周詩遠(yuǎn)，楊永可，熊飛然，陸妍，趙軼文，劉嘉妍，史慧妍，石學(xué)敏

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸科，天津 300193；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；3.寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)科，寧波 315800；4.河北省三河市中醫(yī)院中醫(yī)科，廊坊 065200；5.天津市北辰區(qū)雙環(huán)邨街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，天津 300134；6.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；7.天津市西青區(qū)中北鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心針灸科，天津 300111）

高血壓病是最常見的慢性病，常被稱為“無聲的殺手”，大多數(shù)臨床患者可在沒有任何癥狀的情況下發(fā)病，并且血管壁長期承受著高于正常的壓力會導(dǎo)致冠心病、腦卒中等嚴(yán)重的心腦血管疾病。心腦血管疾病現(xiàn)已成為中國人口死亡的主要原因，高血壓病正是其首要的危險因素[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，2015 年中國18 歲以上人群中已有2.45 億的高血壓病患者[2]，2017 年中國有254 萬人死于收縮壓升高，傷殘調(diào)整壽命年超過5%[3]。高血壓病的病理過程為復(fù)雜的血管生物學(xué)改變，主要以血管重構(gòu)為突出表現(xiàn)，這也是高血壓導(dǎo)致靶器官損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前高血壓病的治療目標(biāo)不再僅僅是以血壓降低為標(biāo)準(zhǔn)，更重要的是對靶器官的保護，以降低致殘率和病死率[4]。

“活血散風(fēng)” 針刺法是石學(xué)敏院士針對高血壓病的治療而創(chuàng)立，此法以人迎穴為主穴，具有明確手法量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，是治療高血壓病的一套規(guī)范、成熟的方法[5]。石院士認(rèn)為由氣海失司導(dǎo)致氣逆而上引發(fā)的高血壓直接輸出于人迎穴，因此針刺此處能直接調(diào)節(jié)氣海，使上逆之氣歸于平和，起到穩(wěn)定血壓的作用。但對其機制尚不清楚。高血壓導(dǎo)致的靶器官損害其早期常表現(xiàn)為頸動脈內(nèi)中膜的增厚，研究表明RhoA/ROCK 信號通路與高血壓以及血管損傷的發(fā)病機制密切相關(guān)[6]。前期諸多臨床研究證實針刺人迎穴在降低血壓及改善血管損傷發(fā)揮靶器官保護方面顯示出了一定的優(yōu)勢[7-8]，因此推測針刺人迎穴可能通過調(diào)控RhoA/ROCK 信號通路介導(dǎo)的血管損傷發(fā)揮降壓及靶器官保護的作用。本實驗采用自發(fā)性高血壓大鼠模型，通過觀察針刺人迎穴對大鼠平均動脈壓及血管損傷相關(guān)調(diào)控因子內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、人血小板衍化生長因子-AA（PDGF-AA）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和RhoA、ROCK1 表達(dá)的影響，揭示人迎穴降壓及改善血管損傷的作用機制，從而為針刺降壓及針刺保護靶器官提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF 級11 周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠27 只，體質(zhì)量（350±50）g，隨機分為模型組（SHR）、西藥組（Medicine）、針刺組（Acup），每組各9 只，同周齡雄性Wistar 大鼠9 只，體質(zhì)量（300±50）g作為正常組（Wistar）。以上動物均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK （京）2016-0006，每5 只一籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實驗。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 中研太和牌一次性無菌針灸針（0.25 mm×40 mm）；鼠尾無創(chuàng)血壓儀（北京軟隆生物技術(shù)有限公司BP98A）；PCR 擴增儀（德國，Eppendorf公司）；熒光定量PCR 儀Rotor Gene 6000（美國，Corbett 公司）；BioPhotometer plus（德國，Eppendorf公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，Varioskan LUX）；伯樂基礎(chǔ)電泳儀（美國，BIORAD 公司）；伯樂垂直電泳槽（美國，BIORAD 公司）；伯樂轉(zhuǎn)移電泳槽（美國，BIORAD 公司）；Chemstudio 多功能成像儀（德國耶拿，G119717）。

