石明亮，王曉磊，申洋，朱碩，王航宇

（1.河南大學第一附屬醫(yī)院普外一科，開封 475000；2.河南大學第一附屬醫(yī)院消化內科，開封 475000）

原發(fā)性肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿且進展快，多數患者就診時已進入中晚期或發(fā)生了轉移，致使失去手術最佳治療機會，而因嚴重的肝功能減退又無法耐受長期放化療，故臨床治療難度大且效果差，患者生存率不高[1-2]。炎癥因子作用于癌癥細胞引發(fā)的炎癥是癌癥發(fā)生發(fā)展的易感條件，Hippo 作為調控細胞再生和器官發(fā)育的保守信號，可通過調控炎癥介導前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[3]，Yes 相關蛋白（YAP）作為Hippo 通路的主要關鍵效應物之一，促使YAP 信號失活可通過調控免疫與抑制炎癥而抑制腫瘤發(fā)生[4]，Hippo 信號是肝癌發(fā)生所必需的，阻止其激活可抑制肝癌進展并導致其腫瘤消退[5]，由此靶向Hippo 來控制炎癥是肝癌的潛在防治策略。茯苓酸是自利水滲濕藥茯苓中提取的一種蒽酮型三萜化合物，在茯苓中的含量為0.07%～0.09%，具有顯著的抗氧化、抗衰老、抗炎和抗癌等生物學活性，可抑制不同類型癌癥細胞的生長并誘導其凋亡，能有效降低肝癌細胞HepG2 和Huh7 的生長和轉移潛力[6]，并能抑制腎癌和結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[7-8]，二乙基亞硝胺引發(fā)大鼠免疫異常激活，誘發(fā)肝臟嚴重炎癥損傷是誘導大鼠肝臟發(fā)生癌變的重要原因，因而推測茯苓酸可能通過其抗炎功效對DEN 誘導的肝癌發(fā)揮治療作用，本文通過制備DEN 誘導的肝癌大鼠模型，探究茯苓酸調節(jié)Hippo 信號通路對其的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠（7 周齡，體質量220～250 g） 采購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號：SCXK（魯）2019-0003，于本院維持屏障環(huán)境且溫度為23～25 ℃的動物房中飼養(yǎng)，房內相對濕度為50%～60%，光照為黑暗交替進行（明暗各12 h）。

1.1.2 主要試劑與儀器 二乙基亞硝胺（DEN）（批號N109570） 采購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；茯苓酸[純度98.1%，密度（1.1±0.1）g/cm3，沸點（612.2±55.0）℃，760 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa），可溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）等有機溶劑，批號10015]采購于上海詩丹德標準技術服務有限公司；氟尿嘧啶（批號100187-200602）采購于上海勁馬實驗設備有限公司；大鼠白細胞介素（IL）-6酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒、大鼠IL-17 ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒采購于江蘇科惟生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒采購于上海尚寶生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、LATS1、p-YAP1 及YAP1 一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗采購于美國Abcam 公司等。

全自動生化分析儀（型號BK-200）采購于山東博浩生物科技有限公司；全自動冰凍切片機（型號HS-4080）采購于濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；倒置生物顯微鏡（型號AI-WSI3000）采購于廣州微域光學儀器有限公司；酶標儀（型號Model 680）、小型垂直電泳套裝（型號Mini-PROTEAN Tetra）采購于美國Bio-Rad 公司等。

1.2 方法

1.2.1 肝癌大鼠模型的建立及分組給藥 以0.9%氯化鈉溶液溶解DEN 制為10 mg/mL 的儲備液備用，取SD 大鼠隨機分為對照組、模型組、茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組、氟尿嘧啶組，每組10 只，模型組和給藥組大鼠通過腹腔注射DEN 誘導建立肝癌模型，具體方法參照文獻[9]：按5 mL/kg 進行腹腔注射，使DEN 注射劑量達到50 mg/kg，每周注射2 次，連續(xù)注射4 周后改為每周注射1 次，持續(xù)8 周即完成造模，對照組大鼠腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液，造模大鼠隨機選出5 只開腹檢測成癌情況，發(fā)現大鼠肝臟形態(tài)腫大且質地變硬，表面粗糙并有大量大小不一、密集排布的白色顆粒狀結節(jié)出現，即可表明肝癌造模成功，造模成瘤率為100%。

