陳帥康，王彩霞，施萬斌，魯海龍，董安昊，劉楚麗，馬 榮

(新疆農業(yè)大學林學與風景園林學院，新疆 烏魯木齊 830052)

野杏（Prunus armeniacaL.）是天山野果林原始植物區(qū)系組成物種之一，對維持穩(wěn)定的野果林生態(tài)系統(tǒng)起著重要作用[1]。近年來，由于人類活動、病蟲害大面積發(fā)生等原因，導致野果林受損嚴重，野杏也受害較重，未能幸免。其中，病害以真菌性穿孔病對野杏葉片和果實的為害最為嚴重。通過前期研究發(fā)現引起野杏真菌性穿孔病的病原為嗜果刀孢菌（Wilsonomyces carpophilus），屬于子囊 菌 門 （Ascomycota ） ， 座 囊 菌 綱（Dothideomycetes ） ， 格 孢 菌 亞 綱（Pleosporomycetidae ）， 格 孢 腔 菌 目（Pleosporales），科（Dothidotthiaceae），嗜果刀孢菌屬（Wilsonomyces）[2-3]，該屬僅包含嗜果刀孢菌一個種。由該菌引起的穿孔病是危害核果類果樹的一類重要病害，最早于1843 年在法國發(fā)現，隨后在美國、伊朗、澳大利亞、阿富汗、意大利、希臘、新西蘭、葡萄牙、前蘇聯、印度以及中國[4-7]等國家均有為害。中國甘肅省自上世紀九十年代記錄了由嗜果刀孢菌引起杏果斑點病的病果率高達80%[5]、桃果實褐斑病的病果率達71%[8]。2019 年，程元等調查發(fā)現新疆鞏留縣超過50%的杏樹果實受到嗜果刀孢菌的為害[9]。2020 年，葉雙華等在新疆伊犁的新源、鞏留、霍城和伊寧縣調查發(fā)現，野杏葉片和果實平均發(fā)病率達79.33%和53.17%[10]，嚴重影響杏果實的產量和品質。目前，我國的甘肅、新疆、河北、河南、安徽、江蘇、四川、吉林等省份及自治區(qū)有該菌的為害記錄[8-12]。

嗜果刀孢菌不僅分布廣，而且危害的寄主種類也較多。該菌在全球范圍內可以危害殼斗科（Fagaceae ） 櫟屬（Quercus） 的冬青櫟（Quercus ilexL.）[13]和薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）、 櫻屬（Cerasus）、 稠李屬（Padus）、 桃屬（Amygdalus）、 梨屬（Pyrus）、 花楸屬（Sorbus）、 榅桲屬（Cydonia）、蘋果屬（Malus）[4-8,12-13]等的多種植物，如：杏（Prunus armeniacaL.）、桃（Prunus persicaL.）、 李（Prunus salicinaLindl.）、桂櫻（Prunus laurocerasusL.）[14]、美洲李（Prunus americanaMarshall.）[15]、扁桃（Amygdalus communisL.）、 稠李（Padus aviumMill.）、西洋梨（Pyrus communisL.）、歐亞花楸（Sorbus aucupariaMaxim.）、榅桲（Cydonia oblongaMill.）、蘋果（Malus pumilaMill.）等[16]。嗜果刀孢菌在我國主要為害杏、桃、李、 東北杏（Prunus mandshurica(Maxim.)Koehne）、歐洲李（Prunus domesticaL.）、梅（Prunus mumeSiebold et Zucc.）和山櫻花（Cerasus serrulata(Lindl.) G.Don）等造成葉片穿孔或果實表面形成褐斑。新疆目前僅在野杏和野生櫻桃李上有嗜果刀孢菌的為害記錄[5,8-10]，但新疆多數城市綠化樹種和主要的經濟林樹種都隸屬于薔薇科[17]，嗜果刀孢菌能否對其它樹種造成危害尚不明確。因而，開展該菌的寄主范圍測定，對于由嗜果刀孢菌引起的穿孔病的風險評估和病害的預防具有重要意義。

