解錦香，史斌琦，馬占強

（中國藥科大學中藥學院，南京 211198）

坤寧顆粒源于24 代中醫(yī)世家峏山楊婦科圣方，處方由益母草、當歸、赤芍、丹參、郁金、牛膝、枳殼、木香、荊芥炭、干姜炭、茜草等11 種藥材組成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)坤寧顆粒具有良好的活血化瘀功效，可以顯著降低氣滯血瘀模型大鼠的全血黏度、血漿黏度[1]，氣滯血瘀是引起痛經(jīng)的主要證型，臨床研究表明坤寧口服液可以顯著改善氣滯血瘀型痛經(jīng)[2]，坤寧顆粒方中益母草、當歸去瘀生新為君，赤芍、丹參、郁金、牛膝為臣，活血化瘀，調(diào)理沖任，活血化瘀中藥能改善血液流變學、改善微循環(huán)，還能抑制炎癥和鎮(zhèn)痛[3]。然而坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠的藥理作用尚未研究，本實驗初步研究坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清中內(nèi)分泌激素、炎癥因子、氧化應激水平和子宮組織中相關蛋白表達的影響，探討其抗炎鎮(zhèn)痛的作用及機制，為坤寧顆粒的充分開發(fā)和應用提供實驗參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性未孕SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經(jīng)營部，許可證號：SCXK（滬）2018-0006。大鼠飼養(yǎng)于中國藥科大學藥學動物實驗中心，許可證號：SYXK（蘇）2018-0019，室內(nèi)溫度為23～26 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h 明暗交替，自由攝食和飲水，適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。該實驗研究獲得中國藥科大學實驗動物倫理委員會的批準（批準號2021-11-012）。

1.2 藥品與試劑 坤寧顆粒（生產(chǎn)批號：210501，宿州億帆制藥有限公司）；戊酸雌二醇片（批號：627A，拜爾醫(yī)藥保健有限公司）；縮宮素注射液（批號：210803，寧波第二雌激素廠）；益母草顆粒[批號：20110165，北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司]；前列腺素F2α（PGF2α）試劑盒（E-EL-R0795c）、前列腺素E2（PGE2）試劑盒（E-EL-0034c）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）試劑盒（E-EL-R0105c）、雌二醇（E2）試劑盒（EOSEL-R0001）、孕酮（PROG）試劑盒（E-EL-0154c）、白介素-1β（IL-1β）試劑盒（E-EL-R0012c）、白介素-6（IL-6）試劑盒（E-EL-R0015c）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（E-EL-R2856c）、超敏化學發(fā)光（ECL）試劑盒均為Elabscience 公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號20220314）、MDA 試劑盒（批號20220314）、GSH-Px 試劑盒（批號20220311）均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；COX-2 抗體（66351-1-lg）、GAPDH 抗體（10494-1-AP）為Proteintech公司產(chǎn)品；PTGER2抗體（ab167171）、ERα抗體（ab32063） 為abcam 公司產(chǎn)品；HRP 標記的山羊抗兔lgG 抗體（貨號BS13278）為Bioworlde 公司產(chǎn)品；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0010）、PMSF（貨號ST506）、RIPA 裂解液（貨號P0013B）均為碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 儀器 5810R 臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；全波長酶標儀（美國Thermo 公司）；ESP300 電泳儀（上海天能科技有限公司）；蛋白免疫印跡法（Western Blot）轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；BSA124S 電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；切片掃描儀（Hamamatsu 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 將雌性SD 大鼠隨機平均分為6 組，正常對照組、模型組、益母草顆粒組（3.5 g/kg）、坤寧顆粒低劑量組（1.4 g/kg）、坤寧顆粒中劑量組（2.8 g/kg）、坤寧顆粒高劑量組（5.6 g/kg），每組10 只，其中坤寧顆粒中劑量和陽性對照藥益母草顆粒為臨床用量，人與大鼠等效劑量換算比例按1∶7，藥物用蒸餾水配制。除正常對照組外其余組大鼠進行造模：第1、10 天灌胃給予戊酸雌二醇每只0.2 mg，第2～9 天每只0.1 mg。從第5 天開始灌胃給藥，大鼠給藥體積均為1 mL/10g，正常對照組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，第10 天末次給藥1 h后，正常對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組每只大鼠腹腔注射縮宮素10 U。

2.2 扭體反應次數(shù)的檢測 注射縮宮素后將大鼠單獨放在籠子里，立即觀察30 min 內(nèi)大鼠的疼痛扭體反應，即為子宮強烈收縮的指標，計算扭體次數(shù)。扭體表現(xiàn)：腹部內(nèi)凹，軀干與后肢伸展，臀部與一側(cè)肢體內(nèi)旋。扭體抑制率（%）=（模型組扭體數(shù)-給藥組扭體數(shù)）/模型組扭體數(shù)×100%。

