol/L時,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=1.069,95%CI：0.926～1.118,P>0.05)。

2.7 模型構(gòu)建 采用“rms”程序包,根據(jù)篩選出的9個獨立影響因素建立預(yù)測孕婦發(fā)生URSA的列線圖預(yù)測模型。結(jié)果顯示,IL-6>190.45 nmol/L為35分,IL-17>916.25 nmol/L為15分,Treg<4.89%為30分,血漿ADMA>1.43 μmol/L為40分,IL-10<640.10 nmol/L為31分,TGF-β<2024.15 nmol/L為22.5分,Th17>2.62%為25分,絨毛ADMA>1.92 μmol/L為42.50分,Th17/Treg>0.56為20分,9項獨立影響因素總分為 261分,對應(yīng)孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險值為0.890,即模型預(yù)測孕婦發(fā)生URSA的概率為89.00%,見圖3。

圖3 預(yù)測孕婦發(fā)生URSA的列線圖預(yù)測模型

2.8 模型評價

2.8.1 ROC曲線評價模型區(qū)分度 采用ROC曲線對模型區(qū)分度進行評價,訓(xùn)練集AUC為0.758(95%CI：0.682～0.834,P<0.001);C-index為0.882。測試集AUC為0.732(95%CI：0.682～0.782,P<0.001);C-index為0.878。預(yù)測模型在訓(xùn)練集和測試集中的C-index均>0.75,模型區(qū)分度較高。見圖4。

圖4 預(yù)測模型在訓(xùn)練集和測試集中的ROC曲線

2.8.2 列線圖模型校準(zhǔn)度 評價繪制預(yù)測模型的校準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示模型的預(yù)測概率曲線與參考概率擬合度良好,Hosmer-Lemeshow檢驗結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示該模型準(zhǔn)確度較高,見圖5。

圖5 預(yù)測模型在訓(xùn)練集和測試集中的校準(zhǔn)曲線

2.8.3 列線圖模型有效性評價 繪制臨床決策曲線,結(jié)果顯示,在訓(xùn)練集和測試集中模型均遠離極端曲線,凈獲益高,提示構(gòu)建的列線圖模型安全可靠,實用性強。見圖6。

圖6 預(yù)測模型在訓(xùn)練集和測試集中的臨床決策曲線分析

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是臨床常見的婦科疾病,發(fā)生率約為1%～5%[9],隨著婦女流產(chǎn)次數(shù)的增多,出現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險也逐漸增加。其病因復(fù)雜,目前的研究認(rèn)為感染、遺傳、及內(nèi)分泌失調(diào)等均可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[10-12],但仍有部分患者病因不明。研究表明,在妊娠早期胚胎生長環(huán)境相對缺氧,氧分壓變化可影響絨毛血管生成,對胚胎的生長發(fā)育產(chǎn)生影響[13]。ADMA是L-精胺酸類似物,由Ⅰ型和Ⅱ型蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化后水解而來,最終通過二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylamine hydrolase,DDAH)代謝為L-瓜氨酸和二甲胺[14-15]。ADMA在細(xì)胞和組織中廣泛存在,是一氧化氮合酶的抑制劑,通過抑制NO的合成參與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的生理和病理過程[16]。

健康孕婦孕早期血漿ADMA有所下降,隨著妊娠時間的延長,血漿ADMA增加,而在孕晚期又降低至非孕期水平,究其機制,ADMA在孕早期水平降低可促進子宮螺旋動脈收縮,從而增強滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力,增加胎盤血供,促進胎兒正常生長發(fā)育[17];而在孕晚期,ADMA水平增加,NO水平降低,從而提高子宮收縮功能,促進產(chǎn)婦分娩[18]。此外,NO也在維持胎兒宮內(nèi)發(fā)育中發(fā)揮重要作用,可通過增加環(huán)鳥苷酸水平促進血管舒張,維持細(xì)胞及血漿轉(zhuǎn)運系統(tǒng)穩(wěn)定[19-20]。本研究顯示,URSA患者URSA組血漿及絨毛組織ADMA表達均顯著增加,通過選擇性結(jié)合NOS抑制NO的形成,導(dǎo)致血管完整性受到破壞、胎盤血流灌注不良,蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖受到抑制[21]。且本研究通過擬合曲線及閾值效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn),血漿及絨毛ADMA與URSA呈線性正相關(guān)關(guān)系,隨著二者水平的升高,孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險增加,當(dāng)血漿ADMA≥1.43 μmol/L時,血漿ADMA每增加0.6 μmol/L,孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險增加17%,;當(dāng)絨毛ADMA≥1.92 μmol/L時,絨毛ADMA每增加0.6 μmol/L,孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險增加14%。

本研究發(fā)現(xiàn),IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg及血漿ADMA、絨毛組織ADMA是發(fā)生URSA的獨立危險因素,而IL-10、TGF-β及Treg是發(fā)生URSA的保護因素。研究表明,URSA患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量較健康孕婦明顯增加,而Th17、Treg均屬CD4+T亞群,其中Th17可可通過分泌IL-6、IL-17等炎性因子調(diào)節(jié)免疫功能,導(dǎo)致母兒發(fā)生免疫排斥反應(yīng),導(dǎo)致流產(chǎn)[22-23]。而Treg細(xì)胞則主要分泌IL-10、TGF-β等抑制性炎性細(xì)胞因子,可間接提高母體免疫耐受程度,促進胎兒生存[24]。在正常的生理狀態(tài)下,Th17和Treg處于動態(tài)平衡,共同維持人體的免疫功能,而在URSA患者中,IL-6、IL-117、Th17及Th17/Treg較對照組顯著增加,孕酮、IL-10、TGF-β及Treg較對照組顯著降低,母體免疫反應(yīng)呈現(xiàn)“Th17趨向”,增強母兒免疫排斥反應(yīng)[25]?；诙嘁蛩鼗貧w分析結(jié)果,本研究構(gòu)建了風(fēng)險預(yù)測模型,通過對各獨立影響因素進行量化評分,從而評估孕婦發(fā)生URSA的風(fēng)險,ROC曲線、校準(zhǔn)曲線及臨床決策曲線評價結(jié)果顯示該預(yù)測模型區(qū)分度、準(zhǔn)確性較高,臨床有效性較好,可為臨床準(zhǔn)確預(yù)URSA的發(fā)生提供指導(dǎo)。

本研究納入的樣本量較少且數(shù)據(jù)來自單一中心,增加了選擇偏倚的風(fēng)險,后續(xù)研究需擴大樣本量進行多中心研究,以評估預(yù)測模型在不同環(huán)境及地域人群中的適用性。

4 結(jié)論

ADMA在URSA患者血漿及絨毛組織中的表達增加,是URSA發(fā)生的獨立危險因素,對URSA的發(fā)生具有一定的預(yù)測價值。