國內外關于嗜果刀孢菌的研究主要集中在種類鑒定[5,8]、生物學性狀[18]、病理生理[19-21]及防治等[5]。對于嗜果刀孢菌引起的穿孔病的診斷主要通過傳統(tǒng)的組織分離法，基于形態(tài)學特征結合多片段分子生物學完成，費時費力、診斷效率低，建立嗜果刀孢菌的快速檢測技術對于病害的快速、準確診斷至關重要。常規(guī)PCR 技術在植物病原菌的種類鑒定及多樣性分析等方面得到廣泛應用[22-23]，但其靈敏度有限。實時熒光定量PCR 技術具有高效、高特異性、高靈敏度和定量分析等特點，在植物病原物檢測及流行學方面的研究得到了廣泛應用[24]。王瑜等基于腐皮鐮刀菌的tef1(translation elongation factor 1-alpha）基因建立了該菌的實時熒光定量PCR 快速檢測方法，提高了中藥材根腐病的檢出率[25]。謝學文等根據三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因序列設計引物，建立了茄匍柄霉菌的qRT-PCR檢測體系，能快速準確定量檢測土壤病殘體中茄匍柄霉菌的含量[26]。段維軍等基于向日葵黑莖菌及其近似種的ITS 序列差異構建了TaqMan-MGB 探針實時熒光快速檢測方法，可用于疑似攜帶向日葵黑莖菌的樣品檢測[27]。任海英等利用楊梅凋萎病原菌異色擬盤多毛孢和小孢擬盤多毛孢的ITS1-5.8S rDNA-ITS2 序列設計了特異性引物對，成功建立了楊梅凋萎病的常規(guī)PCR 檢測方法用于該病害的檢疫及防控[28]。

鑒于當前野杏嗜果刀孢穿孔病菌的潛在寄主范圍尚不明確、快速檢測技術較為缺乏，本研究擬通過離體葉片接種法測定該病菌在新疆烏魯木齊常見園林綠化植物上的致病性，并設計篩選特異性引物，建立嗜果刀孢菌的分子快速檢測技術體系，從而提高病害的診斷效率，為野杏真菌性穿孔病的早期檢測和制定科學精準的防治措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 寄主范圍的測定

通過調查和資料記載[17]篩選了6 科19 種烏魯木齊常見的園林綠化樹種作為供試植物范圍進行測定，樹種詳細信息見表1。

表1 待測寄主植物列表Table 1 List of plants used in the host range study of Wilsonomyces carpophilus

本試驗中選取菌株YA21 作為供試菌株。該菌株來源于野杏穿孔葉片的病組織，為通過單孢純化法獲取的純培養(yǎng)菌株，并基于形態(tài)學和分子生物學明確了該菌為嗜果刀孢菌（GenBank：OQ547194）。將菌株YA21 在PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃全黑暗的條件下培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣選取生長一致的直徑為5 mm 的菌餅作為接種體，備用。

本研究采用離體葉片刺傷接種法，即每個樹種選取生長一致的健康葉片10 片，無菌水沖洗后再用75%的酒精進行表面消毒，自然晾干后再用無菌的5 號昆蟲針刺穿葉片，形成大小均勻的單個傷口。然后將制備的菌餅有菌絲面朝向傷口，以接種空白PDA 培養(yǎng)基為對照，每個處理3 個重復[10,29-30]。接種的葉片葉柄處用濕潤的滅菌脫脂棉覆蓋保濕，隨后放入無菌的培養(yǎng)皿內并置于底層鋪有無菌紗布的不銹鋼托盤中。托盤中加入適量無菌水，保證濕度，托盤表面用保鮮膜封口，置于25 ℃培養(yǎng)箱中。接種48 h 后拆除接種體，于第3 d 開始每天拍照記錄病斑擴展情況，用游標卡尺采用十字交叉法測量病斑長度和寬度，并按圓的面積計算病斑面積，病斑面積=π×[（長度 + 寬度）/2]2（π 取3.14），實驗數據利用Microsoft Excel 2019 進行整理，利用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析第5 d 的病斑面積大小，比較差異顯著性。在第13 d 將發(fā)病部位通過常規(guī)組織分離法進行病原菌再分離，通過形態(tài)學結合分子方法完成種類鑒定，以確認是否為所接種的嗜果刀孢菌。

1.2 特異性引物的設計、合成及常規(guī)PCR 檢測

根據翻譯延伸因子（tef1） 基因序列（GenBank：KY905684.1）[2]，基于引物設計原則通過primer premier 5.0 軟件設計并篩選出一對引物W0404-14-F（5′-GGGCATTTTTGGATGGT GGG-3′），W0404-14-R（5′-TGCCCAAAGGGAT CATGGAC-3′），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以菌株YA21 的DNA 作為標準品，通過核酸檢測儀檢測其DNA 濃度為5.99 ×102ng·μL-1，OD260/OD280為1.88，表明模板DNA純度較好，可作為標準品用于后續(xù)PCR 擴增。