2.3 組織樣本的采集 扭體反應完成后，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，腹主動脈取血，于室溫靜置1 h后，3 000 r/min 離心15 min，離心半徑9.6 cm，吸取上層血清。處死大鼠，取其子宮組織，用作蘇木精-伊紅（HE）染色和Western Blot 檢測。

2.4 ELISA 檢測大鼠血清中PGF2α、PGE2、β-EP、E2、PROG、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平 按照酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒說明分別測定各組大鼠血清中PGF2α、PGE2、β -EP、E2、PROG、IL -1β、IL -6、TNF-α 水平，在450 nm 下檢測吸光度A 值，用標準曲線算得其含量。

2.5 比色法檢測大鼠血清中SOD、GSH-Px、MDA水平 按照試劑盒說明書操作步驟要求，測定2.3 中取得的大鼠血清中SOD、GSH-Px 酶活力和MDA 含量。

2.6 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠子宮組織病理形態(tài) 將子宮組織置于4%多聚甲醛固定48 h，進行石蠟包埋、切片、HE 染色觀察子宮組織病理學變化，觀察子宮內(nèi)膜損傷程度及有無炎細胞浸潤等現(xiàn)象。

2.7 Western Blot 檢測大鼠子宮組織COX -2、PTGER2、ERα蛋白表達 從-80 ℃冰箱中取出保存的子宮組織，用含1% PMSF 的RIPA 裂解液勻漿提取蛋白，BCA 法測定濃度，等量蛋白在SDS-PAGE凝膠經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中，室溫用5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃過夜孵一抗，TBST 室溫洗滌3 次，每次10 min，然后4 ℃孵二抗2 h，TBST 室溫洗滌3 次，每次10 min，ECL 曝光，儀器顯影。用Image J軟件分析灰度值以統(tǒng)計蛋白表達量。

2.8 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad Prism 7.00 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠扭體反應次數(shù)的影響 結(jié)果如表1 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠扭體反應次數(shù)顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠扭體反應次數(shù)顯著降低（P＜0.01）。扭體抑制率隨劑量增加而遞增，呈劑量相關性。

表1 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠扭體次數(shù)的影響（±s）Tab.1 Effect of Kunning Granules on the writhing response numbers of dysmenorrhea model rats（±s）

表1 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠扭體次數(shù)的影響（±s）Tab.1 Effect of Kunning Granules on the writhing response numbers of dysmenorrhea model rats（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別 劑量（g/kg） 扭體數(shù)（次） 扭體反應抑制率（%）正常對照組 - 0 -模型組 - 15.5±4.3## -益母草顆粒組 3.5 7.6±1.1** 50.97坤寧顆粒低劑量組 1.4 8.8±1.3** 43.23坤寧顆粒中劑量組 2.8 6.7±0.9** 56.78坤寧顆粒高劑量組 5.6 5.6±1.0** 63.87

3.2 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清PGF2α、PGE2、β-EP 含量的影響 結(jié)果如表2 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中PGF2α含量明顯升高（P＜0.05），PGE2、β-EP 含量顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型組相比，坤寧顆粒中、高劑量組PGF2α含量顯著降低（P＜0.01），PGE2、β-EP 含量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。

表2 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清PGF2α、PGE2、β-EP 含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Kunning Granules on serum PGF2α，PGE2，and β-EP content in dysmenorrhea model rats（±s）

表2 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清PGF2α、PGE2、β-EP 含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Kunning Granules on serum PGF2α，PGE2，and β-EP content in dysmenorrhea model rats（±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

β-EP（pg/mL）正常對照組 - 12.5±2.1 110.7± 8.2 76.7± 6.1模型組 - 15.5±0.8# 79.6±13.2# 43.6± 5.1##益母草顆粒組 3.5 12.2±1.6* 115.9±25.0* 72.7±16.6**坤寧顆粒低劑量組 1.4 14.0±2.4 88.0±13.6 46.5± 4.7坤寧顆粒中劑量組 2.8 11.7±1.3** 107.7±11.7* 68.7±11.7**坤寧顆粒高劑量組 5.6 10.6±0.7** 117.2±10.1** 91.4± 6.7**組別 劑量（g/kg）PGF2α（pg/mL）PGE2（pg/mL）

3.3 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清E2、PROG 含量的影響 結(jié)果如表3 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中E2含量顯著升高（P<0.01），PROG 含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，坤寧顆粒中、高劑量組大鼠血清中E2含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），PROG 含量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。