1.2.2 主要試劑 大鼠ANG-Ⅱ酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）Kit武漢華美生物CSB-E04494r；大鼠ROCK1 ELISA Kit 武漢華美生物CSB-el020058ra；Anti- ET-1 antibody [TR.ET.48.5] ab2786；Anti- PDGF-AA antibody[EPR19924] ab203911；Anti-MMP2 antibody ab37150；Anti-Rho antibody[EP487Y] ab40673；Alexa Fluor 594標(biāo)記山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG，H+L）中杉金橋ZF-0513；Alexa Fluor 594 標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）中杉金橋ZF -0516；BCA protein assaykit CWBIO CW0014S；Trizol Reagent（Invitrogen life technologies公司，15596-018）；Oligo（dT）18 primer（Thermo 公司，MAN0013109）；HiFi-MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（CWBIO 公司，CW0744M）；高純dNTP（10 mmol/L，each，CWBIO公司）。

1.3 治療及檢測方法

1.3.1 穴位選取 人迎穴：參照中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”[9]，根據(jù)人和大鼠解剖特點和人迎穴定位特點，確定大鼠人迎穴定位：頸部三角區(qū)內(nèi)，當(dāng)胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌上緣交點，約當(dāng)頸總動脈分叉處，體表可觸及搏動。

1.3.2 治療方法 人迎組：直刺5 mm，可見針柄隨頸動脈搏動而上下振動。西藥組：厄貝沙坦[安博維，30 mg/（kg·d）]，溶解于2 mL 水中，灌胃。SHR 組和Wistar 組不治療但給予相同的抓取。針刺采用管針垂直進(jìn)針約5 mm，以保證刺入深度的一致性。針刺入穴位后行捻轉(zhuǎn)補法30 s（向前用力為補），然后留針1 min。治療為5 次/周，連續(xù)6 周。

1.3.3 血壓測量 將大鼠裝入測血壓固定器中，待大鼠平靜波形穩(wěn)定后，給尾套充氣加壓測量大鼠血壓，測量3 次取平均值作為大鼠本次血壓值。各組大鼠共針刺6 周，并于干預(yù)前，治療3 周，治療6 周測量3 次平均動脈血壓值。

1.4 取材及檢測指標(biāo)和方法

1.4.1 取材 用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉后取頸動脈組織，組織經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液（PBS）及4%多聚甲醛灌注取材后保存于多聚甲醛溶液的標(biāo)本瓶或凍存管中，放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 ELISA 測定AngⅡ、ROCK1 的濃度 取頸動脈組織100 mg 加入1 mL PBS 進(jìn)行勻漿，3 000 r/min，離心15 min，離心半徑8 cm，離心后取上清液進(jìn)行檢測；或取血液離心取血清進(jìn)行檢測。依照試劑盒說明書加樣、孵育、顯色，用酶標(biāo)儀測定每孔OD 值（吸光度設(shè)為450 nm 波長）；用公式計算頸動脈組織AngⅡ和血清中ROCK1 的濃度。

