楊文博 孫云川 楊洪娟 杜強 徐旭英

(1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,河北 滄州 061000;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)院,北京 100000)

放療是腫瘤的主要治療方法,雖然其對腫瘤的治療效果顯著,但放射線在治療的同時還會損傷正常組織,引發(fā)放射性皮炎[1]。中醫(yī)認(rèn)為,放射線為火熱毒邪,在對放射性皮炎的治療中應(yīng)以清熱解毒為主,從而達到治療創(chuàng)傷皮膚的目的[2]。中醫(yī)對該病采用清熱解毒、益氣理脾等原則進行治療[3],清熱生肌膏具有清熱解毒、活血化瘀等作用,該藥已被證實對于治療燙傷具有顯著作用[4]。炎性反應(yīng)是機體在受到刺激后的保護性免疫反應(yīng),炎性反應(yīng)能力降低會導(dǎo)致機體受到感染,過高則會增加機體的炎癥,最終引發(fā)炎癥性疾病產(chǎn)生。冰原會激活炎性小體,而關(guān)于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)的研究是炎性小體中研究最為深入的。NLRP3參與多種炎癥疾病的始末,如腫瘤、炎癥性腸病等。研究證實NLRP3及其下游因子在多發(fā)性肌炎和皮肌炎中發(fā)揮重要作用,并與輔助性T細胞亞群聯(lián)系密切,一定程度上可誘導(dǎo)這些疾病的發(fā)展[5]。髓過氧化酶(Myeloperoxidase,MPO)可反應(yīng)中性粒細胞的數(shù)目與活性,是評價炎癥程度的指標(biāo)。羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)主要定位于皮膚、結(jié)締組織,可反映膠原蛋白的含量,其水平高低可反映膠原的合成能力,在皮膚愈合的過程中,可反應(yīng)創(chuàng)面修復(fù)程度。目前MPO、Hyp在燙傷中的作用已有研究證實[6-7],但關(guān)于兩者在放射性皮炎中的文獻較少,具體作用尚未完全掌握。因此文本研究清熱生肌膏介導(dǎo)NLRP3炎性小體對放射性皮炎大鼠皮膚損傷修復(fù)及MPO、Hyp表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SD健康大鼠90只,由長沙市天勤公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)-2019-0025],體質(zhì)量在200～300 g之間,鼠齡在6～8周,常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食飲水。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號：20190203)。

1.2 主要實驗試劑與儀器 清熱生肌膏(汕頭市美寶制藥有限公司,批號1312403A),二甲基苯蒽(上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司,貨號：D3254-100MG),復(fù)方茶多酚軟膏(大連市皮膚病醫(yī)院藥劑科研制),透射電鏡(蘇州沃弗本精密機械公司,型號：蔡司Xradia Context microCT);蘇木素-伊紅(廈門海菲生物公司);裂解液(北京普利萊基因技術(shù)公司);勻漿機(上海坤誠科學(xué)儀器公司);MPO、Hyp試劑盒(合肥萊爾生物公司);NLRP3、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-1)一抗(深圳豪地華拓生物公司)、山羊抗兔二抗(北京全式生物公司)。

1.3 藥物 清熱生肌膏組成：金銀花20 g,連翹20 g,蒲公英20 g,生黃芪20 g,玄參20 g,當(dāng)歸15 g,冰片10 g。

1.4 乳腺癌模型建立及放射性皮炎模型建立 參照文獻[8]建立放射性皮炎模型,將大鼠固定后,暴露左下肢,其余部位遮蔽,采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院60Co源照射,30 Gy γ 射線一次照射,照射劑量率0.68 Gy/min,照射距離2 m,照射時間12 min 2 s。按國際抗癌聯(lián)盟急性放射反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)[9],30只大鼠造模成功。

1.5 分組及干預(yù) 取80只大鼠隨機分為正常組、模型組、治療組、對照組,每組20只。除正常組外均建立放射性皮炎大鼠模型。正常組與模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng);治療組：大鼠于傷口處均勻涂抹清熱生肌膏,2次/d;對照組：大鼠于傷口處均勻涂抹復(fù)方茶多酚軟膏,2次/d。各給藥組均持續(xù)給藥3周[10]。剩余10只大鼠另設(shè)抑制劑組：取10只大鼠建立放射性皮炎模型,建模成功24 h后于尾靜脈注射NLRP3抑制劑(MCC950,10 mg·kg-1),用以蛋白印跡實驗。輻射傷后1、3、7、14、21 d[10]各組分別處死兩只大鼠,剩余大鼠于治療結(jié)束后立即處死用于后續(xù)實驗。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 創(chuàng)面愈合測定 輻射傷后1、3、7、14、21 d各組分別處死兩只大鼠。將創(chuàng)面描記在紙上,后用圖像分析儀測定面積。創(chuàng)面愈合率=(開始照射面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/開始照射面面積。