表3 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清E2、PROG 含量的影響（±s）Tab.3 Effect of Kunning Granules on serum E2 and PROG content in dysmenorrhea model rats（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g/kg） E2（pg/mL） PROG（ng/mL）正常對照組 - 234.3±31.5 9.6±0.4模型組 - 351.7±31.4## 7.5±1.1##益母草顆粒組 3.5 231.6±51.7** 8.8±0.8*坤寧顆粒低劑量組 1.4 274.4±47.7 8.7±0.3坤寧顆粒中劑量組 2.8 254.0±40.4* 8.8±0.5*坤寧顆粒高劑量組 5.6 242.3±63.5** 9.2±0.7**

3.4 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 結(jié)果如表4 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，坤寧顆粒低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α 含量顯著下降（P＜0.01），坤寧顆粒中、高劑量組IL-6含量顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）。

表4 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響（±s）Tab.4 Effect of Kunning Granules on serum IL-1β，IL-6 and TNF-α content in dysmenorrhea model rats（±s）

表4 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響（±s）Tab.4 Effect of Kunning Granules on serum IL-1β，IL-6 and TNF-α content in dysmenorrhea model rats（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

TNF-α（pg/mL）正常對照組 - 119.6±16.1 93.2±21.2 326.4±13.6模型組 - 175.3± 5.7## 125.1± 5.8## 395.7±27.5##益母草顆粒組 3.5 91.3±31.7** 105.0± 3.6* 316.7±28.3**坤寧顆粒低劑量組 1.4 120.6±13.0** 110.4±12.2 329.6±14.6**坤寧顆粒中劑量組 2.8 116.4±19.7** 102.5± 5.7* 303.5±14.1**坤寧顆粒高劑量組 5.6 109.5± 7.5** 101.0± 7.4** 296.4±25.1**組別 劑量（g/kg）IL-1β（pg/mL）IL-6（pg/mL）

3.5 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px 水平的影響 結(jié)果如表5 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中SOD 和GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量升高（P＜0.01）。與模型組比較，坤寧顆粒中、高劑量組大鼠血清中SOD和GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），坤寧顆粒低、中、高劑量組大鼠血清中MDA 含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

表5 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清SOD、GXH-Px、MDA水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Kunning Granules on serum SOD，GSHPx and MDA content in dysmenorrhea model rats（±s）

表5 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠血清SOD、GXH-Px、MDA水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Kunning Granules on serum SOD，GSHPx and MDA content in dysmenorrhea model rats（±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

MDA（nmol/mL）正常對照組 - 129.58±8.69 2.55±0.29 6.99±0.52模型組 - 116.34±7.07# 2.22±0.16# 8.19±0.40##益母草顆粒組 3.5 129.01±2.54* 2.58±0.12* 6.96±0.40**坤寧顆粒低劑量組 1.4 123.89±4.98 2.50±0.15 7.15±0.62*坤寧顆粒中劑量組 2.8 130.08±9.27* 2.53±0.06* 7.10±0.68*坤寧顆粒高劑量組 5.6 138.68±6.02** 2.68±0.17** 7.02±0.50**組別 劑量（g/kg）SOD（U/mL）GSH-Px（mmol/L）

3.6 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織病理學的影響 結(jié)果如圖1 HE 染色顯示，正常對照組子宮組織結(jié)構形態(tài)正常，未見明顯改變，模型組大鼠子宮內(nèi)膜和肌層充血、水腫嚴重，上皮細胞變性壞死等現(xiàn)象，與模型組比較，益母草顆粒組和坤寧顆粒各給藥組大鼠子宮內(nèi)膜和肌層充血水腫程度略減輕。

3.7 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織COX-2、PTGER2蛋白表達的影響 結(jié)果如圖2 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠子宮組織COX-2 蛋白相對表達量顯著增加（P＜0.05），PTGER2蛋白表達量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，坤寧顆粒低、中、高劑量組大鼠子宮組織中COX-2 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01），坤寧顆粒高劑量組大鼠子宮組織中PTGER2蛋白相對表達量顯著增加（P＜0.01）。

圖2 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織COX-2、PTGER2蛋白表達的影響（±s）Fig.2 Effect of Kunning Granules on COX-2 and PTGER2 protein expression levels in uterine tissue of dysmenorrhea model rats（±s）

3.8 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織ERα蛋白表達的影響 結(jié)果如圖3 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠子宮組織中ERα蛋白相對表達量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，坤寧顆粒中、高劑量組大鼠子宮組織中ERα蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）。

圖3 坤寧顆粒對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織ERα 蛋白表達的影響（±s）Fig.3 Effect of Kunning Granules on ERα protein expression levels in uterine tissue of dysmenorrhea model rats（±s）