從新源縣、霍城縣和鞏留縣的野杏、野生櫻桃李和桃的芽、葉片和果實上共收集到76 株嗜果刀孢菌，從其他6 種寄主上收集到22 株其他真菌，共計98 株真菌菌株，信息見表2，所有菌株保藏在新疆農業(yè)大學林學與風景園林學院森林保護學實驗室。采用CTAB 法提取上述98 株供試菌株的DNA[31]，并用于特異性引物的檢測，以ddH2O 為空白對照（CK）進行常規(guī)PCR 擴增，檢測引物的特異性。常規(guī)PCR 擴增總體系為25 μL，包括2 ×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1.0 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。反應程序：95 ℃預變性8 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，25～30 min）檢測后，凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

表2 供試菌株及來源Table 2 The species and sources of strains in this study

1.3 實時熒光PCR 體系的建立及優(yōu)化

以表2 中供試菌株的基因組DNA 為模板，實時熒光PCR 擴增總體系為20 μL，包括2 × SYBR Abstart Master Mix 10.0 μL，模板DNA 1～3 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.3～0.5 μL，ddH2O補充至20.0 μL。反應程序：95 ℃ 2.5 min，94 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。為建立適合嗜果刀孢菌的實時熒光檢測體系，優(yōu)化模板DNA 濃度及引物濃度，設置模板DNA 用量分別為1、2、3 μL，引物用量分別為0.3、0.4、0.5 μL 進行擴增，根據熔解曲線穩(wěn)定性確定最適用量。

1.4 特異性引物的靈敏度檢測

將模板DNA 進行10 倍梯度稀釋，設置5.99 ×10-5～5.99 × 102ng·μL-1共8 個梯度，以不同濃度的DNA 為模板，利用篩選的特異性引物進行普通PCR 擴增反應，根據瓊脂糖凝膠電泳檢測有無擴增片段， 評價特異性引物W0404-14-F/W0404-14-R 對不同來源嗜果刀孢菌的敏感性。

1.5 特異性引物對自然發(fā)病樣品和室內接種樣品的檢測

于2022 年5 月，在新疆伊犁哈薩克自治州新源縣杏花溝（83°26′2.133 6″～83°26′9.812 4″ E，43°32′17.995 2″～43°32′24.918 0″ N）隨機采集自然發(fā)病且具有典型病癥的野杏穿孔病葉片和果實樣品各2 份。取100 mg 新鮮病害樣本，加入液氮充分研磨成粉末，然后轉移至1.5 mL 離心管中，使用Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程(上海)股份有限公司）提取植物基因組總DNA。產物加入Loading Buffer 混勻，經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析擴增結果。

將菌株YA21 活化培養(yǎng)后接種在健康的野杏苗木葉片上，接種方法同1.1，以接種無菌PDA作為空白對照，接種好的葉片表面覆蓋無菌脫脂棉，每隔1 h 噴施無菌水保濕，每個處理6 個重復。根據前期研究結果設置接種后7、10、13、16、19、21、24 和48 h 共計8 個時間梯度取樣，樣品檢測同1.2。

2 結果與分析

2.1 嗜果刀孢菌在不同植物離體葉片上的致病情況

結果表明：將嗜果刀孢菌通過有傷接種至19 種植物葉片上，其中新疆小葉白蠟、山桃、榆葉梅、毛櫻桃、野杏、山荊子、野生櫻桃李、秋子梨、黃太平、野蘋果、北美海棠、杜梨、垂柳、金葉榆及絲綿木共15 種寄主植物葉片出現不同程度的病斑，且病斑大小呈現顯著性差異（表3），黃果山楂、新疆楊、紫葉矮櫻、韃靼桑和對照組未表現任何癥狀。對接種發(fā)病的病組織再分離，所獲菌株與接種菌株種類一致。

表3 嗜果刀孢菌接種不同植物離體葉片5 d 后所產生的病斑面積Table 3 The area of necrotic lesions on detached leaves of different plants inoculated by Wilsonomyces carpophilus after five days

通過對發(fā)病的葉片病斑擴展情況進行統(tǒng)計分析發(fā)現，嗜果刀孢菌對新疆小葉白蠟的致病力最強，接種5 d 后平均病斑面積高達28.99 mm2；對山桃、榆葉梅、毛櫻桃致病力較強，平均病斑面積 ≥13.62 mm2；對野杏、山荊子、野生櫻桃李、秋子梨、黃太平致病力一般，平均病斑面積介于6～10 mm2；對野蘋果、北美海棠、杜梨、垂柳、金葉榆、絲綿木致病力弱，平均病斑面積≤5.06 mm2。