1.6.2 透射電鏡觀察創(chuàng)面組織細胞超微結(jié)構(gòu) 取各組大鼠創(chuàng)面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織)切成小塊后放入戊二醛中固定2 h,PBS清洗后固定0.5 h,PBS清洗,梯度脫水,包埋,制成50 nm超薄結(jié)構(gòu)組織,后用投射電鏡觀察。

1.6.3 蘇木素-伊紅( Hematoxylin,HE)染色觀察大鼠創(chuàng)面皮膚組織病理改變 取各組大鼠創(chuàng)面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織),石蠟切片,脫蠟、水化,蘇木素浸染 10 min,伊紅復(fù)染 5 min,脫水、透明、封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,并通過網(wǎng)形目鏡計數(shù)炎性細胞數(shù)量。

1.6.4 分光光度比色法測定MPO活性 取各組大鼠創(chuàng)面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織),裂解液裂解后勻漿機勻漿,在4 ℃、6000 r/min的條件下離心15 min,取上清液,離心15 min,取上清,在460 nm處測定OD值,MPO活性=(測定管OD值-對照管OD值)/11.3×取樣量。

1.6.5 樣本堿水解法檢測Hyp含量 Hyp在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈紫色,根據(jù)其呈色的深淺可推算其含量。稱量各組大鼠創(chuàng)面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織)放人試管中,加入水解液,混勻,加蓋后95 ℃或者沸水浴水解20min。調(diào)pH值至6.0～6.8,加入雙蒸水,混勻,加入適量活性炭,混勻。60 ℃水浴15 min,冷卻后3500 r/min離心10 min,取上清在波長550 nln處測定各管吸光度值。

1.6.6 免疫印跡檢測NLRP3、Caspase-1蛋白表達 取各組大鼠創(chuàng)面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織),剪碎,裂解液裂解,勻漿機勻漿,在4 ℃下離心5 min, 12000 r/min,取上清置于-20 ℃保存;根據(jù)試劑盒說明對蛋白定量。各組蛋白電泳上樣量30 μg,分離蛋白樣本,轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉后加NLRP3、Caspase-1一抗孵育過夜(1∶500),次日加入1∶10 000稀釋的山羊抗兔二抗,室溫孵育2 h,PBS清洗10 min 4次,Odyssey V3.0軟件分析,以各目的蛋白條帶與GAPDH條帶的灰度比值作為相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合比較 各組大鼠在治療后第1 d時的創(chuàng)面愈合比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),模型組大鼠在治療3-21 d時的創(chuàng)面愈合均低于治療組及對照組(P<0.05)。治療組與對照組大鼠治療3～21 d時創(chuàng)面愈合比較無差異(P>0.05)。見表1。

表1 創(chuàng)面愈合

2.2 各組大鼠創(chuàng)面組織細胞超微結(jié)構(gòu) 正常組大鼠皮膚組織細胞線粒體呈圓形,結(jié)構(gòu)清晰。模型組線粒體腫脹,呈凋亡細胞改變。與模型組相比,治療組與對照組有所改善,見圖1。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織細胞超微結(jié)構(gòu)(10000×)

2.3 各組大鼠皮膚病理形態(tài) 正常組大鼠真表皮層完整,細胞排列整齊,無壞死,模型組大鼠創(chuàng)面組織可見大量炎性細胞浸潤,表皮層壞死,結(jié)構(gòu)紊亂; 與模型組相比,治療組與對照組明顯改善。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠病理組織形態(tài)(100×)

2.4 各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中MPO、Hyp表達比較 與正常組相比,模型組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中MPO表達升高、Hyp表達降低(P<0.05)。與模型組相比,治療組模型組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中MPO表達降低、Hyp表達升高(P<0.05)。治療組與對照組各指標(biāo)對比無差異(P>0.05),見表2。

表2 各組大鼠 MPO、Hyp表達比較

2.5 各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達 與正常組相比,模型組NLRP3、Caspase-1蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組相比,治療組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達降低(P<0.05)。治療組與抑制劑組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白對比無差異(P>0.05)。見表3、圖3。