1.4.3 實時熒光定量PCR 法檢測ET-1 和PDGFAA 基因表達(dá) 取頸動脈組織100 mg 剪碎液氮研磨，加入Trizol 裂解液提取總RNA，將mRNA 反轉(zhuǎn)cDNA 后，將體系進(jìn)行擴增，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共33 個循環(huán)，總反應(yīng)體系20 μL。擴增PCR引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.4.4 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測ET-1 和PDGF-AA 蛋白表達(dá) 取頸動脈組織100 mg 剪碎加入裂解液裂解30 min，離心后取上清液，BCA 法計算樣本蛋白濃度。加入蛋白緩沖液，在100 度沸水浴中反應(yīng)10 min 使蛋白變性，制備分離膠和濃縮膠上樣后進(jìn)行電泳，采用半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜；室溫平衡30 min 后洗膜，加入二抗，37 ℃孵育1 h 后，進(jìn)行ECL 反應(yīng)成像出圖，用Image J 軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.4.5 免疫熒光檢測MMP2、RhoA 蛋白定位及表達(dá)取頸動脈組織于4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切成4 μm 的組織切片，將石蠟切片脫蠟至水，滴加一抗工作液（1%BSA 稀釋）：MMP2 1∶150 或RhoA 1∶100 4 ℃過夜；結(jié)合二抗工作液Alexa Fluor 594 標(biāo)記山羊抗鼠IgG 滴度為1∶80 或Alexa Fluor 594 標(biāo)記山羊抗兔IgG 滴度為1∶80，洗滌后封片，在顯微鏡下觀察并拍片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD 法；若方差不齊采用Games-Howell 法；多時點采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別大鼠平均動脈壓結(jié)果 與正常組比較，模型組、西藥組、針刺組在治療前，治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓均顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，西藥組和針刺組在治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓顯著降低（P＜0.05），與西藥組比較，針刺組在治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與治療前比較，西藥組和針刺組在治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 不同組別平均動脈壓結(jié)果比較（±s）Tab.2 Comparison of mean arterial pressure results among different groups（±s） mmHg

表2 不同組別平均動脈壓結(jié)果比較（±s）Tab.2 Comparison of mean arterial pressure results among different groups（±s） mmHg

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與本組治療前比較，△P＜0. 05；1 mmHg≈0.133 kPa。

組別 動物數(shù) 治療前 治療3 周 治療6 周正常組 9 126.54±25.20 111.25± 9.07 121.46± 4.69模型組 9 164.33±14.65* 172.18±19.04* 165.33±23.37*西藥組 9 176.00±16.90* 157.03±16.85*#△ 143.15±10.51*#△針刺組 9 169.20±14.63* 157.17± 8.73*#△ 152.10± 7.79*#△

2.2 不同組別大鼠頸動脈組織中ET-1 和PDGFAA mRNA 表達(dá)結(jié)果 與正常組比較，模型組在治療6 周時的ET-1 和PDGF-AA 的mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和針刺組在治療6 周時ET-1 和PDGF-AA 的mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 頸動脈組織內(nèi)ET-1，PDGF-AA mRNA 的水平（±s）Tab.3 Levels of ET-1 and PDGF-AA mRNA in carotid artery tissue（±s）

表3 頸動脈組織內(nèi)ET-1，PDGF-AA mRNA 的水平（±s）Tab.3 Levels of ET-1 and PDGF-AA mRNA in carotid artery tissue（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) ET-1（2-ΔΔCt） PDGF-AA（2-ΔΔCt）正常組 3 1.00±0.24 1.00±0.34模型組 3 1.59±0.22* 1.78±0.48*西藥組 3 1.08±0.38# 1.05±0.25#針刺組 3 1.10±0.06# 1.04±0.26#

2.3 不同組別大鼠頸動脈組織ET-1 和PDGF-AA蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常組比較，模型組在治療6 周時的ET-1 和PDGF-AA 的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和針刺組在治療6 周時ET-1 和PDGF-AA 的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖1，表4。

圖1 干預(yù)后各組大鼠PDGF-AA，ET-1 的蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of PDGF-AA and ET-1 in each group of rats after intervention

表4 頸動脈組織內(nèi)ET-1 ，PDGF-AA 的蛋白表達(dá)水平（±s）Tab.4 The protein expression levels of ET-1 and PDGF-AA in carotid artery tissue（±s）

表4 頸動脈組織內(nèi)ET-1 ，PDGF-AA 的蛋白表達(dá)水平（±s）Tab.4 The protein expression levels of ET-1 and PDGF-AA in carotid artery tissue（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) ET-1/β-actin PDGF-AA/β-actin正常組 3 0.24±0.03 0.30±0.03模型組 3 0.69±0.12* 0.66±0.22*西藥組 3 0.47±0.03# 0.41±0.08#針刺組 3 0.49±0.09# 0.37±0.11#