2.2 特異性引物的普通PCR 檢測

嗜果刀孢菌屬（Wilsonomyces）僅包含嗜果刀孢菌1 個種，將76 株（表2）來源于伊犁野果林4 種寄主植物發(fā)病葉片及果實上的嗜果刀孢菌和其它22 種病原真菌基于特異性引物W0404-14F/W0404-14R 進行普通PCR 擴增。結果表明，僅76 株嗜果刀孢菌能擴增出113 bp 的目的片段（圖1），其它22 株真菌與CK 均未擴增出條帶。

圖1 基于普通PCR 對嗜果刀孢菌特異性引物的檢測結果Fig.1 Specificity of common PCR with primers specific W0404-14F/W0404-14R for detection of Wilsonomyces carpophilus

2.3 實時熒光PCR 檢測體系的建立及優(yōu)化

利用實時熒光PCR 對嗜果刀孢菌及其它菌株進行檢測，結果表明：嗜果刀孢菌YA21 有擴增曲線，其它22 株菌株均無擴增曲線（圖2）。

圖2 基于實時熒光PCR 技術對嗜果刀孢菌特異性引物的檢測結果Fig.2 Specific primers for Wilsonomyces carpophilus based on real-time PCR

實時熒光PCR 的擴增曲線在不同的引物用量和模板DNA 用量不同時存在差異，篩選得出當模板DNA 量為2 μL、引物量為0.5 μL 時，曲線總體穩(wěn)定，多條熔解曲線峰值趨近一致（圖3～4）。從而，優(yōu)選出最佳反應體系為：反應總體積20 μL，其中2 × SYBR Abstart Master Mix 10.0 μL，模板DNA 2.0 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，ddH2O 補充至20.0 μL。

圖3 不同模板DNA 用量的熔解曲線Fig.3 Melting curves of different DNA concentrations

圖4 不同引物用量的熔解曲線Fig.4 Melting curves of different primer concentrations

2.4 特異性引物的靈敏度檢測

用特異性引物W0404-14F/W0404-14R 對稀釋后的模板DNA 進行常規(guī)PCR 擴增，結果表明，隨著模板DNA 濃度的降低，擴增出的片段條帶亮度逐漸變弱，直至濃度為5.99 × 10-2ng·μL-1時無擴增片段出現，因此常規(guī)PCR 靈敏度檢測下限為5.99 × 10-1ng·μL-1（圖5）。

圖5 不同模板DNA 濃度基于特異性引物的擴增結果Fig.5 Different template DNA concentrations were based on amplification results with specific primers

2.5 田間自然發(fā)病及人工接種樣品檢測

將田間采集的自然發(fā)病的野杏葉片和果實樣本基于特異性引物W0404-14F/W0404-14R 進行常規(guī)PCR 擴增，均能夠擴增出特異性條帶，大小為113 bp，CK 未能擴增出目標片段（圖6）。人工在健康的野杏苗木葉片上接種嗜果刀孢菌10、13、16、19、21、24 和48 h 后的樣本DNA 基于特異性引物W0404-14F/W0404-14R 進行常規(guī)PCR擴增，均擴增出113 bp 的目標片段，接種后7 h 的樣本和接種空白PDA 培養(yǎng)基的對照均未擴增出目標條帶（圖6）。

圖6 接種樣本及田間發(fā)病樣本的PCR 擴增結果Fig.6 PCR amplification results of natural samples and inoculated samples