圖3 各組NLRP3、Caspase-1蛋白表達對比

表3 NLRP3、Caspase-1蛋白表達

3 討論

NLRs是機體免疫細胞的主要模式識別受體(Patho- gen recognition receptor,PRRs)之一。損傷相關(guān)分子激活NLRs后,通過炎性反應(yīng)維持免疫耐受等。在NLRs家族中,NLRP3的研究較為深入。NLRP3由胞漿內(nèi)多種蛋白組成,含有凋亡相關(guān)微粒蛋白等[11]。Caspase-1在炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,同時還具有介導(dǎo)細胞焦亡的作用。NLRP3炎癥小體是由其受體蛋白及Caspase-1等組成。NLRP3在被激活后可通過ASC與Caspase-1連接,組成NLRP3炎癥小體,激活Caspase-1增加炎性因子并分泌到胞外,從而參與炎癥反應(yīng)[12]。有研究表明,NLRP3/Caspase-1通路在皮肌炎中發(fā)揮促炎癥作用,基于此本實驗認(rèn)為抑制NLRP3表達可降低放射性皮炎的炎癥反應(yīng),促進創(chuàng)面愈合的作用[13]。清熱生肌膏中金銀花、連翹、蒲公英、玄參具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、消腫散結(jié)的功效;生黃芪、冰片具有清熱解毒、抗菌生肌的功效;當(dāng)歸補血活血,調(diào)經(jīng)止痛的功效。本研究運用NLRP3抑制劑作為對照組,證實清熱生肌膏具有抑制NLRP3表達,減少炎癥的作用。實驗結(jié)果顯示,NLRP3、Caspase-1在模型組中的表達顯著高于健康組,在經(jīng)過清熱生肌膏的干預(yù)后,NLRP3、Caspase-1水平顯著下降,且與NLRP3抑制劑組較為接近。NLRP3抑制劑可有效抑制NLRP3及Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達[14],提示清熱生肌膏也可抑制NLRP3的表達,從而降低炎癥反應(yīng)。目前已有研究證實復(fù)方茶多酚軟膏對與放射性皮炎具有一定的治療效果,因此文實驗運用該藥多為藥物對照,進一步證實清熱生肌膏具有促進創(chuàng)面愈合的作用[15]。實驗結(jié)果顯示,給藥第3、7、14、21 d時,治療組大鼠皮膚愈合率均顯著高于模型組且與對照組無差異,提示清熱生肌膏具有促進創(chuàng)面愈合的作用。皮膚組織中細胞的生成及結(jié)構(gòu)變化可反應(yīng)愈合情況,投射電鏡可有效觀察細胞的變化。本實驗HE染色結(jié)果證實了給予清熱生肌膏后可有效改善創(chuàng)面皮膚組織病理損傷情況。經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn),模型組細胞核染色質(zhì)濃聚,線粒體腫脹,呈凋亡細胞改變;與模型組相比,治療組與對照組有所改善。提示清熱生肌膏能夠改善放射性皮炎大鼠病理形態(tài),減少炎性細胞浸潤以及皮膚組織細胞凋亡。因此,本研究推測,清熱生肌膏可能是通過抑制NLRP3水平,抑制炎癥反應(yīng),改善病變組織病理形態(tài),促進創(chuàng)面愈合。

MPO具有有效的促氧化和炎癥的性質(zhì),是評價炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一,其水平的高低可有效監(jiān)測炎性反應(yīng)情況,對于本病的治理具有重要作用[16-18]。研究顯示[19],MPO在特應(yīng)性皮炎中為高表達,抑制其表達后,可抑制中性粒細胞浸潤,減輕Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸,約占其氨基酸總量的13%,Hyp的含量反映膠原在創(chuàng)面中的含量,從而評估創(chuàng)面愈合情況。目前已有研究顯示[20],Hyp在細菌感染皮炎中為低表達,提高其表達后,可促進膠原合成,促進創(chuàng)面愈合。本實驗結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,模型大鼠體內(nèi)MPO升高、Hyp降低,在經(jīng)過清熱生肌膏干預(yù)后,MPO降低,Hyp升高。研究顯示,在不穩(wěn)定型心絞痛患者體內(nèi),MPO及oxHDL可能通過調(diào)節(jié)NLRP3的表達,促使THP-1單核細胞產(chǎn)生IL-1β[21]。本文研究推測,清熱生肌膏通過抑制NLRP3水平,促進Hyp水平、抑制MPO表達,減少炎癥產(chǎn)生,促進膠原合成,較快創(chuàng)面愈合。

4 結(jié)論

清熱生肌膏可抑制MPO水平并促進Hyp表達,對放射性皮炎大鼠皮膚損傷修復(fù)有積極促進作用,其作用機制可能與介導(dǎo)NLRP3炎性小體有關(guān)。