王乙波 焦斌 王小強 陳歭行 曾慈梅

(海口市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 ,海南 ?？?570000)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80%,是肺癌的主要類型,且約3/4患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期,生存率較低[1-2]。研究NSCLC發(fā)展的分子機制,識別新的治療靶點可助力NSCLC的治療。成纖維細胞生長因子9(Fibroblast growth factor 9,FGF9)是一種生長因子,在血管生成、細胞凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。在胃癌、肝癌等惡性腫瘤中表達上調(diào)[5-6]。Liu等[7]研究顯示,肺鱗癌中FGF9表達上調(diào)可促進細胞增殖與侵襲,但在臨床中FGF9研究卻較少。SMAD2是TGF-β信號傳導(dǎo)通路中的重要分子,被TGF-β活化后轉(zhuǎn)移至核內(nèi),參與對基因的調(diào)控,研究顯示,SMAD2在NSCLC細胞中水平升高[8-9]。有關(guān)FGF9、SMAD2在NSCLC進展中發(fā)揮何種作用以及與預(yù)后的關(guān)系仍不確定。因此本研究將分析NSCLC組織中FGF9、SMAD2表達與臨床病理以及預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集本院2018年1月-2020年12月期間的NSCLC患者臨床資料75例,男性46例,女性29例,年齡30～75歲,平均(50.77±6.52)歲,鱗狀細胞癌、腺癌、其他肺癌例數(shù)分別為33例、15例和27例;有無吸煙史患者分別為40例、35例;TNM分期I+II期、III期分別為48例、27例;高+中分化與低分化分別為48例、27例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別為33例、42例。癌組織與癌旁組織標本分別稱作NSCLC組、癌旁組織組。納入標準：①經(jīng)過X射線檢查、CT及磁共振等影像學(xué)檢查及手術(shù)病理確診。②初次發(fā)現(xiàn)疾病。③患者知情同意。排除標準：①多臟器受損者。②手術(shù)前化療者。③合并其他部位惡性腫瘤。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核、批準后實施(批號：20171121)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測NSCLC及癌旁組織中FGF9、SMAD2的表達 制備石蠟標本,常規(guī)脫蠟,并經(jīng)抗原修復(fù),室溫條件下封閉,加入兔抗人FGF9、SMAD2一抗(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜后加入山羊抗兔lgG H&L(1∶2 000稀釋),37 ℃孵育1 h,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,酸酒精短暫分化后,脫水、透明、封片。FGF9、SMAD2表達于細胞質(zhì),免疫組織化學(xué)結(jié)果判定采用半定量方法[10],最終評分<3分為陰性表達,≥3分為陽性表達。

1.2.2 NSCLC患者FGF9、SMAD2表達與臨床病理的關(guān)系 根據(jù)NSCLC癌組織FGF9、SMAD2蛋白表達陰陽性將患者分別分為FGF9陰性表達組、FGF9陽性表達組,SMAD2陰性表達組、SMAD2陽性表達組,比較組間年齡、性別、吸煙史、組織類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度差異。

1.2.3 患者隨訪 多種方式(電話、微信等)隨訪NSCLC患者,隨訪時間最長為36個月,記錄此間患者生存狀態(tài)。無進展生存期(Progression-free survival,PFS)為隨機化開始至第1次出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或癌因死亡時間,總生存期(Overall survival,OS)為患者隨機化開始至全因死亡的時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料(FGF9陰陽性、SMAD2陰陽性)采用n(%)描述,組間比較采用χ2檢驗;Spearman法分析NSCLC癌組織FGF9、SMAD2表達相關(guān)性;K-M曲線分析NSCLC患者FGF9、SMAD2蛋白表達陰陽性與患者3年生存期的相關(guān)性;COX回歸分析危險因素(NSCLC患者預(yù)后不良)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織及癌旁組織中蛋白FGF9、SMAD2的表達 FGF9、SMAD2陽性表達情況,見圖1。與癌旁組織相比,NSCLC組織中FGF9表達陽性率、SMAD2表達陽性率升高(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC組織及癌旁組織中FGF9、SMAD2的表達[n,n(×10-2)]