3 討論

目前在伊犁地區(qū)野果林野杏上記載的穿孔病有細菌性穿孔病和真菌性穿孔病[32]，然而野杏的葉片和果實在兩種不同病原菌侵染后所形成的病斑相似，在田間難以根據發(fā)病癥狀確定病原菌類型，通過傳統(tǒng)的柯赫氏法則開展種類鑒定耗時較長。本研究針對嗜果刀孢菌篩選出的特異性引物能夠快速準確的從野杏的葉片、果實中檢測出該菌，能夠有效開展病害的早期診斷。與常規(guī)PCR 擴增檢測相比，實時熒光定量PCR 技術具有更高的靈敏度，且能通過標準曲線對未知模板進行定量分析，從而進一步研究病害的發(fā)展趨勢與嚴重程度。孫柄劍等人利用小麥紋枯病的實時熒光定量體系對人工接種的小麥進行檢測，發(fā)現在接種60 d 后實時熒光定量PCR 檢測結果與病情指數和接種量都呈顯著正相關[33]。張艷菊等人構建了黃瓜棒孢葉斑病菌的實時熒光定量PCR 體系，可檢測黃瓜葉片在接種棒孢葉斑病菌后葉片中的病菌動態(tài)變化，從而了解發(fā)病情況[34]。本研究中根據嗜果刀孢菌的tef1基因序列設計特異性引物，建立了嗜果刀孢菌常規(guī)PCR 與實時熒光PCR 檢測技術，靈敏度高且特異性強，常規(guī)PCR 最低可檢測出樣本中DNA 濃度5.99 × 10-1ng·μL-1的嗜果刀孢菌，但實時熒光定量PCR 技術研究尚有不足，僅能對未知樣本內病原菌的有無及類型進行檢測，后續(xù)將建立標準曲線用于嗜果刀孢菌的定量分析，為該病害的侵染程度監(jiān)測提供理論依據。

實時熒光定量PCR 技術是在常規(guī)PCR 反應體系的基礎上加入熒光染料或熒光標記探針，通過熒光信號的累積實現對PCR 過程的實時監(jiān)測。本研究首次嘗試從發(fā)病植株中檢測嗜果刀孢菌，建立了利用SYBR Green 染料法檢測嗜果刀孢菌的快速檢測體系。TaqMan 探針法特異性高且減少了背景熒光和假陽性，但針對不同的靶序列需設計合成不同的探針，成本花費高。SYBR Green 染料法可對任何DNA 雙鏈進行定量分析，相對探針法操作難度及成本更低，適合大批量樣本分析[35]。本研究中建立的常規(guī)PCR 和實時熒光PCR 檢測體系適用于發(fā)病樣本及分離純化后的嗜果刀孢菌的檢測，且具有成本低廉，檢測速度快等優(yōu)點，在生產實踐中可用于病害診斷、苗木的調運檢疫檢驗等。

嗜果刀孢菌可侵染薔薇科、殼斗科等多種植物，在我國多為害桃、杏等植物引發(fā)穿孔病，但有關其寄主范圍測定的相關報道較少，可侵染寄主的植物種類尚不明確。本研究通過離體葉片接種測定發(fā)現嗜果刀孢菌能夠侵染野蘋果、黃太平、山荊子、野杏、野生櫻桃李、北美海棠、榆葉梅、山桃、毛櫻桃、秋子梨、杜梨、垂柳、金葉榆、絲綿木和新疆小葉白蠟15 種植物，其中嗜果刀孢菌在新疆小葉白蠟和山桃上形成的病斑面積較大，而新疆小葉白蠟是新疆各地廣泛栽植的綠化樹種，潛在的致病風險較大。新疆楊和黃果山楂在接種嗜果刀孢菌后未發(fā)病，這兩種樹種也是常見的綠化樹種之一，在園林綠化植物配置時可與其它感病植物搭配，也許將有利于避免或減輕嗜果刀孢菌的發(fā)生與流行。本研究采用人工刺傷離體接種的方法對嗜果刀孢菌菌絲的致病性和寄主范圍進行測定，在48 h 左右能觀察到刺傷處有明顯病斑。本研究在PCR 檢測特異性引物試驗中，在野杏活體苗木健康葉片上有傷接種嗜果刀孢菌48 h 后葉片發(fā)病，離體葉片和健康苗木葉片在刺傷接種嗜果刀孢菌后均在48 h 左右發(fā)病，接種結果一致。不同的接種方法和接種體對嗜果刀孢菌侵染待測寄主的結果可能會產生影響，本研究僅探討了以菌餅作為接種體通過有傷接種待測寄主的結果，采用孢子懸浮液接種的方法測定嗜果刀孢菌的寄主范圍有待進一步研究。值得注意的是此結果僅為室內接種測定研究，而病害的發(fā)生在田間會受到多種因素的影響，因此本研究寄主范圍測定結果僅作為參考，為嗜果刀孢菌的寄主范圍研究提供基礎理論數據。

4 結論

本研究初步測定了嗜果刀孢菌對烏魯木齊常見綠化樹種的致病性，表明該菌對新疆主要林木具有較大的致病風險。本研究首次針對嗜果刀孢菌設計并篩選出1 對特異性強、靈敏度高的引物，能夠在自然發(fā)病樣本及室內接種樣本中成功檢測出嗜果刀孢菌，為嗜果刀孢菌引起的穿孔病的科學診斷和快速檢測提供了科學依據。