2.4 不同組別大鼠頸動脈組織MMP2 和RhoA 免疫熒光結(jié)果 與正常組比較，模型組、西藥組和針刺組在治療6 周時的MMP2 和RhoA 的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組在治療6 周時RhoA 的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），針刺組在治療6 周時MMP2 和RhoA 的蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。見表5，免疫熒光染色圖見OSID 二維碼。

表5 頸動脈組織內(nèi)MMP2，RhoA 的水平（±s）Tab.5 The levels of MMP2 and RhoA in carotid artery tissue（±s）

表5 頸動脈組織內(nèi)MMP2，RhoA 的水平（±s）Tab.5 The levels of MMP2 and RhoA in carotid artery tissue（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) MMP2 RHOA正常組 5 4.68±0.93 4.76±0.75模型組 5 53.12±5.04* 53.72±3.23*西藥組 5 48.64±9.49* 46.08±7.59*#針刺組 5 43.68±7.11*# 44.40±7.67*#

2.5 不同組別大鼠頸動脈組織Ang Ⅱ和血清ROCK1 ELISA 結(jié)果 與正常組比較，模型組，西藥組和針刺組在治療6 周時的AngⅡ和ROCK1 的蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和針刺組在治療6 周時AngⅡ和ROCK1 的蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，針刺組在治療6 周時AngⅡ和ROCK1 的蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。見表6。

表6 頸動脈組織AngⅡ和血清ROCK1 的水平（±s）Tab.6 The levels of Ang Ⅱin carotid artery tissue and serum ROCK1（±s）

表6 頸動脈組織AngⅡ和血清ROCK1 的水平（±s）Tab.6 The levels of Ang Ⅱin carotid artery tissue and serum ROCK1（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù) AngⅡ（pg/mg） ROCK1（ng/mL）正常組 3 182.25±8.09 5.93±0.09模型組 3 257.56±6.32* 37.34±2.42*西藥組 3 229.50±0.82*# 24.24±0.35*#針刺組 3 205.69±0.75*#△ 18.10±0.25*#△

3 討論

高血壓病的發(fā)生發(fā)展與血管結(jié)構(gòu)和功能的異常有著密切的關(guān)系，高血壓通過各種因素引發(fā)血管損傷，同時血壓的升高也加劇了血管損傷最終造成心，腦，腎等靶器官損害，壓力水平與血管損傷之間是一個逐漸加劇的過程，兩者相互關(guān)聯(lián)，并相互促進(jìn)[10-11]。高血壓病造成的血管損傷是一個復(fù)雜的病變過程，涉及到血管的內(nèi)膜、中膜、外膜及細(xì)胞外基質(zhì)的參與。內(nèi)皮素-1（ET-1）是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的一種縮血管多肽，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后釋放活性物質(zhì)破壞自身調(diào)節(jié)體系平衡，導(dǎo)致ET-1 合成增多，血管張力調(diào)節(jié)功能紊亂，內(nèi)皮依賴性舒張力下降，血管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，繼而導(dǎo)致血壓升高[12-13]。有研究表明腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAAS）與高血壓有著密切的關(guān)系，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為RAAS中最重要的效應(yīng)分子之一，是一種縮血管因子，可促進(jìn)外周血管收縮和醛固酮分泌導(dǎo)致血壓升高[14-15]。血小板源生長因子（PDGF）是血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞肌細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，PDGF 有3 個二聚體（AA、BB、AB），PDGFAA 是其亞型之一。研究顯示[16-18]，PDGF-AA 能促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和分裂，PDGF-AA 正常分泌能誘導(dǎo)血管的生成，異常升高能夠引起血管的強烈收縮及粥樣硬化性病變[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)膜損傷后，它周圍的內(nèi)皮細(xì)胞會釋放出一些促生長因子，如PDGF 和ET-1 等，啟動平滑肌細(xì)胞增殖引發(fā)血管重構(gòu)[20]。基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是一種鋅依賴性酶，能切割細(xì)胞外基質(zhì)成分，研究表明MMP2 在多種因素所致血管損傷過程中均發(fā)揮重要作用，其在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種不同類型的細(xì)胞中都可分泌，MMP2 作為血管重構(gòu)調(diào)節(jié)的重要信號通路之一，其激活可引發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成血管損傷[21-22]。本實驗結(jié)果顯示，針刺人迎穴能明顯降低SHR 大鼠的平均動脈壓，且能達(dá)到與西藥相似的降壓療效，并隨著針刺時間的增加，治療6 周比3 周能達(dá)到更好的降壓效果。表明針刺發(fā)揮效應(yīng)的方式是隨時間而蓄積的，與藥物相比，針刺發(fā)揮作用的方式相對較緩，這樣可避免血壓大幅度波動對血管造成的損傷。同時針刺人迎穴后頸動脈組織中ET-1、PDGF-AA、AngⅡ、MMP2 的表達(dá)水平明顯下降。表明針刺可能通過調(diào)節(jié)血管釋放出的相關(guān)活性因子來改善血壓并抑制血管損傷。