以0.9%氯化鈉溶液溶解茯苓酸制為0.35、0.7、1.4 mg/mL 的藥液備用，以0.9%氯化鈉溶液溶解氟尿嘧啶制為5 mg/mL 的藥液備用，各組大鼠均于造模4 周后開始給藥直至造模結束：茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組大鼠分別腹腔注射0.35、0.7、1.4 mg/mL 的茯苓酸藥液10 mL/kg（使茯苓酸劑量分別達到3.5、7、14 mg/kg，1 次/d）[10]；氟尿嘧啶組大鼠腹腔注射5 mg/mL 的氟尿嘧啶藥液10 mL/kg（使氟尿嘧啶劑量分別達到50 mg/kg，每周1 次）[11]；模型組和對照組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL/kg，各組大鼠均給藥處理8 周。

1.2.2 檢測各組大鼠體質量、肝功能、肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、最大癌結節(jié)體積及采集標本 首次給藥后稱量各組大鼠體質量，記為第0 周，每隔1 周測量1 次體質量，直至第4 周給藥結束；末次給藥后24 h 以乙醚麻醉各組大鼠，采集其尾靜脈血離心（4 ℃、1 000 r/min、10 min，離心半徑20 cm）取血清，采用全自動生化分析儀檢測其中肝功能指標谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平；再次采集尾靜脈血離心（4 ℃、1 000 r/min、10 min，離心半徑20 cm）取血清后將其存在-80℃冰箱保存；稱量各組大鼠體質量后開腹取出肝臟，稱出其質量后計算肝臟指數，公式為：肝臟指數=肝臟質量/體質量×100%，計數肝臟表面癌結節(jié)數量，測量出其中最大癌結節(jié)長徑a、短徑b 后算出其體積，公式為：最大癌結節(jié)體積=ab2/2；剪下約0.4 g 肝組織存在液氮內，剩余肝組織固定于10%甲醛內過夜，然后依次浸泡分級乙醇（70%、80%、90%、100%）脫水、二甲苯透明及浸蠟包埋，修成小方塊后進行連續(xù)切片備用。

1.2.3 HE 染色檢測各組大鼠肝組織病理形態(tài) 肝組織石蠟切片浸泡二甲苯脫蠟、分級乙醇（100%、90%、80%、70%）水化后用HE 試劑盒內染色行HE 染色，然后在倒置生物顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)，并采集切片任意6 個視野圖像，用Image J軟件定量每個視野中浸潤的炎性細胞數目，取平均值得到各組的炎性細胞浸潤數。

1.2.4 測定各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α與氧化應激因子SOD、CAT、MDA 的水平 各組大鼠血清取出放入冰水浴中提前解凍，采用試劑盒測量其中炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α 與氧化應激因子SOD、CAT、MDA 水平，具體步驟參照各自試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠肝組織Hippo信號通路相關蛋白表達 各組大鼠肝組織剪碎加入預冷的RAPI 裂解液內，于冰水浴中高速研磨成勻漿液，4 ℃離心（3 000 r/min、20 min，離心半徑20 cm）取上清獲得各組總蛋白樣品液，以BCA 法測出其中蛋白濃度，然后于沸水浴內加熱致使蛋白變性，每組取出20 μg 總蛋白樣本通過跑SDS-PAGE電泳進行分離，然后通過濕轉將其電轉至PVDF 膜上，將LATS1、p-YAP1、GAPDH、YAP1 蛋白條帶自膜上剪下，封閉其非特異位點后行抗原抗體反應（分別孵育相對應一抗和二抗），經化學發(fā)光顯色后采集各組蛋白條帶圖像，用Quantity One 軟件定量其灰度值后算出各待測蛋白與內參GAPDH 蛋白間比值，即得出各組待測蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數據采用GraphPad Prism 8.0 軟件行多分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 茯苓酸對大鼠肝功能的影響 與對照組比較，模型組大鼠給藥結束后體質量顯著降低（P＜0.05），血清肝功能指標ALT、AST 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠給藥結束后體質量升高（P＜0.05），血清肝功能指標ALT、AST 水平降低，且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，給藥結束后體質量與血清肝功能指標ALT、AST水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠在給藥期間的體質量變化曲線Fig.1 Body weight change curves of rats in each group during administration