4 討論

本研究采用戊酸雌二醇致敏后再使用縮宮素致痛的方法制備PD 大鼠模型，原因是雌二醇可增強子宮平滑肌細胞對縮宮素的敏感性，縮宮素可引起子宮強烈收縮，從而導致痛經(jīng)的發(fā)生[4]。模型組大鼠扭體反應次數(shù)顯著增加，表明模型建立成功。PGF2α是一種有效的血管收縮劑，PGF2α生成增加與子宮肌層強烈收縮引起血流受損有關，而PGE2活性取決于其受體激活的類型，PGE2與EP2型受體（PTGER2）結(jié)合通過升高細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷誘導子宮平滑肌松弛[5]。COX-2 為誘導型酶，對花生四烯酸代謝產(chǎn)生的前列腺素負責炎癥反應[6]。實驗ELISA 結(jié)果表明坤寧顆?？梢燥@著降低模型大鼠體內(nèi)PGF2α含量，升高PGE2含量，并通過Western Blot 對大鼠子宮組織COX-2、PTGER2蛋白表達水平進行測定，結(jié)果表明坤寧顆?？梢燥@著抑制COX-2 蛋白表達水平，顯著升高PTGER2表達水平，從而調(diào)節(jié)PGF2α和PGE2的合成和釋放。β-EP 是一種具有嗎啡樣活性的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛多肽[7]，其降低可引起疼痛，ELISA 結(jié)果顯示坤寧顆?？梢燥@著升高模型大鼠體內(nèi)β-EP 含量。這些結(jié)果表明坤寧顆粒有良好的調(diào)經(jīng)止痛作用，可以顯著減少戊酸雌二醇聯(lián)合縮宮素誘發(fā)的大鼠扭體反應次數(shù)，抑制扭體反應的發(fā)生。

炎癥反應過程中的各種介質(zhì)，在痛經(jīng)的發(fā)病過程中起到了重要作用[8]。IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子可以刺激PGF2α的合成和釋放，引起子宮平滑肌的過度收縮[9]。痛經(jīng)模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著升高，坤寧顆粒各劑量組可以顯著降低模型大鼠血清中炎癥因子水平，并呈劑量依賴性關系，表明坤寧顆粒有顯著的抗炎作用，且低、中、高劑量結(jié)果相差不明顯，可能與坤寧顆粒的劑量設計偏大有關。病理學染色觀察到模型組大鼠子宮組織充血、水腫等現(xiàn)象，坤寧顆粒給藥組大鼠子宮組織形態(tài)逐漸改善。

炎癥過程誘導氧化應激并降低細胞抗氧化能力，過度產(chǎn)生的活性氧與細胞膜脂肪酸和蛋白質(zhì)反應，損害細胞功能[10]。正常情況下，機體的氧化與抗氧化處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，當機體抗氧化狀態(tài)降低，抗氧化酶如SOD、GSH-Px 活性降低，MDA 水平升高[11]。實驗結(jié)果表明坤寧顆粒能夠顯著提高痛經(jīng)模型大鼠血清中SOD、GSH-Px 活性，顯著降低MDA 含量，從而通過抗氧化損傷而發(fā)揮抗炎作用。

PROG 也是一種重要的抗炎激素，研究表明PROG 可以降低脂質(zhì)過氧化，減輕氧化應激以及減少炎性細胞因子IL-1β、TNF-α 的釋放，并抑制COX-2 的信號激活[12-13]。實驗ELISA 結(jié)果表明模型組大鼠體內(nèi)PROG 水平顯著降低，而坤寧顆粒中、高劑量組大鼠體內(nèi)PROG 水平顯著升高。過量的E2可以促進炎癥反應，促進ERα的生成[14]，較高的ERα表達可增加疼痛相關反應[15]，ELISA 結(jié)果和Western Blot 結(jié)果表明模型組大鼠經(jīng)過雌激素增敏后E2的含量和ERα的表達顯著上升，而坤寧顆粒能顯著降低痛經(jīng)模型大鼠E2的含量和ERα的表達。研究表明活血化瘀藥具有雌激素樣作用[16]，能與ERα結(jié)合介導血管舒張[17]，因此可以增加血流量，改善子宮血液循環(huán)，緩解子宮局部缺血缺氧的狀態(tài)，進而緩解疼痛，其具體作用機制有待進一步深入研究。

綜上所述，痛經(jīng)模型大鼠體內(nèi)疼痛、炎癥反應顯著增加，坤寧顆?？梢燥@著通過下調(diào)COX-2/PGF2α水平，升高PTGER2受體介導的PGE2水平，改善子宮平滑肌收縮，提高鎮(zhèn)痛效應，并顯著降低炎癥因子水平，改善氧化應激達到抗炎鎮(zhèn)痛作用，還可以通過調(diào)節(jié)雌孕激素及ERα水平，起到抗炎、舒張血管作用，從而緩解氣滯血瘀型痛經(jīng)癥狀。