俞新鵬

（沛縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇沛縣 221600）

禽流感是由正黏病毒科A 型流感病毒屬的禽流感病毒引起的禽類A 類傳染病。該病廣泛流行于世界上多個國家和地區(qū)，給養(yǎng)禽業(yè)和人類帶來巨大的威脅和經(jīng)濟損失。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA 病毒，其基因組全長13 kb，含有基因片段8 個，分別編碼HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1 和PB2 蛋白［1］，其中血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是比較重要的兩個基因節(jié)段。根據(jù)表面蛋白HA 和NA 的抗原性，可將AIV 分為18 個HA 亞型和11個NA亞型。目前我國常見的AIV主要有H9、H7、H5、H3、H10、H6 亞型等。目前，只有H5 和H7 的部分毒株是高致病性禽流感病毒，其他亞型都是低致病性禽流感病毒。H3 亞型禽流感病毒雖然致病性低，但其感染性和毒力不斷增強，危害趨于嚴(yán)重，特別是發(fā)生繼發(fā)感染或混合感染時，危害更大。研究表明，H3 亞型禽流感能跨越種間屏障，感染豬、馬、犬、貓等多種哺乳動物，具有很強的宿主適應(yīng)性［2］。近年來，我國在不同地區(qū)和宿主中多次分離到H3亞型禽流感病毒［3］。在全球大多數(shù)國家，H3 亞型流感病毒在人流感流行病學(xué)監(jiān)測中顯示為優(yōu)勢毒株［4］。因此，有必要加強H3 亞型禽流感的流行病學(xué)調(diào)查，以對該病進行有效的防控，保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)安全和人類健康。近期市場反饋，江蘇省部分地區(qū)蛋雞養(yǎng)殖場存在雞群禽流感發(fā)病與死亡情況，因此，于2023 年2 月對江蘇地區(qū)兩個疑似發(fā)生該病的蛋雞養(yǎng)殖場開展H3 亞型禽流感的流行病學(xué)調(diào)查，為掌握江蘇地區(qū)H3 亞型禽流感的發(fā)生及流行情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點選擇

從江蘇省鹽城市和南通市各選擇一個發(fā)病典型的蛋雞養(yǎng)殖場作為調(diào)查點。其中，鹽城市養(yǎng)殖品種為海蘭褐蛋雞，存欄量12 000只，蛋雞在52 日齡開始發(fā)病，表現(xiàn)為眼睛流淚、鼻孔潮濕、個別雞精神不佳、張口呼吸，夜間聽雞有呼吸道癥狀，每日死亡35只左右，日死亡率0.3%。南通養(yǎng)殖品種為羅曼灰，存欄量15 000 只，蛋雞在115 日齡開始發(fā)病，大群較正常，個別雞眼睛拉長，精神不佳，咳嗽，夜間聽雞有呼吸道癥狀，每日死亡30只左右，日死亡率0.2%。對當(dāng)日死亡的病雞進行解剖發(fā)現(xiàn)，剖檢病變主要有氣管輕微出血或有黏液，支氣管干酪樣物堵塞，肺臟淤血、水腫，心冠脂肪出血點等，初步判斷為疑似禽流感。

1.2 試驗器具

禽流感病毒H5、H7、H9、H3 血凝抑制試驗抗原，生理鹽水，5 mL 注射器，100 μL 單道移液器，100 μL 8 道移液器，一次性移液器槍頭，直徑9 cm 玻璃平皿，一次性96 孔V 型板，微量振蕩器，離心機，10 mL離心管等。

1.3 試驗方法

1.3.1 血清樣品制備 在所調(diào)查的兩個蛋雞養(yǎng)殖場分別隨機采集30份正常雞群的血液樣品。使用一次性注射器從雞翅根靜脈采血，每只雞2 mL，將血液樣品在室溫或37 ℃恒溫箱中傾斜靜置2 h 至收集血清，標(biāo)記編號，待檢。

1.3.2 血凝試驗

1）采血。使用5 mL注射器抽取1 mL濃度為3.8%的檸檬酸鈉抗凝劑，進行翅根靜脈采血。

2）紅細胞洗滌。將采集的抗凝血注射到10 mL 離心管，注入生理鹽水混勻，放入離心機內(nèi)配平，3 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，重復(fù)清洗3 次，所得紅細胞沉淀加入生理鹽水，放置冰箱內(nèi)4 ℃冷藏備用。

3）1%紅細胞懸液的配制。抽出所需生理鹽水，棄去紅細胞所占的量，即紅細胞與生理鹽水比例為1∶100，插入紅細胞底部抽取紅細胞，與生理鹽水混勻，反復(fù)吹吸混勻備用。

4）抗原的倍比稀釋。在96 孔V 型板標(biāo)記抗原檢測項目：禽流感H5、H7、H9、H3。在其第1—11 孔均加入25 μL 生理鹽水，第12孔加入50 μL 生理鹽水；對應(yīng)吸取25 μL 抗原依次加入反應(yīng)板第1列，之后用100 μL 8道移液器調(diào)至25 μL依次進行倍比稀釋，即第1列反復(fù)吹吸8 次混勻后吸取25 μL 加入第2 列，抽出25 μL 混合樣品加入第2 列中，依次稀釋至第11 列，從第11 列中吸出25 μL 混合液并棄去，即完成倍比稀釋。最后用振蕩器振蕩20 s充分混勻，在室溫25 ℃靜置20 min。

5）血凝情況分析。每孔均加入配制好的1%紅細胞懸液25 μL，振蕩混勻，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置25 min。將反應(yīng)板傾斜45°，觀察紅細胞懸液有無呈淚滴狀流淌，完全血凝（不流淌）孔對應(yīng)的抗原最高稀釋倍數(shù)代表1個血凝單位（HAU）。

