沈宇杰, 楊紅, 徐盈, 李佳, 李遠(yuǎn)鳳, 陳志浩, 陳紫均, 劉帥

1.西安醫(yī)學(xué)院,陜西西安 710021;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安 710032

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是由多種類型的基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外成分構(gòu)成的復(fù)雜環(huán)境。研究證明,TME會(huì)影響腫瘤進(jìn)展及藥物免疫治療反應(yīng)[1-2]。近幾十年來(lái),腫瘤研究主要依靠體外2D細(xì)胞培養(yǎng)及體內(nèi)異種移植,二者均具有一定的局限性[3-4]。因此,建立新的研究模型至關(guān)重要。

免疫類器官是在腫瘤類器官的基礎(chǔ)上,通過(guò)將腫瘤上皮細(xì)胞同各種基質(zhì)和免疫成分共同培養(yǎng),在保留患者腫瘤異質(zhì)性的同時(shí)保留腫瘤的TME特征[5-7]。免疫類器官作為模擬體內(nèi)免疫事件的可靠模型,可以為新的治療方法提供研究平臺(tái),并對(duì)患者樣本進(jìn)行臨床前篩查。本文對(duì)免疫類器官的培養(yǎng)方法,以及目前免疫類器官在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用做一綜述。

1 免疫類器官的不同培養(yǎng)方法

1.1 腫瘤類器官培養(yǎng)

目前腫瘤類器官培養(yǎng)的常用方法是浸沒(méi)基質(zhì)膠培養(yǎng)。首先無(wú)菌取樣獲得術(shù)中患者的腫瘤組織或腹水,經(jīng)過(guò)機(jī)械切割和消化分離出腫瘤細(xì)胞,再將腫瘤細(xì)胞置于基質(zhì)膠中培養(yǎng)?；|(zhì)膠取材于小鼠肉瘤中的基底膜基質(zhì),其主要成分包括4種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白:層粘連蛋白、IV型膠原、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖,基質(zhì)膠在22～37 ℃凝膠化,形成水凝膠,從而為上皮和內(nèi)皮層細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持[8]。培養(yǎng)基根據(jù)腫瘤的類型及培養(yǎng)條件有所不同,常用的添加劑包括Wnt3a、R-spondin 1、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑等[9],這種浸沒(méi)基質(zhì)膠培養(yǎng)的腫瘤類器官只富集上皮腫瘤細(xì)胞,不保留基質(zhì)成分。

1.2 腫瘤類器官與免疫成分聯(lián)合共培養(yǎng)

免疫類器官的培養(yǎng)需要在浸沒(méi)基質(zhì)膠培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加外源性免疫細(xì)胞來(lái)達(dá)到TME建模。①首先建立腫瘤類器官,培養(yǎng)一段時(shí)間后,將腫瘤類器官解離為單個(gè)細(xì)胞,同時(shí)向解離的腫瘤類器官中添加由外周血提取的淋巴細(xì)胞,重懸于基質(zhì)膠中再次接種。通過(guò)腫瘤類器官與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)建立的免疫類器官可以富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞[10]。Zhou等[11]通過(guò)膽管癌類器官與外周血T細(xì)胞共培養(yǎng)方案建立免疫類器官,成功在體外模擬了有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)。②另一種培養(yǎng)方式無(wú)需提前建立腫瘤類器官,只需將外源性的免疫細(xì)胞直接與腫瘤上皮細(xì)胞預(yù)混于基質(zhì)膠中進(jìn)行共培養(yǎng),同樣可以模擬免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的相互作用[12]。聯(lián)合共培養(yǎng)的方式操作簡(jiǎn)便,但是需要外源性添加免疫成分,可能會(huì)存在免疫成分類型單一,無(wú)法反映不同免疫細(xì)胞間相互作用等問(wèn)題;另外,共培養(yǎng)的培養(yǎng)條件需要根據(jù)不同腫瘤組織及添加的免疫成分進(jìn)行調(diào)整。

1.3 微流控3D培養(yǎng)

微流控3D培養(yǎng)需要使用到微流控裝置,裝置使用塑料、玻璃或聚二甲基硅氧烷等柔性聚合物材料形成灌流中空微通道,通過(guò)操控通道中的微小流體,研究人員可以控制基質(zhì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成和比例、流速等特征。微流控的核心結(jié)構(gòu)由微流體室構(gòu)成,每個(gè)微流體室包含中心凝膠區(qū)及兩側(cè)的介質(zhì)通道。具體的培養(yǎng)步驟是首先將新鮮腫瘤組織切碎消化制備成含有腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的腫瘤微球,再將腫瘤微球與膠原水凝膠混合后注入中心凝膠區(qū),從兩側(cè)的介質(zhì)通道輸入培養(yǎng)基[13]。微流控3D培養(yǎng)類器官包含自體腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞,有利于研究?jī)?nèi)源性免疫-腫瘤相互作用。此外,這種方式培養(yǎng)的類器官還可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)培養(yǎng),為細(xì)胞生長(zhǎng)提供一個(gè)活躍且穩(wěn)定的微環(huán)境,同時(shí)可以對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和生理變化進(jìn)行原位監(jiān)測(cè),更加真實(shí)地模擬TME,還原體內(nèi)腫瘤特征[14]。但是,微流控3D類器官培養(yǎng)需要特殊裝置,且模型目前僅限于研究?jī)?nèi)源性免疫-腫瘤相互作用,無(wú)法反映免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的募集[15]。