圖1 NSCLC組織及癌旁組織中FGF9、SMAD2的表達(免疫組化法,400×)

2.2 NSCLC組織中FGF9、SMAD2的表達與患者臨床病理關(guān)系 NSCLC組織中FGF9陽性表達、陰性表達分別為53例、22例;SMAD2陽性表達、陰性表達分別為58例、17例。FGF9、SMAD2陽性表達、陰性表達與患者年齡、性別、吸煙史、組織類型無關(guān)(P>0.05);是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM I+II期與TNM III期NSCLC患者FGF9陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM I+II期與TNM III期、高+中分化與低分化NSCLC患者SMAD2陽性表達率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 FGF9、SMAD2的表達與NSCLC患者臨床病理特征間的關(guān)系

2.3 NSCLC組織中蛋白FGF9、SMAD2的相關(guān)性分析 NSCLC組織中FGF9、SMAD2陰陽性表達正相關(guān)(r=0.281,P<0.05),見表3。

表3 NSCLC組織中FGF9、SMAD2蛋白的相關(guān)性分析

2.4 蛋白FGF9、SMAD2表達與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪期間FGF9陽性表達組(死亡42例)患者累積生存率(20.8%)低于陰性表達組(死亡5例)(77.3%),組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log rankχ2=22.243,P<0.05);SMAD2陽性表達組(死亡43例)患者累積生存率(25.9 %)低于陰性表達組(死亡4例)(76.5 %),組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log rankχ2=13.791,P<0.05),見圖2。術(shù)后隨訪期間FGF9陽性表達組(PFS 48例)患者無進展生存率(9.4 %)低于陰性表達組(PFS 8例)(63.6 %),組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log rankχ2=34.045,P<0.05);SMAD2陽性表達組(PFS 49例)患者無進展生存率(15.5 %)低于陰性表達組(PFS 7例)(58.8 %),組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log rankχ2=18.097,P<0.05),見圖3。

圖2 FGF9(左)、SMAD2(右)與NSCLC患者OS的關(guān)系

圖3 FGF9(左)、SMAD2(右)與NSCLC患者PFS的關(guān)系

2.5 COX回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后的因素 單因素顯示,年齡>50歲、有吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、TNM分期III期、FGF9陽性表達、SMAD2陽性表達是影響NSCLC患者預(yù)后的危險因素(P<0.05);多因素COX分析表明,TNM分期III期、FGF9陽性表達、SMAD2陽性表達是NSCLC患者預(yù)后不良的危險因素(P<0.05),見表4。