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平（±s）Tab.1 SerumALTandASTlevelsofratsineachgroup（±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平（±s）Tab.1 SerumALTandASTlevelsofratsineachgroup（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 給藥結束后體質量（g） ALT（U/L） AST（U/L）對照組 10 497.12±25.38 42.56± 4.84 108.47±10.94模型組 10 190.15±12.31* 145.74±17.21* 301.72±31.24*茯苓酸低劑量組 10 283.57±20.32# 112.43±13.02# 237.56±24.35#茯苓酸中劑量組 10 376.13±21.02#△ 79.10±11.65#△ 172.31±21.82#△茯苓酸高劑量組 10 478.57±20.32#△▲ 45.62± 7.14#△▲115.82±17.43#△▲氟尿嘧啶組 10 482.34±22.30#△▲ 44.28± 6.79#△▲112.90±15.61#△▲

2.2 茯苓酸對大鼠肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、最大癌結節(jié)體積的影響 與對照組比較，模型組大鼠肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、最大癌結節(jié)體積顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、最大癌結節(jié)體積降低，且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、最大癌結節(jié)體積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠肝臟及腫瘤大體觀察Fig.2 Gross observation of liver and tumor of rats in each group

表2 各組大鼠肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、最大癌結節(jié)體積（±s）Tab.2 Liver index，number of liver surface cancer nodules，and maximum cancer nodule volume of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、最大癌結節(jié)體積（±s）Tab.2 Liver index，number of liver surface cancer nodules，and maximum cancer nodule volume of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

最大癌結節(jié)體積（mm3）對照組 10 2.37±0.32 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 6.61±0.43* 14.20±1.50* 310.97±36.35*茯苓酸低劑量組 10 5.21±0.34# 9.80±0.93# 242.65±24.33#茯苓酸中劑量組 10 4.02±0.26#△ 5.40±0.72#△ 169.21±15.17#△茯苓酸高劑量組 10 2.79±0.31#△▲ 0.90±0.20#△▲ 98.39±11.82#△▲氟尿嘧啶組 10 2.58±0.30#△▲ 0.60±0.18#△▲ 81.20±9.50#△▲組別 動物數 肝臟指數（%）肝表面癌結節(jié)數（個）

2.3 茯苓酸對大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 對照組大鼠肝小葉結構正常，肝組織無病理損傷；模型組大鼠肝組織發(fā)生癌變：肝小葉結構受損被分割，肝細胞大小不一且變性壞死，可見細胞核且呈雙核、多核等病理性分裂象的肝癌細胞大量增加，并呈巢狀、梁狀或灶狀排列，瘤灶內伴有炎癥細胞浸潤，模型組大鼠炎癥細胞浸潤數相比對照組顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠肝組織上述癌變癥狀均減輕，且癌變減輕程度隨茯苓酸劑量升高而增強，炎癥細胞浸潤數降低且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，肝組織癌變減輕程度無明顯差異，炎癥細胞浸潤數差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、表3。

圖3 各組大鼠肝組織病理形態(tài)（×200）Fig.3 Pathological morphology of liver tissue of rats in each group(×200)

表3 各組大鼠肝組織炎癥細胞浸潤數（±s）Tab.3 Number of inflammatory cell infiltration in liver tissue of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠肝組織炎癥細胞浸潤數（±s）Tab.3 Number of inflammatory cell infiltration in liver tissue of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 炎癥細胞浸潤數（個）對照組 10 9.13±2.94模型組 10 54.81±5.23*茯苓酸低劑量組 10 40.35±4.01#茯苓酸中劑量組 10 27.02±3.34#△茯苓酸高劑量組 10 14.13±2.81#△▲氟尿嘧啶組 10 11.20±3.02#△▲