1.4 氣液界面培養(yǎng)

氣液界面(air liquid interface,ALI)培養(yǎng)是指將腫瘤組織采用物理方法切割成組織碎片,然后在包被膠原蛋白凝膠的穿透性細(xì)胞培養(yǎng)小室中進(jìn)行培養(yǎng)。凝膠的頂部暴露在空氣中,同時(shí)外皿中的培養(yǎng)基通過(guò)穿透性細(xì)胞培養(yǎng)小室擴(kuò)散到內(nèi)皿中,形成氣-液交互界面,使細(xì)胞獲得充足的氧氣供應(yīng)。該方法使腫瘤在原生狀態(tài)下生長(zhǎng),保留了具有腫瘤實(shí)質(zhì)和間質(zhì)的復(fù)雜組織學(xué)TME結(jié)構(gòu)及多種內(nèi)源性免疫細(xì)胞,包括功能性的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)[7]。由于氣液界面培養(yǎng)無(wú)需外源性添加免疫成分且不需要特殊培養(yǎng)裝置,因此實(shí)用性更高。目前ALI培養(yǎng)可以在短期內(nèi)準(zhǔn)確反應(yīng)腫瘤的特征,但是隨著時(shí)間的推移,類器官中的免疫成分會(huì)逐漸減少。研究顯示,盡管在補(bǔ)充白細(xì)胞介素-2的條件下,其中的免疫成分也無(wú)法維持超過(guò)2個(gè)月的時(shí)間[7]。

2 免疫類器官在腫瘤免疫治療中的各種應(yīng)用

2.1 免疫檢查點(diǎn)阻斷治療

免疫檢查點(diǎn)分子是一組具有抑制免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)分子,對(duì)激活免疫系統(tǒng)、維持自身耐受和防止自身免疫的發(fā)生起著重要作用。免疫檢查點(diǎn)分子無(wú)法使機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,同時(shí),在腫瘤組織中,腫瘤可以利用檢查點(diǎn)形成免疫逃逸。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICI)又稱免疫系統(tǒng)反制點(diǎn)抑制劑,作用于免疫檢查點(diǎn),用于增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答和抗免疫逃逸。

免疫類器官是對(duì)患者ICI治療效果預(yù)測(cè)的理想平臺(tái),可以幫助決策患者的治療方案。與此同時(shí),免疫類器官可以幫助開展免疫治療相關(guān)的功能測(cè)定,推動(dòng)腫瘤免疫學(xué)機(jī)制的研究及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。在腫瘤類器官與自體TIL聯(lián)合共培養(yǎng)建立的直腸癌免疫類器官中,TIL通過(guò)基質(zhì)膠向類器官遷移,提高了腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性,這表明共培養(yǎng)類器官可以用來(lái)評(píng)估TIL的細(xì)胞毒性功能[16]。Cao等[17]使用共培養(yǎng)建立的高級(jí)別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC)免疫類器官對(duì)抗靶向程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)治療的耐藥機(jī)制展開研究,發(fā)現(xiàn)間質(zhì)腫瘤浸潤(rùn)肥大細(xì)胞促進(jìn)了抗PD-1治療的耐藥性,并與HGSOC的免疫逃逸亞型有關(guān)。Jenkins團(tuán)隊(duì)[18]使用微流控3D培養(yǎng)技術(shù)分別建立了小鼠來(lái)源和患者來(lái)源的免疫類器官,不但可以預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)阻斷(immune checkpoint blockade,ICB)治療的效果,同時(shí)還捕獲了與PD-1阻斷反應(yīng)和耐藥性相關(guān)的關(guān)鍵特征。此外,ALI培養(yǎng)方法建立的人和小鼠的免疫類器官同樣可以用于預(yù)測(cè)ICB治療的效果[7]。

2.2 過(guò)繼細(xì)胞免疫治療

過(guò)繼細(xì)胞免疫治療通常是指從腫瘤患者體內(nèi)分離免疫活細(xì)胞,在體外進(jìn)行擴(kuò)增和功能鑒定,然后向患者回輸。如利用基因工程,將T細(xì)胞與腫瘤嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)結(jié)合,經(jīng)過(guò)改造的嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)可以識(shí)別腫瘤抗原,從而達(dá)到直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[19]。CAR-T療法在血液系統(tǒng)腫瘤中顯示出強(qiáng)大的治療效果,但對(duì)于實(shí)體腫瘤的療效一直難以捉摸[20]。Schnalzger團(tuán)隊(duì)[21]成功模擬了嵌合抗原受體自然殺傷細(xì)胞92(chimeric antigen receptor-engineered natural killer-92 cells,CAR-NK-92)靶向腫瘤抗原EGF受體變異體III(EGF receptor variant III,EGFRvIII)和卷曲蛋白受體(frizzled,FZD)對(duì)結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)免疫類器官的腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性。Zou等[22]構(gòu)建了T細(xì)胞與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共培養(yǎng)的肝細(xì)胞癌免疫類器官,并發(fā)現(xiàn)CD39+的HBVs-CAR-T細(xì)胞可以誘導(dǎo)類器官的凋亡。共培養(yǎng)免疫類器官在建立時(shí)具有高選擇性,可作為開展CAR介導(dǎo)的免疫治療研究的良好平臺(tái)。