Rho 蛋白是小G 結(jié)合蛋白Ras 超家族成員之一，其通過激活下游蛋白激酶ROCK 而產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如介導(dǎo)內(nèi)皮功能異常、血管平滑肌的收縮、肌動蛋白細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞黏附與遷移、細(xì)胞增殖與凋亡等，因此RhoA/ROCK 通路在如高血壓病、動脈粥樣硬化、心力衰竭等心血管疾病的病理過程中發(fā)揮了重要作用是治療的新靶點[23-24]。研究表明ET-1 作為內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種強烈的可收縮血管的活性物質(zhì)，是調(diào)控RhoA/ROCK 通路重要的因子，并可通過RhoA/ROCK 通路影響血管的收縮和內(nèi)皮的功能[25]。AngⅡ作為RAAS 系統(tǒng)的主要生物活性肽通過G 蛋白偶聯(lián)受體AT1 受體刺激血管平滑肌細(xì)胞的肥大、增殖和遷移，有研究表明AT1 受體的激活可引起HEK293 和A10 細(xì)胞形態(tài)的改變，這種改變是依賴RhoA/ROCK 通路所介導(dǎo)[26-27]。PDGF 作為重要的生長因子，可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的有絲分裂和趨化效應(yīng)，參與血管損傷重構(gòu)過程中新生內(nèi)膜的形成，并能通過Rho/ROCK 通路影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移[28]。血管平滑肌細(xì)胞從中膜向內(nèi)膜遷移需要克服許多屏障，主要是其周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，MMPs 是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，在血管平滑肌細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮了重要作用。有研究利用siRNA 干擾技術(shù)使血管平滑肌細(xì)胞中ROCK1的表達(dá)下調(diào)，結(jié)果顯示在ROCK1 表達(dá)下調(diào)的同時MMP2 的表達(dá)和活性也隨之降低，表明MMP2 可能是ROCK1 的下游分子并影響血管平滑肌細(xì)胞的遷移[29-30]。本實驗結(jié)果顯示，針刺人迎穴在調(diào)節(jié)ET-1、PDGF -AA、Ang Ⅱ、MMP2 因子同時能明顯降低RhoA、ROCK1 表達(dá)水平。表明針刺可能通RhoA/ROCK1 通路來改善血壓并抑制血管損傷。

綜上所述，針刺人迎穴不僅可以降低血壓，還可抑制血管損傷進(jìn)而保護靶器官，其機制可能與調(diào)節(jié)血管釋放出的相關(guān)活性因子有關(guān)，且可能通過調(diào)控RhoA/ROCK1 信號通路發(fā)揮作用。本研究從基礎(chǔ)實驗方面為針刺降壓及靶器官的保護提供了實驗證據(jù)，為高血壓病的治療提供了新的手段，可提前預(yù)防和控制由高血壓病引發(fā)的血管損傷進(jìn)而導(dǎo)致靶器官損害而引發(fā)的一系列心腦血管疾病。