2.4 茯苓酸對大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平降低，且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平（±s）Tab.4 Serum IL-6，IL-17，and TNF-α levels of rats in each group（±s） pg/mL

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平（±s）Tab.4 Serum IL-6，IL-17，and TNF-α levels of rats in each group（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 IL-6 IL-17 TNF-α對照組 10 94.69±13.46 13.78± 1.38 26.97± 3.81模型組 10 295.48±26.21* 82.95±12.43* 152.74±17.25*茯苓酸低劑量組 10 226.37±18.12# 58.52± 7.35# 112.82±15.34#茯苓酸中劑量組 10 161.20±15.39#△ 37.89± 5.46#△ 72.13±11.46#△茯苓酸高劑量組 10 105.13±11.03#△▲16.17± 3.20#△▲31.11± 6.62#△▲氟尿嘧啶組 10 99.21±9.57#△▲ 14.91± 2.65#△▲28.95± 4.05#△▲

2.5 茯苓酸對大鼠血清氧化應激因子SOD、CAT、MDA 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清SOD、CAT 水平顯著降低（P＜0.05），MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠血清SOD、CAT 水平升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05），且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，血清SOD、CAT、MDA 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清SOD、CAT、MDA 水平（±s）Tab.5 Serum SOD，CAT，and MDA levels of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠血清SOD、CAT、MDA 水平（±s）Tab.5 Serum SOD，CAT，and MDA levels of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 SOD（U/mL） CAT（U/mL） MDA（nmol/L）對照組 10 115.43±6.14 4.98±0.40 5.42±0.53模型組 10 76.62±4.05* 2.15±0.21* 11.36±0.80*茯苓酸低劑量組 10 87.97±4.28# 2.90±0.19# 9.43±0.65#茯苓酸中劑量組 10 99.16±5.01#△ 3.81±0.17#△ 7.54±0.46#△茯苓酸高劑量組 10 112.08±5.40#△▲ 4.67±0.13#△▲ 5.80±0.42#△▲氟尿嘧啶組 10 113.12±4.96#△▲ 4.79±0.15#△▲ 5.61±0.37#△▲

2.6 茯苓酸對大鼠肝組織Hippo 信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠肝組織LATS1 蛋白表達及p-YAP1/YAP1 顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠肝組織LATS1 蛋白表達及p-YAP1/YAP1 降低（P＜0.05），且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，LATS1 蛋白表達及p-YAP1/YAP1 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4、表6。

圖4 各組大鼠肝組織Hippo 信號通路相關蛋白表達Fig.4 Hippo signaling pathway related protein expression in liver tissue of rats in each group

表6 各組大鼠肝組織Hippo 信號通路相關蛋白相對表達（±s）Tab.6 Relative expression of Hippo signaling pathway related proteins in liver tissue of rats in each group（±s）

表6 各組大鼠肝組織Hippo 信號通路相關蛋白相對表達（±s）Tab.6 Relative expression of Hippo signaling pathway related proteins in liver tissue of rats in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 LATS1/GAPDH p-YAP1/YAP1對照組 10 0.15±0.02 0.07±0.01模型組 10 1.33±0.13* 0.98±0.14*茯苓酸低劑量組 10 0.98±0.09# 0.69±0.08#茯苓酸中劑量組 10 0.59±0.07#△ 0.40±0.05#△茯苓酸高劑量組 10 0.19±0.05#△▲ 0.10±0.02#△▲氟尿嘧啶組 10 0.17±0.04#△▲ 0.09±0.01#△▲

3 討論

目前中國肝癌發(fā)病率年年上升，如今已成為排在第2 位的造成癌癥性死亡的惡性腫瘤，臨床主要以化學藥物進行治療，但存在諸如不良反應大、易產生耐藥性等局限性，因此要提高肝癌患者生存率和生活質量還需探尋更有效且安全的新型藥物[12-13]。本文采用腹腔注射DEN 誘導建立肝癌大鼠模型，實驗結果發(fā)現模型組大鼠血清SOD、CAT 水平顯著降低，血清ALT、AST、IL-6、IL-17、TNF-α 與MDA 水平、肝組織炎癥細胞浸潤數顯著升高，表明DEN 引發(fā)大鼠體內嚴重炎癥與氧化應激，揭示炎癥及氧化應激引起的肝組織損傷是DEN 誘導肝癌的重要病理基礎。