2.3 溶瘤病毒療法

溶瘤病毒是一類能選擇性感染和殺傷腫瘤細(xì)胞的病毒,可以保留非腫瘤性宿主細(xì)胞,直接溶解腫瘤細(xì)胞并將病毒傳播到附近細(xì)胞,同時(shí)觸發(fā)細(xì)胞因子的釋放和免疫系統(tǒng)的激活,刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)[23]。Raimondi等[24]建立了正常胰腺類器官與胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)腫瘤類器官,測(cè)試了類器官作為溶瘤腺病毒治療篩選平臺(tái)的可行性,結(jié)果顯示溶瘤腺病毒具有良好的選擇性,僅在PDAC類器官中復(fù)制;該研究還顯示了溶瘤腺病毒的細(xì)胞毒性及與標(biāo)準(zhǔn)化療協(xié)同作用的個(gè)體差異性,表明類器官可以作為溶瘤病毒治療臨床前反應(yīng)的合適模型。此外,在一項(xiàng)基于乳腺癌(breast cancer,BC)類器官的研究中,研究者測(cè)試了麻疹疫苗病毒和痘苗病毒對(duì)于BC溶瘤治療的效果,結(jié)果提示所有溶瘤病毒均顯著抑制了BC類器官的存活[25]。借助類器官平臺(tái)可以幫助測(cè)試和設(shè)計(jì)溶瘤病毒治療方案,但目前基于溶瘤病毒研究所使用的是腫瘤類器官平臺(tái);腫瘤類器官在溶瘤病毒的傳染性和細(xì)胞毒性方面均顯示了良好的潛力,但尚缺乏溶瘤病毒引發(fā)免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究,免疫類器官的應(yīng)用也許可以為溶瘤病毒療法帶來(lái)新的希望。

2.4 聯(lián)合治療

免疫治療逐漸開始聚焦于探索免疫聯(lián)合療法,比如利用多個(gè)免疫檢查點(diǎn)和免疫抑制細(xì)胞群聯(lián)合療法、免疫治療與放化療聯(lián)合治療及ICI與分子靶向聯(lián)合治療等[26-28]。免疫類器官作為體外優(yōu)勢(shì)模型,在精確捕獲腫瘤異質(zhì)性的同時(shí)高度模擬TME,可以較為真實(shí)地反映患者體內(nèi)的病理生理變化,為聯(lián)合治療的探索和療效評(píng)估提供了有力平臺(tái)。Jenkins等[18]利用微流控3D培養(yǎng)建立免疫類器官,發(fā)現(xiàn)TANK結(jié)合激酶1/kappa B抑制因子激酶ε抑制劑可以通過(guò)靶向抑制細(xì)胞因子信號(hào)通路,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)PD-1阻斷劑的反應(yīng);這種聯(lián)合治療模式可能為克服PD-1阻斷劑耐藥提供一種新的解決方案[18]。Usui等[29]利用ALI法建立了包含腫瘤干細(xì)胞的CRC免疫類器官,通過(guò)使用刺猬信號(hào)通路抑制劑抑制干細(xì)胞標(biāo)記物c-Myc、CD44和Nanog的表達(dá),可以逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)5-氟尿嘧啶和伊立替康的耐藥性,抑制類器官的生長(zhǎng)。免疫類器官可以提供一種操作性和準(zhǔn)確性極高的平臺(tái),以開發(fā)新的聯(lián)合治療組合,推動(dòng)臨床轉(zhuǎn)化,最終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化免疫治療。

3 結(jié)論與展望

在合適培養(yǎng)條件下,免疫類器官模擬的TME也許能做到包含完整的免疫細(xì)胞類型,接近真實(shí)地反映體內(nèi)腫瘤上皮細(xì)胞-免疫細(xì)胞間的相互作用,從而評(píng)估免疫治療反應(yīng)。但是免疫類器官中的TME成分會(huì)隨著時(shí)間部分丟失,如何使免疫細(xì)胞長(zhǎng)期維持是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。除此之外,免疫類器官的培養(yǎng)成功率主要取決于腫瘤類型和取材部位,在某些情況下,還會(huì)受到建立時(shí)間的影響[30],為了使免疫類器官成為有效的臨床前決策工具,控制類器官的建立時(shí)間至關(guān)重要。

免疫類器官在模擬免疫治療效果、研究耐藥機(jī)制及開發(fā)新的聯(lián)合治療方案方面具有巨大潛力,相信隨著培養(yǎng)方案的不斷優(yōu)化,免疫類器官可以推動(dòng)腫瘤免疫治療的臨床轉(zhuǎn)化,最終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化免疫治療。