表1 蛋雞血清樣本的H5、H7、H9、H3抗體滴度

1.3.3 血凝抑制試驗

1）采血及紅細胞懸液的配置。方法同1.3.2。

2）4 單位抗原的配制與校正。根據(jù)抗原稀釋倍數(shù)=血凝效價/4，前列按1∶4稀釋的孔不加抗原，即1塊96孔V型板使用4單位抗原2 mL。校正結(jié)果判定，從左到右，96 孔V 型板前3 孔為完全血凝，第4、5、6 孔完全沉淀，說明該4單位校正結(jié)果成立。

3）待檢血清的倍比稀釋。將被檢血清進行標(biāo)號，每8 個樣品為1 套，在96 孔V 型板上標(biāo)明場區(qū)和檢測項目：禽流感H5、H7、H9、H3。第1—11列的孔中加入25 μL生理鹽水，每個板第12 列作為陰性對照，加入生理鹽水50 μL。將待檢血清對應(yīng)加入每個板的第1列，每孔均加入25 μL，之后按照對抗原的倍比稀釋方法完成倍比稀釋。

4）抗原加入。向稀釋好的血清中加入配制的4單位抗原，每孔加入25 μL，最后一列作為陰性對照，不加，之后用振蕩器振蕩20 s 充分混勻，在室溫25 ℃靜置20 min。

5）血凝抑制情況分析。在96 孔V 型板中每孔加入25 μL 的1%紅細胞懸液，振蕩20 s 充分混勻，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置25 min。之后將96 孔V 型板傾斜45°，2 min內(nèi)進行觀察，紅細胞懸液凝集孔對應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的HI 抗體效價，即抗體滴度；半流的孔不作為分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，鹽城采樣點蛋雞血清樣本的H5、H7、H9 平均抗體滴度分別為6.9、7.0、7.2；南通采樣點蛋雞血清樣本的H5、H7、H9平均抗體滴度分別為9.2、9.2、9.0。二者蛋雞血清樣本的H5、H7、H9 抗體水平均較正常。而在未進行疫苗免疫的情況下，兩個采樣點蛋雞血清樣本的H3 平均抗體滴度分別為4.5、4.3，且變異系數(shù)（CV）較大，分別為39.9%、46.8%。結(jié)合對病死雞的臨床觀察及解剖結(jié)果表明，蛋雞群可能存在H3 亞型禽流感病毒感染。

3 討論

近年來，H3 亞型禽流感病毒分離率較高，致病力有增強的趨勢，危害持久，能長期存在于家禽體內(nèi)［5-7］。前人研究發(fā)現(xiàn)，AIV 與人的H3 流感病毒關(guān)系密切［8-9］。另外，H3 亞型禽流感病毒還能與H9N2、H5N1 亞型流感病毒發(fā)生基因重組，人源和禽源流感病毒還能通過豬發(fā)生基因重排［10］，導(dǎo)致AIV 致病性增強，給禽流感防控帶來更大困難。因此，對家禽AIV 進行長期的流行病學(xué)監(jiān)測，密切關(guān)注AIV 傳播、進化和變異情況，為進一步強化防控H3 亞型禽流感病毒跨種屬傳播提供充足的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

世界上有8條候鳥遷徙路線，經(jīng)過我國的主要有3 條路線，分別是西部候鳥遷徙線、中部候鳥遷徙線、東部候鳥遷徙線。此外，野鳥作為禽流感病毒的天然宿主，為流感病毒的變異提供了有利條件。2005 年，我國學(xué)者在青海湖分離到的高致病性禽流感病毒，經(jīng)證實其是由候鳥帶入我國［5］。另有研究從廣東地區(qū)健康鴨體內(nèi)分離到H3N6 病毒E9 株，懷疑其HA 和NA 基因可能由候鳥遷徙經(jīng)境外帶入我國，且可能是由國外的H3亞型AIV 與H4N6亞型AIV重組而來［6］。2023年2月，江蘇省鹽城市和南通市兩地蛋雞場雞群在育成期和開產(chǎn)前出現(xiàn)眼睛流淚、鼻孔潮濕、個別雞精神不佳、張口呼吸、咳嗽等癥狀，日死亡率為0.2%～0.3%，對其開展禽流感流行病學(xué)調(diào)查，經(jīng)臨床癥狀觀察并剖檢病變，以及血凝抑制抗體檢測等判斷，屬于H3 亞型低致病性禽流感病毒導(dǎo)致發(fā)病。原因可能與東部遷徙路線中的候鳥或與當(dāng)?shù)匾傍B攜帶病毒等有關(guān)。因此，應(yīng)做好相應(yīng)的疾病監(jiān)測與預(yù)警，開展綜合防控。

4 結(jié)論

江蘇省鹽城市和南通市兩個發(fā)病蛋雞養(yǎng)殖場正常雞群的血清學(xué)抗體檢測結(jié)果顯示，該兩個蛋雞養(yǎng)殖場正常雞群H5、H7、H9 亞型禽流感病毒的平均抗體水平較正常，鹽城市正常雞群的抗體滴度平均值分別為6.9、7.0、7.2，南通市正常雞群的抗體滴度平均值分別為9.2、9.2、9.0。在無疫苗免疫情況下，兩個蛋雞場正常雞群的H3 平均抗體滴度分別為4.5、4.3，且變異系數(shù)較大，分別為39.9%、46.8%。結(jié)合對發(fā)病雞的臨床觀察及解剖結(jié)果表明兩個蛋雞場可能存在H3 亞型禽流感野毒的感染。