茯苓是一種利水滲濕類中藥，具有安神、寧心、健脾、利水、滲濕的功能，茯苓酸作為茯苓的主要活性成分之一，可發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)和抗腫瘤的藥理作用，能呈劑量依賴性地降低宮頸癌細胞活力并抑制其在裸鼠體內生長[6，14]，還可用于肺癌的治療，降低肺癌細胞活性及其耐藥蛋白表達[15]，并可顯著抑制肝癌細胞生長、上皮-間質轉化、侵襲、遷移和轉移[6]，因而推測茯苓酸可能用于治療肝癌。本文以不同劑量茯苓酸處理DEN 誘導的肝癌大鼠，可升高大鼠血清SOD、CAT 水平并降低其血清ALT、AST、IL-6、IL-17、TNF-α 與MDA 水平、炎癥細胞浸潤數，與文獻[10]研究結果相似，證實了茯苓酸具有抗炎功效，但本文還表明茯苓酸可增強抗氧化酶活性，對DEN 誘發(fā)的炎癥和氧化應激起到明顯抑制作用；茯苓酸還可升高DEN 誘導的肝癌大鼠體質量，減輕其肝組織癌變癥狀，降低其肝臟指數、肝表面癌結節(jié)數、腫瘤質量，且呈劑量依賴性，與文獻[6，14-15]研究結果相似，證實了茯苓酸具有抗癌活性，且表明了茯苓酸可減輕DEN 誘導的大鼠肝組織癌變癥狀，減少其肝組織內腫瘤結節(jié)形成，改善大鼠肝功能，最終發(fā)揮明顯的抗癌作用，且劑量越高，作用越強，揭示茯苓酸在肝癌的防治中具有很高的研發(fā)應用潛力。

Hippo 是重要的致癌信號，在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中處于異常激活狀態(tài)，抑制其激活可減輕結直腸癌的生長和肝轉移[16]，研究顯示刺激Hippo 信號激活可促進肝細胞癌細胞的干性和化療耐藥性的產生，抑制Hippo 信號傳導可顯著降低肝細胞癌的干細胞特性和索拉非尼、樂伐替尼耐藥性，增強化療藥物對體內腫瘤的消退作用，最終對肝癌發(fā)揮顯著抗癌功效[5，17]。本文結果顯示，DEN 誘導的肝癌大鼠肝組織Hippo 信號通路相關蛋白LATS1 表達及YAP1 磷酸化顯著升高，而不同劑量茯苓酸處理的大鼠肝組織LATS1 蛋白表達及YAP1 磷酸化相比肝癌模型大鼠降低，表明Hippo 信號參與介導DEN 誘導的肝癌發(fā)生發(fā)展過程，且茯苓酸延緩DEN 誘導的大鼠肝癌發(fā)生時可抑制Hippo 信號激活，揭示茯苓酸治療DEN 誘導的肝癌大鼠的分子機制可能是阻止Hippo 信號激活，本文首次證實了Hippo 信號參與茯苓酸對DEN 誘導的肝癌大鼠的治療過程，對于臨床研發(fā)茯苓酸的肝癌治療方案提供了新的理論依據，并可發(fā)揮一定積極作用。

綜上所述，茯苓酸可降低Hippo 信號通路相關蛋白LATS1 表達及YAP1 磷酸化，阻止DEN 誘導的炎癥和氧化應激反應發(fā)生發(fā)展，抑制大鼠肝組織癌變及肝組織內腫瘤結節(jié)形成，修復其肝功能，對DEN誘導的肝癌大鼠起到顯著的治療作用，抑制Hippo信號激活可能是藥理機制之一，本文為臨床治療肝癌提供了新的治療思路和藥物候選，有助于患者預后的改善，但本文對茯苓酸治療肝癌的藥理機制只進行了初步研究，其證據效力存在一定不足，后續(xù)需要用Hippo 信號激活劑和抑制劑進行實驗來作對照驗證。