表4 COX回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后的因素

3 討論

NSCLC是肺癌中的最常見類型,其發(fā)生與多種基因的激活以及失活有關(guān),針對它抑癌基因以及促癌基因進行研究,有助于NSCLC的分子靶向治療。

FGF9是成纖維細胞生長因子家族成員之一,最初發(fā)現(xiàn)于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系,是一種自分泌與旁分泌的生長因子,在人體組織與細胞中廣泛存在,參與血管生成、骨骼發(fā)育、腫瘤生長與凋亡等多重生理病理進程[11-12]。FGF9在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌基因作用,Ren等[13]研究顯示,FGF9在胃癌組織中高表達,FGF9高表達是生存不良的預(yù)測因素,敲除FGF9表達可抑制胃癌細胞系生長并誘導(dǎo)細胞凋亡;Yin等[14]研究顯示,FGF9影響腎腫瘤微環(huán)境與血管活性,抑制腎癌細胞的惡性轉(zhuǎn)移。在肺癌中,FGF9刺激的成纖維細胞可能分泌了未知因子,激活了FGF受體2,隨后促進了肺腺癌細胞的生長[15];FGF9可被miR-4317靶向抑制放緩NSCLC細胞的增殖[16]。本研究中NSCLC癌組織中FGF9表達陽性率顯著高于癌旁組織,與其在肺癌細胞中的表達趨勢一致,提示FGF9可能在NSCLC中發(fā)揮促癌作用參與NSCLC的癌發(fā)生。FGF9與性別、年齡、腫瘤類型、分化程度無關(guān),發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM III期的NSCLC患者FGF9陽性率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、I、II分期、中高分化患者,提示FGF9不受性別、年齡、腫瘤類型的影響,FGF9與NSCLC的癌進展高度相關(guān),可能通過促進癌轉(zhuǎn)移參與NSCLC的進展。研究發(fā)現(xiàn),FGF9可與miRNA如miR-499a-5p、miR-187靶向結(jié)合,miR-499a-5p、miR-18的下調(diào)預(yù)示著NSCLC患者更差的預(yù)后[17-18]。在本研究中,NSCLC患者FGF9陽性表達組預(yù)后較陰性表達組差,且FGF9陽性表達是NSCLC預(yù)后不良的危險因素。提示FGF9與NSCLC患者預(yù)后有關(guān),FGF9陽性表達可能預(yù)示著不良預(yù)后,需提高關(guān)注程度,這可能與FGF9能夠激活MAPK通路,增強癌細胞增殖、EMT、細胞遷移和侵襲,并進一步促進癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。但FGF9影響NSCLC進展的關(guān)鍵機制仍有待進一步分析探討。

SMAD2是SMD家族成員之一,SMD介導(dǎo)多種信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄,SMAD2介導(dǎo)TGF-β信號,從而調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、分化等多種細胞過程,磷酸化的SMAD2可易位至細胞核,與靶啟動子結(jié)合,發(fā)揮作用[20]。盧其香等[21]研究顯示,肺癌組織與細胞中SMAD2 mRNA水平與蛋白表達上調(diào),下調(diào)其表達可抑制肺癌細胞增殖、遷移能力;楊成等[22]研究顯示,下調(diào)miR-423-5p可能通過抑制TGF-β/SMAD通路激活,抑制肺癌細胞腦轉(zhuǎn)移;靶向抑制SMAD2表達可抑制肺腺癌A549細胞遷移與侵襲[23]。本研究中,NSCLC患者SMAD2陽性表達率高于癌旁組織,SMAD2陽性表達者中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM III期、低分化者占比高于SMAD2陰性表達,且SMAD2陽性表達預(yù)后較SMAD2陰性表達差,提示SMAD2表達與NSCLC患者臨床病理與預(yù)后相關(guān),SMAD2陽性預(yù)示著較差預(yù)后,COX回歸曲線也驗證這一結(jié)果。Zeng等[24]報道稱,SMAD2基因主要富集在腫瘤相關(guān)通路中,如TGF-β信號通路、Hippo信號通路和FoxO信號通路,SMAD2水平異常與NSCLC的預(yù)后相關(guān),SMAD2可能是NSCLC的預(yù)后生物標志物和潛在靶點。本研究經(jīng)過相關(guān)性分析顯示FGF9與SMAD2正相關(guān),提示FGF9與SMAD2可能通過某種聯(lián)系共同參與NSCLC的癌進展。Sun等[25]研究顯示,FGF9可通過調(diào)控TGF-β1/SMAD2/3信號通路抑制血管緊張素原誘導(dǎo)的心臟纖維化。本研究認為FGF9可能通過TGF-β影響SMAD2表達,共同參與NSCLC的癌進展,但相關(guān)機制需要細胞實驗進行驗證分析。目前本研究存在一定不足,FGF9、SMAD2參與NSCLC癌進展的機制有待進行細胞實驗以及體內(nèi)實驗探討。

4 結(jié)論

NSCLC組織FGF9、SMAD2陽性表達升高,均與患者臨床病理特征以及預(yù)后相關(guān),FGF9、SMAD2可能共同參與NSCLC的癌進展。